Лечение рака и онкологии с помощью болиголова

Фитотерапия сегодня — успешная альтернатива традиционной медицине. Так, Болиголов лечит рак и рекомендуется в лечении различных видов злокачественных опухолей благодаря уникальному составу растения.

Лечебные свойства болиголова при онкологии

Трава болиголова при онкологии помогает пациентам снизить тяжесть симптомов болезни, в первую очередь, болевой синдром. Растение оказывает успокаивающее и расслабляющее действие, способствует устранению спазмов и стимуляции защитных сил организма.

Лечение настойкой болиголова против рака возможно за счет наличия в составе:

• алкалоидов и флавоноидов;
• эфирных масел;
• витаминов, А и С;
• каротина, аскорбиновой кислоты;
• дубильных веществ.

Использование настойки болиголова от рака способствует проникновению активного вещества кониина и образованию особых антител, которые способны убивать раковые клетки. Наиболее активно они действуют на клетки, образующиеся при лейкозах и метастазах.

Купить болиголов (трава) на нашем сайте

Как пить траву болиголова при онкологии

Чтобы лечение было эффективным и безопасным, рассмотрим, как принимать траву болиголова при раке. Существуют различные схемы болиголова при онкологии, которые нужно соблюдать. Наиболее распространенным является применение в виде спиртовой настойки. Точную дозировку, время приема рассчитывает лечащий врач.

Для приготовления настойки болиголова при раке нужно залить траву растения литром спирта и настаивать ее в течение трех недель. Для того, чтобы достичь действенных результатов, применение болиголова при раке дополняется соблюдением специальной диеты, исключением алкоголя и курения.

Применение настойки болиголова при онкологии

Рассмотрим, как пить настойку болиголова при онкологии. Как уже упоминалось, траву растения настаивают на спирте до трех недель, но при необходимости прием лекарства можно начать раньше, спустя 3–4 дня настаивания. Возможно применение при онкологии не только травы болиголова, но и семян растения, которые также настаивают на спирте в течение 15–20 дней.

Совет! Любая схема приема начинается с минимального количества (одной капли) и предусматривает постепенное увеличение дозировки.

Лечение болиголовом рака легких

Растение активно используется при онкологии легких как одно из эффективных народных средств. Настойка болиголова от рака легких предусматривает методику постепенного увеличения дозировки, начиная с одной капли, разведенной в 100 мл теплой воды.

Важно! Лечебные свойства болиголова при онкологии легких проявляются даже на четвертой стадии заболевания.

Лечение болиголовом рака 4 стадии

На этом этапе главная задача — это снять болевой синдром и максимально продлить жизнь больному. Применение настойки болиголова от рака 4 стадии предусматривает увеличение дозировки, чтобы организм выделял больше антител, способных бороться с раковыми клетками.

Курс лечения такой методикой составляет 60–80 дней.

Лечение болиголовом рака желудка

Для лечения злокачественных опухолей желудка применяют спиртовой настой болиголова с добавлением мухомора. В этом случае используются молодые побеги растения. При таком лечении замедляется рост патогенных клеток, стимулируется рост и укрепление здоровых.

Помните, как пить настойку болиголова от рака желудка и ее точную дозировку, рассчитывает врач!

Лечение болиголовом рака простаты

Болиголов успешно используется против рака простаты. Применение настойки растения позволяет устранить боль и тянущие ощущения в промежности, нормализовать мочеиспускание, замедлить рост раковых клеток у мужчин.

Лечение болиголовом рака молочной железы

При локализации злокачественной опухоли в молочной железе принимают настойку растения по обычной схеме, но с постепенным увеличением дозировки.

Применение настойки болиголова от рака молочной железы требует соблюдение мер предосторожности, нельзя превышать назначенную врачом дозировку, при комплексе с другими лекарствами следует узнать совместимость их свойств.

Лечение болиголовом рака поджелудочной железы

Применение болиголова при раке поджелудочной железы позволяет снизить последствия интоксикации организма, улучшить процесс пищеварения, устранить боль, тошноту и рвоту, нормализовать мочеиспускание и дефекацию.

Применение болиголова для профилактики рака

Растения с целебными свойствами эффективны на этапе профилактики заболевания. Как пить болиголов для профилактики рака? Одну каплю настойки разбавляют водой и принимают натощак один раз в день, постепенно увеличивая дозу до 15, затем снижают дозу до одной капли. При появлении тошноты и головокружения прием нужно прекратить.

В магазине лечебных растений «ФитоКонтинент» всегда можно купить болиголов от рака и начать своевременное лечение или профилактику появления злокачественных опухолей различных систем организма. Оформляйте заказ на нашем сайте!

Купить болиголов (трава) на нашем сайте

Отзыв

Анисимов Евгений, 38 лет

Это история не про меня, а про мою бабулю. Ей в 82 года диагностировали рак желудка. Сначала были множественные обследования, химия, но прогресса не было. Бабушку просто отправили домой умирать. За это время она очень похудела, почти не двигалась. У нас уже опустились руки, стали готовиться к худшему. Кроме моей мамы. Она вычитала, что нужно принимать настойку болиголова. Но мы не стали покупать, а сделали сами. И давали начиная с 1 капли и увеличивая до 15, потом назад, при этом растворяли в большом количестве воды. В итоге где-то через месяц началась динамика, бабушка стала вставать, кушать немного. Прожила с нами еще целых 4 года!

Лечение рака болиголовом по методу Тищенко В.В

Метод Тищенко В.В.

Собрать свежие соцветия болиголова (время цветения — начало июля), слегка измельчить их ножницами, поместить в посуду, наполнив ее доверху. Также доверху залить водку. (Объем посуды не имеет значения). Герметично закрыв посуду, поместить в темное прохладное место (холодильник) на 18 дней. Через этот срок вытяжка готова к употреблению.

 

В качестве сырья можно использовать также и молодые побеги болиголова, причем, это лучшее из всех видов сырья. Оно не оказывает раздражающего и подавляющего воздействия на организм, более того, это сильное обезболивающее средство при раке, и это думаю, очень эффективное сырье, поскольку оно самое раннее. Собрать молодые побеги, наполнить 1/3 посуды измельченным сырьем (мелко нашинковать). Залить доверху водкой, а лучше всего 50-60 градусным спиртовым раствором, закрыть и поставить на 18 дней в темное прохладное место. Настойку необходимо периодически взбалтывать. Однако в экстренных случаях можно начинать прием на третий день. В данном случае используется «царская» методика циклования.

О реальном случае излечения рака настойкой Болиголова из моей личной практики, Вы можете почитать здесь ? Лечение РАКА — Болиголов

? ? Вы можете написать сообщение автору статьи — Болиголов лечение рака, в Контакты или

отправить письмо автору на почтовый ящик: [email protected] 

Меня зовут Ольга. Я фито терапевт. Раньше я жила и училась в Алтайском крае, г.Барнаул. Занимаюсь проблемой онкологии более 9 лет. Накопила огромный багаж знаний в этой области и могу помочь Вам разобраться в тонкостях лечения рака болиголовом и другими растительными настойками.

У Вас возникли вопросы? Вы всегда можете написать мне лично, на мой эл.ящик. Ни одно письмо не остаётся без ответа. Отвечать стараюсь сразу, в течение 24 часов.

(Если Вы написали письмо на почтовый ящик [email protected] и в течение суток не дождались ответа, ПЕРЕЗВОНИТЕ мне! Возможно Ваше письмо случайно попало в папку СПАМ или потерялось. Такое бывает.)

Мои телефоны: 8-962-890-36-52 Билайн , 8-989-750-01-99 МТС

Способ применения по Тищенко В.В. :

Утром натощак за час до еды на полстакана воды — одну каплю настоя. Завтра в это же время — две капли, и так, ежедневно наращивая дозу до сорока капель. Затем так же постепенно , ежедневно снижая по одной капле, возвращаться к одной капле.

Так необходимо повторить 2 — 3 раза. Примерно в этот срок опухоль полностью исчезает и оживленный организм набирает достаточный иммунный потенциал, чтоб контролировать положение дел в дальнейшем.

Это очень эффективная методика. Есть случаи , когда от рака избавлялись вконец безнадежные люди — рак молочной железы, рак пищевода, рак желудка, рак печени, и вообще рак в крайне тяжелых формах подавляется болиголовом этой методикой.

Если к началу лечения мы имеем до конца посаженную иммунную систему (например химией или лучевой терапией) и, будучи обреченными, имели под своей рукой только настойку, возлагая на нее свои слабые надежды, то, начиная второй цикл, мы имеем заметные положительные сдвиги в сторону выздоровления, приличный иммунный потенциал (болиголов качественно улучшает иммунную систему) и опять ту же настойку болиголова. Но самое главное, что мы обрели к этому времени — это уверенность в избранном препарате, и хорошее настроение.

И это проверено на деле . Только точное соблюдение методики поможет вам обрести здоровье! Передозировки недопустимы!

Более подробный рецепт приготовления настойки Болиголова с пошаговыми фотографиями, Вы можете посмотреть здесь ? Как приготовить настойку Болиголова для лечения рака.

Что делать, если болиголов уже отцвел? В этом случае можно использовать молодые листочки возле корней, а позже пойдут семена — они тоже хорошо работают. Другое дело — количественное соотношение (об этом скажу ниже) — его нельзя сильно мельчить. Скажем, пропускать через мясорубку и прочие подобные механизмы. Сырьё срывают,  мельчат  (я рву листья руками, отрывай куски примерно по 2 см.), закладываю в поллитровую банку относительно свободно, не спрессовывая, сразу заливаю водкой, после перекладываю в другую посуду (трехлитровую банку), в которой он будет настаиваться.  Затем готовлю следующую поллитровую банку. (подробный рецепт с пошаговым фото размещу на днях), на выходных ездила в лес и готовила свежую порцию настойки). Свежий болиголов «горит», то есть, собранный в свежем виде в бутыль или пакет, он начинает самонагреваться, что не идет сырью на пользу — практически, оно теряет свои свойства.

Нельзя набирать мелко измельченного болиголова чрезмерно много, тогда оно прокисает. И в водке всегда надо соблюсти пропорцию: треть посуды — измельченное сырье, а остальное (доверху) — водка.

По материалам: Валерий Тищенко «Растения против рака»

Ещё статьи по теме лечения рака:

Победим рак вместе — Болиголов
Рецепт приготовления настойки Болиголова
Система лечения рака болиголовом по методу Тищенко В.В
Как правильно проводить лечение рака ядами Болиголова и Аконита Джунгарского

< Предыдущая		Следующая >

Рак не верит в чудеса

Уже полтора года мир высоких технологий скорбит по безвременно ушедшему Стиву Джобсу, основателю Apple, а врачи сокрушаются из–за его великого заблуждения. Ведь Джобс, увы, самый знаменитый онкологический «отказник»: до последнего избегал специализированного лечения, свято веря в диету и магию Тибета. Спустя год он все–таки попал к медикам, прошел весь положенный курс, массу операций и даже пересадку печени, но было уже поздно. Впрочем, не он первый и не он, к сожалению, последний. Полвека назад от помощи онкологов отказывался каждый четвертый (!) больной, но тогда это худо–бедно имело под собой основание: было мало действенных лекарств, слишком зла лучевая терапия и высока послеоперационная летальность. Но сегодня совсем иная ситуация. Медицина создает уже таргетные препараты и фактически гарантирует успех, если опухоль нашли на ранней стадии! Тем не менее до недавнего времени от лечения у нас отказывалось ежегодно до тысячи онкопациентов, в прошлом году — 857. И что самое обидное и ужасное, у более чем 600 из них болезнь еще не зашла далеко, еще все было возможно… По статистике, из каждых 100 вновь выявленных больных 4 «отказника». Что же происходит? Люди не верят врачам? Недорабатывают психологи при онкодиспансерах? Делают свое черное дело разнообразные шарлатаны, которые кормят отчаявшегося человека обещаниями исцеления? Корреспонденты «СБ» решили в этом разобраться, переступив порог «раковых корпусов».

Не навреди себе сам

«Я ознакомлен со своим диагнозом и осознаю последствия отказа». Примерно под такими строками ставят свою подпись раковые больные, которым еще можно помочь, — как правило, речь о самых ранних стадиях болезни. Почему же они одним росчерком пера обрекают себя на верную смерть? Обычно отвечают: «Не хочу травиться химией!» И вверяют свою судьбу в цепкие руки всякого рода целителей. Еще в 1990–е шарлатанская литература по самолечению хлынула в Беларусь. Лечение онкологии маслом и спиртом по системе Шевченко, керосином, сурьмой, чагой, препаратом из печени акулы… Сегодня выбор околонаучных рецептов и литературы, обещающей вылечить болезнь даже силой мысли, тем более широк. И если раньше находились лекари, которые вывешивали вокруг НИИ онкологии объявления типа «Вылечу рак за два месяца», то сейчас на автобусной остановке в Боровлянах множатся бумажки с номером телефона и предложением продать «настойки веселки, болиголова и другие сборы трав, комплексные мази». Все это подается как панацея от онкологии. Уничтожают «рекламки», но они появляются снова.

Без царя в голове

…Набираю номер. Дедушка по ту сторону провода, который, с его слов, 40 лет посвятил народной медицине, с ходу обрушивает на меня несвязный поток обличений медиков и «их химиотерапии». Дескать, «облучение вызывает рост клеток, которые потом разносятся по организму», «врачи дают его в запредельных нормах, и оно разрушает печень и почки». Сам целитель рак рекомендует лечить только болиголовом и только «по методу Тищенко». Дескать, «это работало еще при царе». Причем важная оговорка: поможет он лишь тем больным, кто не проходил курса химиотерапии!

— У человека в организме находится определенное количество ядов. После химиотерапии оно повышается, — вещает дедушка. — Пациент купит у меня этот яд, и после 7 капель ему станет плохо — передозировка.

Пол–литра яда стоит 270 тысяч, этого хватит на полный 8–месячный курс: от 1 до 13 капель на 100 граммов воды каждый день до завтрака.

— А таблетки?

— Никаких таблеток! — разнервничался травник. — Только народное лечение! Рак — это такая болезнь, где поможет лишь народная медицина. Да благодаря болиголову женщины даже беременели!

Гарантий на излечение дедушка, конечно, не дает: «Ну, вы сами понимаете, тут дело такое…» Правда, утверждает, что 70 процентов раковых больных, принимавших болиголов по его методе, полностью выздоравливали. Впрочем, травнику быстро надоедает отвечать на вопросы, и он еще пытается втюхать мне за 50 тысяч книжку некоего Воланда: «200 процентов лучше всех ваших профессоров! Когда почитаешь, все поймешь и сама придешь. Все приходят».

В дебрях заблуждений

По словам главврача Минского городского клинического онкологического диспансера Владимира Караника, за год у них прекратили лечение 115 человек, у 15 из них болезнь была на 1–й стадии. Кстати, надо учитывать, что многие впоследствии сами возвращаются. Иногда слишком поздно…

Большая часть делала ставку как раз на народные рецепты. Почему? «Наши граждане по–прежнему очень мало знают о раке, — считает Владимир Степанович. — Рак кажется им сродни проказе, от которой либо вообще нельзя вылечиться, либо исключительно настойками и припарками. Многие долгое время скрывают свою болезнь от окружающих. И если умирают, то со стороны выглядит, словно человек сгорел за несколько месяцев. Если же благодаря медицине он излечивается, то вокруг никто так и не узнает о том, что у него были проблемы со здоровьем». Попадаются фаталисты: мол, будь что будет! Ситуацию усугубляют родственники, которые настраивают против лечения. Один пенсионер как–то заявил: «Все, бросаю, жена против, считает, что операции не переживу…» Кстати, популярный предрассудок: операция вредна, потому что раковые клетки соприкасаются с воздухом и… множатся. Врачи, хоть и делают поправку на то, что умирающий готов ухватиться за любую соломинку, только диву даются.

— Как только взрослый разумный человек может в неимоверных количествах пить веселку, чистотел или заваривать мухомор? Случалось нам откачивать пациентов после того, как они «полечились» сурьмой. Некоторых спасти, увы, не удалось. Достоверно известно одно: сами по себе народные средства от рака не спасают! — уверен Владимир Степанович. — Чтобы химиопрепарат вошел в медицинскую практику, он проходит 3 фазы клинических испытаний. Исследования идут по всему миру, многократно проверяются независимыми лабораториями. Но ни один из народных рецептов наука не подтвердила! Сейчас онкология в поисках веществ, которые способны бороться с раковыми клетками. И многие фармкомпании негласно отслеживают альтернативные способы «лечения». Поверьте, если бы в них было хоть какое–то рациональное зерно, его тут же взяли бы на вооружение для научных исследований. Да, одно действующее вещество нашли в чистотеле. Но оно дает кое–какой эффект только у пациенток, которые страдают раком молочной железы, но им химиотерапия противопоказана. Кстати, многие лекарства, которые сегодня мы назначаем больным, имеют растительное происхождение.

Любопытно, что в свое время в НИИ онкологии существовала целая папочка, в которую врачи педантично собирали все народные рецепты от рака. И даже проводили исследования: какой эффект? Пробовали на себе, мышах. Ничего не нашли. И поняли: народ генерирует рецепты с такой бешеной скоростью, что никаких подопытных животных не хватит, чтобы расставить точки над «i». Кстати, о болиголове. Как–то онкологов поставил в тупик случай: успешно прооперированная пациентка скончалась из–за поражения почек и печени. Что оказалось? Потихоньку принимала настойку болиголова, которую ей передавали заботливые родственники. Еще одна трагическая история. С 1–й стадией рака груди девушка предпочла лечиться не у врачей, которые в этом случае дают 97–процентную гарантию, что болезнь отступит и уже не вернется, а у некоей бабушки. И упорно делала компрессы из грязи, которую целительница доставала из собственного колодца. В конце концов, девушка вернулась в больницу уже с 4–й стадией рака и без единого шанса…

Почему люди верят в «чудесное исцеление»? Есть, скажем, такой момент. По словам Владимира Караника, эффект химио– и лучевой терапии проявляется только 2 — 3 недели спустя, о конечном же результате можно говорить лишь по окончании двух курсов. Поэтому сразу после лечения внешне опухоль выглядит такой же. Пациент возвращается домой, попадает в руки целителя, который потчует его различными травками. И опухоль уменьшается на глазах. И кто человеку объяснит, что это сказывается эффект терапии, а не дедушкин рецепт? А вот при раке кишечника у пожилых старше 75 лет наблюдается такая закономерность: около 15 процентов из них живут как минимум 5 лет, даже когда врачи посчитали, что высок риск умереть от осложнений терапии, и отказали в специальном лечении. Если человек просто живет, окружающие говорят: ему повезло. Если же пьет какую–то настойку, злорадствуют: «Вот что значит народная медицина! А врачи–то на него рукой махнули…» Между тем, как ни странно, больше всего шансов именно у пациентов в годах. У них в организме все процессы замедляются, в том числе и онкологические. Недавно из Минского онкодиспансера после удачной операции выписалась пациентка 88 лет. И столь почтенный возраст — еще не предел. В свое время онкологи помогли и дедушке 92 лет, и 102–летней бабушке!

***

Конечно, если человек собирается поставить свою подпись в бланке отказа, с ним работают психологи, пытаются выяснить причину. Здесь главное понять — сказался страх, недостаток информации или человек просто фаталист? Если известна причина, понятна и дальнейшая цепочка действий. В ход идут разные аргументы. «Отказнику» даже могут показать выздоравливающих после удачной операции пациентов…

Но у больного всегда остается этот соблазн — альтернативные методы. Целители, знахарки, шептуньи. В интернет–магазинах продаются сотни книг о раке, из них 60 — 70 процентов именно на тему «как обойтись без онколога». Стоит ли вводить цензуру на «оздоровительную макулатуру»? Владимир Караник не видит смысла: в таком случае альтернативные книжки начнут распространять подпольно. Зато хорошо бы на всех этих брошюрах по аналогии с надписями на пачках сигарет «Курение убивает» большими буквами написать: «Не подтверждено клиническими исследованиями». Может, хоть это заставило бы одуматься.

Елена АНИСКИНА, «СБ».

Комментарий

Евгений Шмерко, врач–фитотерапевт:

— Я категорически против самолечения. Искренне жаль людей, попавших в руки «специалистов», которые методом тыка назначают им ядовитые травы. Фитотерапия — сложная и обширная наука. Вообще, каждую историю болезни нужно рассматривать индивидуально: узнать наследственность человека, состояние его иммунитета, образ жизни, пищевые привычки. Только после того как вырисуется полная картина, можно назначать противоонкологические сборы. Но нужно отдавать себе отчет в том, что все должно сочетаться с образом жизни, питанием и рекомендациями врачей–онкологов. Мне кажется, что каждый врач должен обладать познаниями в фитотерапии, тогда, может, люди и не прибегали бы к услугам различных шарлатанов.

Довелось недавно быть свидетелем странного диалога в ветеринарной аптеке Гомеля. Покупательница попросила один антисептик–стимулятор. Знаю, берут такой препарат для профилактики и лечения болезней у домашних животных и собак. Покрутив бутылочку в руках, женщина переспросила у продавца:

— А как его человеку пить? Есть дозировка?

Барышня в белом халатике растерялась:

— Да вы что? Это же для животных!

Покупательница, извиняясь, попятилась к выходу: мол, знакомая попросила купить для профилактики онкологии. Вычитала в газете, что хорошо чистит организм от всякой заразы…

О стихийной «альтернативе» говорим с главным онкологом Гомельской области Татьяной Пригожей. К слову, в регионе начал снижаться процент выявления первичных онкозаболеваний: минус 6 по сравнению с прошлым годом. Зато больше стало пациентов, у которых рак обнаружили на самых ранних стадиях. И есть такие, которые отказываются от помощи официальной медицины?

— У нас подобные случаи редки. Чаще всего это пожилые люди, старше 75 лет. Объясняют возрастом, страхом перед операцией. С каждым работают врач, психолог, консилиум. Объясняются тактика лечения, правила поведения…

Конечно, нужно понимать, рак — это прежде всего колоссальный стресс. А рядом еще родные и близкие, которые тоже хотят помочь. Народная молва. Интернет. В итоге, кажется, все средства хороши. Татьяна Пригожая припоминает «панацеи», о которых доводилось слышать в разные времена:

— В конце 90–х на пике спроса была вытяжка из черноморской акулы. Возили термосами. Думаю, кто–то неплохо тогда на этом заработал. Потом питерский метод лечения ртутью. Сейчас керосин, болиголов… Одно скажу: за мою практику не было случая, когда бы эти средства поставили больного на ноги.

Виолетта ДРАЛЮК, «СБ».

В минувшем году в Витебском областном клиническом онкологическом диспансере от лечения отказались 119 пациентов. У подавляющего большинства — 1–я и 2–я стадии заболевания. Со всеми беседовали лечащий врач, заведующий отделением, психотерапевт. Всем объяснили, что на 1–й стадии болезнь отступает, но если ее запустить — медицина окажется бессильна. И все равно люди написали отказы. Почему? У главврача диспансера Анжелики Томчиной на этот счет такое мнение:

— Три четверти из отказавшихся — люди пожилые. Многие рассуждают так. Мне за 70. Ничего не болит. При 1–й стадии ярко выраженных симптомов действительно нет. Зачем усложнять жизнь агрессивным лечением, химиотерапией, лучевой терапией? К чему радикальные операции? Пусть я проживу столько, сколько отмерено.

На второе место Анжелика Валерьевна поставила бы… пьянство. Жуткие картинки после командировки по Полоцкому району, куда она ездила уговаривать «отказников» изменить свое решение, до сих пор стоят у нее перед глазами. Вот типичный случай. Деревня. 40–летняя пациентка. Полдень, а она уже подшофе. Искренне удивляется, почему доктор пожаловала в гости… без бутылки. У нее 1–я стадия. Вылечить — реально. Но до собственного здоровья хозяйке дела нет. Как и до собственных детей, которые крутятся под ногами грязные и полуголодные. Как уговорить лечиться такого человека?

Некоторые отказываются по религиозным соображениям. Мол, община, в которой я состою, запрещает врачебное вмешательство. Кое–кто идет к знахарям. Но такие случаи в Витебском областном клиническом онкологическом диспансере скорее единичны. Хотя, уточняет Анжелика Томчина, подписывая отказ, пациенты ведь не ставят медиков в известность, что идут лечиться к каким–нибудь ведунам:

— Знаю, что одна мама 21–летнюю дочку с лимфогранулематозом возила в Украину к какой–то бабке. Заплатила 5 тысяч долларов. Как мы ее ни уговаривали не отказываться от лечения, не послушала. Потом девушка, к сожалению, погибла очень быстро.

Иногда «отказники» приходят обратно. Обычно когда у них что–то начинает болеть. Теперь–то уж готовы лечиться. Но когда драгоценное время упущено, медицина ничего гарантировать не может.

Сергей ГОЛЕСНИК, «СБ».

Цифра «СБ»

В 2012 году в Витебском областном клиническом онкологическом диспансере пролечено почти 12 тысяч пациентов. В общем количестве выявленных заболеваний отказы от лечения составили 2,1 процента.

…Интеллигентный мужчина, который годами жил по системе Порфирия Иванова, не пил, не курил, питался правильно, вдруг занемог. Медики из районной поликлиники диагностировали язву желудка. И тогда профилактики ради он решил испробовать еще один чудодейственный метод. Реклама якобы российского доктора наук гарантировала исцеление от всего на свете. Всего–то и надо — пить трехпроцентную перекись водорода. Сперва — по одной капле, затем — по две. Дескать, эта самая перекись активизирует химические элементы, а свободные радикалы вступают в борьбу с «взбесившимися» клетками. Не прошло и месяца, как мужчине поставили совсем другой диагноз: рак желудка четвертой степени. Спасти его не смогли — не операбелен. Это реальная история из жизни. И таких, увы, немало.

Пару лет назад серый забор на входе в Могилевский областной онкодиспансер был буквально увешан объявлениями «спасу от рака!». Медики объясняли пациентам: не стоит верить шарлатанам, которые стремятся нажиться на чужом горе. Но желающих все равно хватало. Есть они и сегодня. Главврач областного онкодиспансера Антон Лысов с горечью констатирует:

— Не найдут объявление на заборе — отыщут в интернете. Самолечением ведь занимаются не только темные деревенские бабушки, но и горожане — солидные люди, с высшим образованием. Помню одного такого. Молодой мужчина, сорока лет не исполнилось, а уже рак желудка. Первая стадия, поддается лечению. А он заявил: в клинику не лягу, уже с целителем договорился, еду под Харьков. К нам он вернулся где–то через полгода. Назначать химиотерапию было поздно. Четвертая стадия…

По словам Антона Ивановича, нынче в онкодиспансере на учете около 28 тысяч онкобольных, только в прошлом году выявили 4,5 тысячи новых. Увы, из них у более 15 процентов уже 3 — 4–я стадии.

— Многие диагноз воспринимают как приговор. Опускают руки, не хотят ложиться в больницу, предпочитают лечиться народными средствами. В прошлом году 49 пациентов отказались от лечения. У 32 из них был рак 1 — 2–й стадии. Уговариваем, объясняем: керосин, якобы улучшающий обмен веществ и питание тканей, вас, скорее, добьет, чем вылечит. Но нас слушают и не слышат…

В онкодиспансере, проанализировав статистику, решили: надо настраивать пациентов на лечение. И еще активнее искать к каждому индивидуальный подход. Чтобы убедить больного, если нужно даже соберут консилиум во главе с главврачом.

Фото автора.

Настойка «Болиголова» 50 мл. — Сертифицировано.

Настойка Болиголова — Сертифицировано.

 Настойка Болиголова известен своим сильным воздействием на новообразования (доброкачественные и злокачественные опухоли). Обладает рассасывающим действием, является сильнейшим иммуномодулятором и эффективным обезболивающим средством, оказывает спазмолитический, антисептический и кровоочищающий эффект. Способен помочь справиться с онкологией в тяжёлых стадиях, при строгом соблюдении курса и дозировки препарата. Болиголов применяется и для профилактики заболеваний.

По всем интересующим Вас вопросам обращайтесь к нашим менеджерам. Вы можете присылать Ваши выписки и результаты исследований на адрес [email protected] и наши специалисты консультационного центра дадут рекомендации по подбору курса оздоровления.

Болиголов применяется при заболеваниях:

эндометриоз, мастопатия, миома, фиброма, киста мочевого пузыря, аденома предстательной железы, рак легких, желудка, щитовидной железы, двенадцатиперстной кишки и молочных желез (в онкологии при злокачественных новообразованиях и метастазах), гипертония, мигрень, полиартриты и артриты, красная волчанка, варикозное расширение вен, тромбофлебит.

 

ВАЖНО!

При приеме Болиголова алкоголь ИСКЛЮЧЕН!!!

Препараты на основе болиголова требуют осторожного применения и четкого соблюдения дозировки из-за содержания в растении большого количества алкалоидов. Важно помнить растение ядовито.  

Запрещается использовать беременным и кормящим грудью.

Беречь от детей

---

Состав и действующие вещества:

Сложные алкалоиды, такие, как кониин, конгидрин, метилкониин и прочие.

Богатые кислоты, глицериды петрозелидиновой кислоты.

Кофейная кислота.

Конииновое эфирное

Богатый состав минералов и макроэлементов.

Витамины группы РР

 

Способ применения: 

Царская методика оздоровления болиголовом. Используется при злокачественных и доброкачественных опухолях, туберкулезе, атеросклерозе, тромбофлебите и других хронических заболеваниях.

Принимать 1 раз в сутки натощак за час до еды от 1 до 40 капель, наращивая дозу ежедневно по 1 капле, а затем, снижая дозу каждый день на 1 каплю, возвратиться к 1 капле. Настойку капать в воду (от 100 до 200 мл, наращивая по 50 мл каждые 13 капель). При первых же признаках отравления (головокружении, тошноте.) сразу же начать снижение до 1 капли. При передозировке начинаются воспалительные процессы, резко ухудшается состояние. В этом случае необходимо прекратить прием болиголова и 3 дня принимать слабый раствор марганцовки на молоке, после чего начать снижение дозы до 1 капли. Нужно провести 3 таких курса подряд (3 горки). При достижении положительного результата повторить лечение через 6–8 месяцев.

Предельная дозировка 40 капель!!! Не превышайте дозировку.

Перед приемом обязательно консультируйтесь со специалистом.

 

Противопоказания:

Заболевания печени

Гипертония

Истощенное состояние организма

Почечная недостаточность

Послеоперационный период (первые недели).

Индивидуальная не переносимость компонентов.

 

Диета при приеме болиголова.

Питание отличается высокой калорийностью. Голодание исключено.

Продукты готовятся на пару, тушатся или варятся без добавления жиров. Обязателен прием витаминов, белков, полезных жиров, сложных углеводов, минералов и пищевых волокон.

Сахар необходимо ограничить, рекомендуется исключить копчености, колбасы, газированные напитки.

При употреблении, аконита и болиголова категорически важно следить за стулом и артериальным давлением!

Температура пищи во время еды не превышает 65 C, холодной пищи и напитков не ниже 15 C.

Потребление жидкости в день не менее1,5 литров. 

---

Продукт сертифицирован.

Травы и безалкогольные бальзамы Горного Алтая и Дальнего Востока вы всегда можете приобрести у нас в интернет-магазине. Поставки осуществляются напрямую из Барнаула, Дальнего Востока и со склада в Москве. Доставка заказов в Москве и Барнауле осуществляется курьерской службой.  По регионам РФ отправка «Почтой России», на пункты самовывоза и постоматы Boxberry.

По всем интересующим вас вопросам обращайтесь в консультационный центр: [email protected] 

 

Необходимо знать!

Даже при правильном подборе сборов трав, первый ощутимый эффект проявляется через 10-14 дней, а максимальный – к концу первого месяца. Зачастую пациенты, привыкшие к быстрому и жесткому действию таблеток, разочаровываются в фито-, АПИ- терапии, бросая курсы оздоровления, или начинают экспериментировать с дозировками. Необходимо знать и помнить, что фито- и АПИ- терапии несут накопительный эффект. Опыт показывает,  люди, верящие в лекарственные свойства и силу трав, терпеливые и последовательные, постепенно находят незаменимые именно для их организма растения и продукты АПИ- фито- терапии.

НЕ ЯВЛЯЕТСЯ ЛЕКАРСТВОМ! ПЕРЕД ПРИМЕНЕНИЕМ ПРОКОНСУЛЬТИРУЙТЕСЬ СО СПЕЦИАЛИСТОМ!

 

 

 

 

 

 

Лекарственная иммунотерапия рака менее токсична и продлевает жизнь

• Филиппа Роксби
• Корреспондент Би-би-си по вопросам здоровья

24 ноября 2019

Автор фото, Royal Marsden Hospital

Подпись к фото,

Дерек из Лестершира принял участие в испытании пембролизумаба

Лекарство, используемое при иммунотерапии рака, может избавить некоторых больных от изнуряющей химиотерапии, а также продлить им жизнь, утверждают исследователи.

В ходе клинических испытаний было выявлено, что лекарство под названием пембролизумаб сдерживало развитие различных типов рака головы и шеи в среднем в течение двух лет — это в пять раз дольше, чем при применении химеотерапии.

Оно также давало гораздо меньше побочных эффектов.

В Соединенном Королевстве в последнее время растет количество случаев заболевания этими типами рака, и если они диагностированы поздно, то лечить их сложно.

«Я могу жить нормальной жизнью»

70-летний Дерек Китчерсайд их графства Лестершир уверен, что его уже не было бы на этом свете, если бы не пембролизумаб.

В 2011-м году ему диагностировали рак гортани. Когда три года спустя, после стандартного лечения, у него начался кашель с кровью, ему сказали, что рак распространился на легкие, и, возможно, уже не поддастся лечению.

Дерек попросился принять участие в клинических испытаниях и в течение двух лет каждые три недели ездил в Лондон для прохождения лечения пембролизумабом.

«Опухоль постоянно уменьшалась, и после каждого визита я чувствовал себя все лучше и лучше, — рассказал он. — Это сильно изменило мою жизнь».

Состояние Дерека регулярно проверяют при помощи магнитно-резонансной томографии (МРТ), которая показывает, что рак не развивается, а опухоль по-прежнему уменьшается.

«Я очень рад, что могу продолжать нормально жить, — говорит Дерек. — Думаю, без него (лекарства) меня уже не было бы в живых».

Автор фото, Getty Images

Подпись к фото,

Пембролизумаб вводится с помощью капельницы

Что такое иммунотерапия?

Это лечение, которое не убивает сами раковые клетки, а стимулирует иммунную систему организма, чтобы она могла обнаруживать и атаковать их.

Пембролизумаб уже используется для лечения широкого спектра прогрессирующих видов рака, включая меланому — тип рака кожи, который распространяется очень быстро.

По мнению экспертов, его можно будет использовать для лечения и многих других типов этого заболевания.

Когда она используется?

Как правило, иммунотерапия применяется, если стандартное лечение, такое как химиотерапия, не принесло результатов. Но это исследование, проведенное на 882 пациентах из 37 стран, дает основания предполагать, что она должна использоваться раньше, а для некоторых людей это должен быть предпочтительный первый вариант лечения.

Препарат регулярно вводится пациентам через капельницу, но сейчас лечение проводится в том случае, если рак вернулся или распространился и считается неизлечимым.

Автор фото, Getty Images

Подпись к фото,

Пациенты с раком головы и шеи должны регулярно обследоваться с помощью МРТ

Почему она лучше, чем нынешние методы?

Согласно исследованию, опубликованному в журнале Lancet, это лечение более мягкое, более безопасное, и также может продлить жизнь пациентов на более долгий срок.

Однако иммунотерапия может подойти не всем.

При лечении людей с прогрессирующим раком головы и шеи препарат помог одному из четырех — их заболевание становилось менее агрессивным или стабилизировалось в среднем в течение 23 месяцев.

Для сравнения, хотя значительная часть пациентов (36%) положительно отреагировали на стандартное химиотерапевтическое лечение, улучшения у них наблюдались в среднем всего четыре с половиной месяца.

Пациентам с более крупными и агрессивными опухолями вводили препарат в сочетании с химиотерапией, чтобы помочь замедлить прогрессирование заболевания: в этом случает болезнь удавалось удерживать в среднем в течение семи месяцев.

Кому она может помочь?

По словам профессора Кевина Харрингтона, консультанта в сфере клинической онкологии в больнице The Royal Marsden NHS Founation Trust, который руководил исследованием, главная задача заключается в том, чтобы выявить людей с опухолями, которые будут реагировать на это лечение.

Врачи могут решить эту проблему с помощью теста на наличие иммунного маркера PD-L1 в опухоли.

Профессор Харрингтон говорит, что примерно 85% людей с запущенным или рецидивирующим раком головы и шеи могут лечиться пембролизумабом — это около 1300 пациентов в год.

Автор фото, Getty Images

Подпись к фото,

Цель иммунотерапии — воздействие на иммунные клетки

Почему это лечение более мягкое?

На сегодняшний день основное рекомендуемое лечение — это токсичная комбинация химиотерапии и терапии антителами, из-за которых пациенты зачастую чувствуют себя очень плохо. Такое экстремальное лечение может также привести к повреждению почек, кистей рук и стоп.

Пациенты, которых лечили посредством иммунотерапии, испытывали гораздо меньше побочных эффектов. «Это более разумно и менее токсично — пациенты живут дольше и чувствуют себя лучше», — говорит профессор Харрингтон.

Что это значит для раковых больных?

«Это очень интересное многообещающее исследование», — говорит профессор Пол Уоркман из Института исследований рака. «Во-первых, потому что оно демонстрирует, что иммунотерапия может иметь существенные преимущества для некоторых пациентов с раком головы и шеи при условии использования в качестве первоначального лечения, а во-вторых, потому что исследователи разработали тест для определения тех пациентов, которым она наверняка поможет».

Автор фото, Institute of Cancer Research

Подпись к фото,

Пембролизумаб менее токсичен для пациентов, чем химиотерапия

По его словам, все новые лекарства, поступающие на рынок, должны сопровождаться тестом, чтобы точно определить, кому они с наибольшей вероятностью помогут, кто его целевые реципиенты.

В США и ЕС пембролизумаб уже одобрен для самостоятельного применения и вместе химиотерапий при распространенном раке головы и шеи. В Великобритании этого пока не произошло.

Национальный институт здравоохранения и передового опыта в настоящее время проводит оценку препарата. Он может быть одобрен в стране уже к лету 2020 года.

Рак головы и шеи — факты:

• Примерно у 12 тысяч человек в Великобритании ежегодно диагностируют рак головы и шеи
• Половина случаев диагностируется на третьей или четвертой стадии, когда заболевание уже трудно лечить
• Большинство случаев связано с курением и употреблением алкоголя, но недавний рост случаев связан с ВПЧ (вирусом папилломы человека — human papillomavirus)
• Этот вирус заражает кожу и клетки, выстилающие внутреннюю часть тела, и может передаваться при тесном кожном контакте
• Сейчас мальчиков и девочек вакцинируют от ВПЧ в школе, но пройдет несколько десятилетий, прежде чем ВПЧ перестанет быть фактором риска

Перитонеальный канцероматоз-симпотмы , признаки.

Перитонеальный канцероматоз

Вам поставили диагноз: перитонеальный канцероматоз (опухоль брюшины)

Наверняка вы задаётесь вопросом: что же теперь делать? Подобный диагноз всегда делит жизнь на «до» и «после». Все эмоциональные ресурсы пациента и его родных брошены на переживания и страх. Но именно в этот момент необходимо изменить вектор «за что» на вектор «что можно сделать». Очень часто пациенты чувствуют себя безгранично одинокими вначале пути. Но вы должны понимать — вы не одни. Мы поможем вам справиться с болезнью и будем идти с Вами рука об руку через все этапы вашего лечения.

Предлагаем Вашему вниманию краткий, но очень подробный обзор перитонеального канцероматоза.

Филиалы и отделения, где лечат перитонеальный канцероматоз

МНИОИ им. П.А. Герцена – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России.

Введение

Перитонеальный канцероматоз (опухоль брюшины) — одно из самых грозных вариантов прогрессирования целого ряда онкологических заболеваний. Канцероматоз является формой метастазирования, при которой опухолевые клетки распространяются по внутренней выстилке анатомической полости (брюшной или плевральной) и формируют на ней мелкие узелки, так называемые диссеминаты. Ее возникновение в большинстве случаев подразумевает IV стадию заболевания, и сопряжено с неблагоприятным прогнозом для пациента. Лечение пациентов с перитонеальным канцероматозом является одной из самых сложных задач в онкологии. Наиболее часто он развивается при злокачественных новообразованиях желудочно-кишечного тракта, дыхательной системы и женских репродуктивных органов. При каких опухолях может развиваться перитонеальный канцероматоз? При раке желудка, раке легкого, раке толстой и тонкой кишки, раке яичников, муцинозных опухолях червеобразного отростка. мезотелиоме брюшины или плевры, раке поджелудочной железы, саркоме брюшной полости (саркоматоз).

Согласно данным статистики, перитонеальный канцероматоз встречается у 20-35% пациентов с онкопатологией: в 40% случаев данное осложнение формируется при опухолях желудочно-кишечного тракта, в 30% — при раке яичников (причем на момент верификации диагноза рака яичников у подавляющего большинства пациенток уже имеет место поражение брюшины). Перитонеальный канцероматоз (опухоль брюшины) является неблагоприятным прогностическим фактором; данная форма прогрессирующего опухолевого поражения практически не поддается хирургическому лечению, а применение только системной химиотерапии улучшает состояние лишь на некоторое время.

Причины возникновения перитонеального канцероматоза

Перитонеальный канцероматоз является вторичным опухолевым поражением, результатом прогрессирования рака различной локализации. Наиболее часто поражение брюшины осложняется раком желудка, тонкого кишечника, поджелудочной железы, злокачественными опухолями яичников, матки, маточных труб, печеночноклеточным раком, реже — первичными опухолями брюшины (перитонеальная мезотелиома). В ряде случаев первичный очаг остается неустановленным.

Развитие перитонеального канцероматоза является поэтапным процессом. Первый этап – распространение опухолевых клеток из первичного очага поражения. Это связано с нарушением межклеточного взаимодействия и приобретением клетками опухоли подвижности. При этом эпителиальные клетки меняют фенотип на мезенхимальный, происходит деградация межклеточного матрикса. Распространение опухолевых клеток может происходить в ходе оперативного вмешательства. Их механическое отделение возможно при повреждении лимфатических или кровеносных сосудов. Попавшие в брюшную полость клетки опухоли мигрируют под действием силы тяжести, сокращений внутренних органов, имплантируются в местах повышенной резорбции: большом сальнике, в области слепой кишки, дугласовых карманах.

На втором этапе опухолевые клетки взаимодействуют с мезотелием брюшины. Механизмы адгезии определяются природой клеток, особенностями морфологии брюшины, а также наличием участков ее повреждения. Далее клетки закрепляются в мезотелии, происходит их горизонтальное распространение по поверхности перитонеума, а затем инвазивный рост – прорастание в базальную мембрану, соединительную ткань. Следующим этапом является стимуляция неоангиогенеза – обязательного фактора развития опухоли. Морфопатогенетические механизмы формирования канцероматоза брюшины еще недостаточно изучены, в связи с чем отсутствуют радикальные методы лечения.

Частота развития канцероматоза брюшины зависит не только от первичной локализации опухоли, но и от ее размеров, глубины инвазии, гистотипа, степени дифференцировки (недифференцированный рак желудка осложняется поражением брюшины в 60% случаев, ограниченный – в 15%).

Классификация перитонельного канцероматоза

Единая классификация данного заболевания отсутствует, поскольку характеристики первичных опухолей, приводящих к поражению брюшины, весьма разнообразны. Наиболее распространена классификация перитонеального канцероматоза брюшины в зависимости от числа, локализации метастазов, которая предусматривает три степени:

Р1 – локальное поражение брюшины

Р2 – несколько областей канцероматоза, разделенных здоровыми участками брюшины

Р3 – многочисленные очаги поражения

Также используется метод определения индекса канцероматоза брюшины: суммируются баллы измерения максимальных очагов поражения (0-3 балла) в каждой из 13 наиболее вероятных областей поражения брюшины.

Симптомы перитонеального канцероматоза

Перитонеальный канцероматоз брюшины является вторичным поражением, поэтому его клиническая картина во многом определяется проявлениями первичной опухоли. Характерным признаком является обильный выпот в брюшную полость – формирование асцита. Зачастую асцитический синдром, развивающийся вследствие обструкции лимфатического дренажа, является единственным признаком заболевания, и пациенты могут поступать в отделение гастроэнтерологии или терапии для диагностики причин асцита. Состояние больных тяжелое, характерна значительная потеря веса. Неспецифическими признаками являются тошнота, рвота, выраженная слабость, утомляемость. При наличии крупных метастазов возможно их прощупывание через брюшную стенку.

Диагностика перитонеального канцероматоза

Перитонельный канцероматоз имеет неспецифическую клиническую картину, однако консультация гастроэнтеролога или онколога позволяет предположить данное заболевание на основании симптомов и физикальных данных. Лабораторные анализы не выявляют специфических изменений: определяется лейкоцитоз, ускорение СОЭ. Диагностическая программа обязательно должна включать УЗИ органов брюшной полости и малого таза, позволяющее обнаружить распространенное поражение, а также МСКТ брюшной полости с контрастированием. Обязательно проводится цитологическое исследование асцитической жидкости, полученной при лапароцентезе, которое дает возможность впервые установить или подтвердить диагноз, а также определить гистогенез клеток опухоли.

Информативным методом диагностики перитонеального канцероматоза является лапароскопия с осмотром перитонеума, дугласова пространства, диафрагмы, сопровождающаяся биопсией. Высокой специфичностью обладает обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), которая позволяет определить источник диссеминации даже при малом количестве опухолевых клеток.

Сложности диагностики возникают при наличии перитонеального канцероматоза без выявленного первичного очага. Данная форма заболевания, встречающаяся в 3-5 % случаев, проявляется клинически только при уже сформировавшемся поражении брюшины. При этом первичный очаг может иметь настолько малые размеры, что его прижизненное обнаружение невозможно.

В качестве дополнительных методов может использоваться определение онкомаркеров (кислой фосфатазы, раково-эмбрионального антигена, альфа-фетопротеина, бета-субъединицы ХГЧ). Такая диагностика не обладает высокой специфичностью, но применяется для оценки прогноза, раннего выявления диссеминации, рецидивов, а также для контроля эффективности лечения.

Лечение перитонеального канцероматоза

Хирургическое лечение канцероматоза включает удаление первичной опухоли с регионарными метастазами и отсевами по брюшине. Циторедуктивная операция выполняется в объеме перитонэктомии, может сочетаться с удалением матки и придатков, сигмовидной кишки, желчного пузыря. После проведения операции оценивается индекс полноты циторедукции: СС-0: после проведения хирургического лечения очаги поражения визуально не определяются; СС-1: имеются неудаленные очаги диаметром до 2,5 мм; СС-2: очаги диаметром 2,5 мм – 2,5 см; СС-3: очаги поражения более 2,5 см в диаметре. Однако даже при определении индекса СС-0 нельзя полностью исключить возможность диссеминации, поэтому обязательно проводится химиотерапия.

Эффективные подходы к лечению, как правило, подразумевают проведение комбинированной терапии, например, сочетания хирургического вмешательства и системной химиотерапии. Одним из наиболее эффективных методов является локальная химиотерапия. Идея локальной химиотерапии состоит в том, чтобы обеспечить доставку лекарственного препарата непосредственно к опухолевым клеткам, находящимся на внутренней выстилке анатомической полости. Из-за крайне низкой проницаемости этой области для лекарственных препаратов, например, при внутривенном их введении или приеме в виде таблеток, доставка препаратов в виде аэрозоля под давлением углекислого газа даёт накопление препарата в опухоли в значительно больших концентрациях.

Методы лечения перитонеального канцероматоза

Длительное время канцероматоз брюшины и плевры считали терминальной стадией болезни, не подлежащей специальному лечению. Разработка методик непосредственного воздействия на брюшину и плевру позволила улучшить прогноз при этом состоянии. МНИОИ им. П.А. Герцена обладает уникальными возможностями лечения больных с канцероматозом, имея в арсенале весь комплекс новейших методов терапии.

Гипертермическая интраоперационная внутрибрюшная (внутриплевральная) химиотерапия (HITEC).

Это методика, при которой во время операции в брюшную или плевральную полость вводится подогретый до 42,5С, высококонцентрированный раствор химиотерапевтических препаратов, что обеспечивает их воздействие непосредственно на раковые клетки в брюшной (плевральной) полости при минимальном воздействии на другие органы. Сеанс проводится в течение часа, что позволяет разрушить опухолевые клетки, оставшиеся после так называемой циторедуктивной операции.

Внутрибрюшная (внутриплевральная) аэрозольная химиотерапия под давлением (PIРAC)

Это новейший инновационный метод лечения перитонеального канцероматоза, который обеспечивает доставку лекарственного препарата непосредственно к опухолевым клеткам, находящимся на внутренней выстилке анатомической полости. Метод совсем недавно появился в России. Процедуру проводят посредством лапароскопии (торакоскопии). В брюшной или плевральной полости под давлением углекислого газа распыляют аэрозоль химиопрепаратов и оставляют в течение 30 мин. При таком способе введения химиопрепаратов их воздействие на опухоль многократно возрастает при полном отсутствии системной токсичности. Ноу-хау МНИОИ имени П.А. Герцена в этом методе лечения стала разработка собственной специальной форсунки, которая формирует поток мелкодисперсного аэрозоля с размером капель от 1 до 40 мкм. Изделие выполнено из специализированных материалов и не уступает по качеству импортному аналогу, а по ряду технических характеристик его превосходит.

Преимущества лечения перитонеального канцероматоза в МНИОИ имени П.А. Герцена – филиале ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России

Программа лечения перитонеального канцероматоза определяется междисциплинарным консилиумом врачей, в который входят специалисты экспертного класса ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России. Метод применения аэрозольной химиотерапии под давлением (PIPAC) был впервые испытан в Германии, а Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена — филиал «НМИЦ радиологии» Минздрава России еще в 2013 году стал вторым в мире центром, приступившим к изучению и внедрению данной методики. Проведённая за истекшие 6 лет масштабная научно-практическая работа позволила институту занять лидирующие позиции в этой области и первым в мире доказать целесообразность применения аэрозольной химиотерапии в качестве одного из основных методов лечения у пациентов, страдающих перитонеальным канцероматозом.

Настойка Болиголова

Болиголов является одним из самых удачных  средств для лечения и предупреждения  рака.

•    Болиголов можно использовать как обезболивающее средство  при сильных болях  у онкологических больных, а также при болях другого, неопухолевого происхождения; при почечных, печеночных, кишечных коликах, сильных болей во время менструации приступообразных болях в прямой кишке.

•    У многих больных  болиголов снимает также ишемические приступы болей в сердце.

•    Артериальное давление (АД). В малых дозах при длительном приеме (по 2 капли три -четыре раза в день на протяжении 2-3 месяцев),болиголов значительно снижает АД и может быть рекомендован больным с тяжелыми формами гипертонии. У гипертоников возможно снижении доз или отмена приема гипотензивных препаратов. 

Установлено также, что в небольших дозах (2 капли настойки 3 раза в день в течение 2-3-х месяцев) спиртовая настойка повышает давление и снимает усталость, поэтому  может использоваться при гипотонии, т.е. стабильно пониженном артериальном давлении.

•    Запоры. При хронических запорах  болиголов эффективно послабляет стул. Назначается по 10 капель на рюмку воды 2 раза в день, утром натощак и вечером перед сном. Обычно стул нормализуется в течение нескольких недель. В дальнейшем при необходимости можно принимать 10 капель утром натощак. 

•    Поллюции. При частых ночных поллюциях, т.е. непроизвольных семяизвержении у мужчин, истощающих организм и иногда ведущих к половой слабости, болиголов назначается в малых дозах по 2 капли на столовую ложку воды 3-4 раза в день. Курс лечения 1-2 месяца. При неэффективности такого лечения надо принимать болиголов по методике Тищенко, т.е. от 1 капли до 40 и вниз, 1-2 курса подряд (80-160 дней)        

•    Суставный  ревматизм, подагра, ушибы, рожа, системная красная волчанка, варикозное расширение вен, тромбофлебит. Наилучший эффект отмечается при сочетании приема болиголова внутрь с местным лечением: листьями болиголова (лучше свежие, при отсутствии – сушенные) завернуть в марлю, ошпарить кипятком и прикладывать к больным воспаленным местам 3-4 раза в день. При отсутствии листьев припарки заменяются смазыванием спиртовой настойкой 3-4 раза в день. Курс лечения 1-2 месяца

•    Малые дозы болиголова помогают так же при головной боли и мигрени (если они вызваны спазмом сосудов), во время приступов дозу можно увеличить один раз до 5 капель.

•    Геморрой. Нужно смочить ватку настойкой болиголова, слегка отжать, приложить на 2-3 минуты  (не более!) к соответствующему месту. Боль исчезает практически мгновенно, а на утро уменьшается и проявление наружного геморроя. Испытано многими больными, рецидивов практически не отмечается.

•     Нарушение менструального цикла. При задержке и остановке месячных (не связанных с беременностью) рекомендуется провести лечение малыми дозами: по 2 капли на столовую ложку воды 3 раза в день в течение одного месяца, в дни предполагаемых месячных дозу увеличить до 5 капель три раза в день. При неэффективности надо провести лечение по методике Тищенко, т.е. от 1 капли до 40 и вниз, 1-2 курса подряд 80-160 дней.

•    Как успокаивающее и противосудорожное средство, а также как сильнейший  иммуностимулятор, активизирующий и укрепляющий защитные силы  организма, поэтому рекомендовано применять его при лечении и для профилактики многих заболеваний: ослабление сердечной деятельности, водянка, желтуха, упорный кашель или судорожный кашель, катаракта, половое бессилие, сифилис, гангрена, малокровие, задержка  мочи, недержание мочи, истерия, коклюш, рахит, потеря слуха, заболевания мочевого пузыря, упадок сил, слабость организма вследствие старческой дряхлости, тяжелых хронических заболеваний., грипп, насморк, эпилепсия, костные болезни, язва желудка, туберкулез, глухота, астма, нарушение обмена веществ, паралич, белая горячка, болезнь Паркинсона  (дрожательный паралич), общее истощение.
•    Обязательно надо пролечиться болиголовом людям, страдающим доброкачественными опухолями, для предупреждения их злокачественного  перерождения при :

•   Миоме матки. Особенно эффективно сочетать прием болиголова внутрь со спринцеванием: 50мл отвара боровой матки или грушанки  +  5 капель настойки болиголова.

•   Эндометриозе, фибромиоме, полипах тела и шейки матки, кисте, мастопатии.

•    Простатите и аденоме предстательной железы. Принимайте болиголов 1 раз в сутки по схеме 1-40-1 (методика Тищенко). При лечением болиголовом рекомендуется применять фитопрополисные свечи 1 раз на ночь. На курс лечения идет 40 свечей. Болиголов с прополисом дают стойкий эффект лечения и возможность избежать операции.

•   Полипах мочевого пузыря,  а так же желудка, кишечника, носоглотки, гортани.  

Наружное применение:

При наружной локализации болезни («шишки» и увеличение лимфоузлов, узловой мастопатии, гангрене, слоновой болезни, судорогах, костных наростах), суставных и неврологических болях (при невритах, опоясывающем герпесе, остеохондрозе, артритах и артрозах).  Использовать мазь болиголова, нанося равномерным слоем на больное место 1-2 раза в день, сверху накладывать повязку из льняной или х/б ткани. Или же втирать в больные места настойку болиголова.

Защитить себя от рака может каждый. Как профилактическое средство, т.е. предотвращающее развитие рака, рекомендуется всем здоровым людям обязательно раз в год проводить 1 цикл  оздоровления болиголовом по методике Тищенко, т.е. от 1 капли до 40 и вниз до 1 (80 дней). После такого курса практически у всех отмечается значительное улучшение общего самочувствия и поднятие жизненного тонуса. Особенно это необходимо тем, у кого организм ослаблен (плохая экология, неполноценное питание, отрицательные эмоции, стрессы, перенесенные болезни, наследственность и др.)

Методика приёма болиголова по Тищенко (для профилактики и лечения заболеваний)

При проведении лечения болиголовом в высоких дозах (по поводу любого заболевания) каждый больной должен знать, о возможности резкого снижения артериального давления и потому обязателен контроль АД.

Настойкуболиголова следует принимать один раз в сутки. Утром натощак за час до еды растворить в воде одну каплю настойки и выпить. Завтра, в это же время растворить в воде 2 капли настойки и опять выпить. И так, наращивая каждый день по одной капле, выйти на 40 капель. Затем начать снижение вниз, убавляя по одной капли в день и за 40 дней дойти до одной капли. Это вы прошли один цикл лечения.

Болиголов всегда принимают с водой, но надо учитывать ее количество – чем больше воды, тем мягче болиголов воспринимается организмом:

 до 13 капель растворяют в 100г. воды;

от 13 до 26 капель растворяют в 150г. воды;

от 26 до 40 капель растворяют в 200г. воды.

Также поступить при снижении, только в обратном порядке. Следите за своим состоянием: при первых признаках дискомфорта (тошнота, позывы на рвоту, головокружение, головная боль, слабость в ногах, зуд во рту, слюнотечение, учащенное сердцебиение), следует прекратить повышение дозы, сразу же начав постепенное снижение до одной капли, руководствуясь описанной выше методикой.

И так делать несколько (обычно три) циклов – до полного выздоровления. Перерыв между циклами – неделя.

При прохождении следующего цикла учитывать опыт предыдущего, проводя наращивание количества капель до предельно допустимой дозы (это касается тех, кому дискомфорт и появившееся отвращение к настойке не дали подняться до 40 капель). В дни приема болиголова можно лечиться и другими целебными средствами (мумие, глиной, лекарственными травами и т.д.) но, только в разное время дня, что бы интервал приема между ними был не менее 30 минут

Если организм ослаблен или произошел рецидив рака после операции, нужно особенно внимательно наблюдать свое состояние, не допуская передозировки.

Воду, в которой разводится болиголов,  рекомендуется очистить (отстоять, профильтровать, заморозить с последующим оттаиванием).

При излечении болиголовом употребление кислых продуктов питания и кислых напитков не допустимо.

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ: молодые всходы и соцветия с листьями настаиваются на 40% спирте, а зеленые семена на 70% спирте (посуда прямо в поле наполняется болиголовом довольно плотно, и заливается спиртом). Все настаивается 1 месяц, затем все настойки перемешиваются. Соотношение настойки (трава/спирт) 15%

ВНИМАНИЕ! Одного флакона настойки хватает на 1 курс по общей схеме от 1 капли до 40 и назад.

ЯДОВИТОЕ РАСТЕНИЕ! Признаки передозировки: головная боль, рвота, слюноотделение

ОСОБЫЕ УКАЗАНИЯ: 

Не является лекарством. Перед употреблением проконсультируйтесь с лечащим врачом.Болиголов является одним из самых удачных  средств для лечения и предупреждения  рака.

Настойка болиголова (Conium L) 33%, 200 мл ~ Аптека-ua

Перед применением препарата лучше проконсультироваться с врачом. Исследования показали, что яд в малых дозах не влияет на здоровые клетки организма. Перед началом лечения необходимо пройти процедуру очищения и восстановления организма после химиотерапии. Это нужно для того, чтобы яд растения не повлиял на клетки внутренних органов, а уничтожил только рак. Поэтому лечение занимает много времени.
ПРОЦЕСС ПОДГОТОВКИ состоит из нескольких этапов:

• Укрепление кровеносной системы. Нагрузка на организм значительно увеличивается при лечении новообразований.
• В случае, если сердце не работает должным образом, кровь вовремя перестанет доставлять кислород к органам, что отрицательно скажется на результатах терапии.
• Восстанавливает уровень всех элементов, содержащихся в крови. Восстановить их полностью не всегда удается, но анализы должны быть близки к допустимым.
• Общее укрепление организма.
• Очищение от токсичных веществ.

По окончании подготовительного этапа можно начинать лечение.

СХЕМЫ ПРИНЯТИЯ НАСТОЙКИ ШЕМЛОВИКА:

9 0033 до взыскания

№1. Схема приема болиголова для ОЧЕНЬ ослабленных пациентов и детей
ВРЕМЯ ПРИЕМА	8:00	12:00	16:00	20:00	ДНЕЙ
КОЛИЧЕСТВО (капли)	1	—	—	—	3
	1	—	1	—	3
	1	1	1	—	3
	1	1	1	1	3
	2	1	1	1	3
	2	1	2	1	3
	2	2	2	1	3
	2	2	2	2

№2.Схема приема болиголова для инвалидов
ВРЕМЯ ПРИЕМА	8:00	12:00	16:00	20:00	ДНЕЙ
КОЛИЧЕСТВО (капли)	1	—	1	—	3
	1	1	1	1	3
	1	2	1	2	3
	1	2	2	2	неделя
	2	2	3	2	неделя
	3	3	3	3	неделя
	4	3	4	3	неделя
	4	4	4	4	до взыскание

№ 3.«Методика работы»: для пациентов, не прошедших курс лечения, а также прошедших курс химиотерапии и облучения. Он наиболее практичен, может использоваться как альтернатива «Королевскому методу», в большинстве случаев легко переносится и имеет не меньшую эффективность. Применение: 1 раз в день утром натощак (за час до еды) по 50-100 мл. водная настойка, начиная с 1 капли. Ежедневно увеличивая 1 каплю, достигают 15 капель. И соблюдайте эту дозировку все последующее время лечения (минимальный курс — 3 месяца).Этот метод дает наивысший процент восстановления, поскольку 15 капель — это хорошо действующая мягкая доза, при которой не подавляется защитная функция здоровых клеток. Применяя эту дозировку, мы успешно подавляем опухоль, не причиняя вреда нашему организму. Это самая оптимальная нагрузка на организм.

№ 4. «Королевский метод»: Схема приема болиголова пациентам с высоким иммунным потенциалом. Рекомендуется при любых доброкачественных образованиях, или при раковых опухолях, когда организм активно противодействует заболеванию (при нормальном здоровье, активном образе жизни).ПРИМЕНЕНИЕ: настойку пить 1 раз в день за час до еды натощак от 1 капли до 40, увеличивая ежедневно по 1 капле, затем постепенно уменьшая, возвращая к 1 капле. Настойку закапать в воду (50-100 мл., Увеличивая до 50 мл через каждые 13 капель). При первых признаках отравления (тошнота, головокружение, слабость в ногах и т. Д.) Сразу начинают уменьшаться до 1 капли. Передозировка недопустима — начинается воспаление, состояние ухудшается. В этом случае — прекратить прием болиголова и 3 дня принимать слабый раствор марганцовки на молоке, затем начать снижение до 1 капли.Проведите 2-3 таких курса подряд. При достижении положительного результата повторить 1-2 цикла лечения через 6-8 месяцев. ВАЖНЫЙ! 40 капель — это максимально допустимая доза для человеческого организма, при которой активность раковой клетки подавляется, а активность здоровых клеток подавляется до некоторой степени, что заставляет организм сосредоточить все свои силы на борьбе с этим растительным ядом, где , после снижения дозировки в порядке убывания концентрированные защитные силы организма начинают активно подавлять раковые клетки.Однако этот прием небезопасен, ведь не каждый организм способен переносить эту нагрузку. Зона риска начинается от 25 капель и выше. Для профилактики рака рекомендуется один раз в год проводить курс лечения болиголовом по этой методике. По моим наблюдениям, после такого курса практически у всех наблюдается значительное улучшение общего самочувствия и повышение жизненного тонуса.

№5. Методика фитотерапевта Дубчака А.П. ПРИМЕНЕНИЕ: 5 капель настойки болиголова на 50 мл.водный отвар душицы 4 раза в день за 30 минут до еды в течение 80 дней. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ:
Полезно использовать обычную воду, взятую с настойкой болиголова, заменить отваром из таких трав, как иван-чай, душица, мелисса, череда. При приеме Настойки болиголова особое внимание следует уделить диете. Это связано с тем, что химические процессы, происходящие в организме человека под воздействием настойки, активируют синтез антител, которые сопровождаются определенными реакциями, требующими поступления в организм ценных белков.В связи с этим диета пациента должна состоять из нежирного мяса, рыбы, круп, жиров растительного происхождения, молочных продуктов и хлебобулочных изделий. Фрукты и овощи, в состав которых входит пектин, выделяют яды и продукты распада опухолевых клеток и естественным образом выводят их из организма человека. Из рациона полностью исключены алкоголь, жирные, копченые и жареные продукты.

ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ:

• низкий гемоглобин;
• высокое содержание билирубина.

ВНИМАНИЕ! Ни в коем случае нельзя заниматься самолечением, настойку болиголова нужно принимать с особой осторожностью и строго соблюдать дозировку.

---

Только зарегистрированные клиенты, которые приобрели этот продукт, могут оставить отзыв.

Обзор, применение, побочные эффекты, меры предосторожности, взаимодействия, дозировка и обзоры

Биберчи, Э., Алтунтас, Ю., Кобаноглу, А., и Альпинар, А. Острая остановка дыхания после интоксикации болиголовом (Conium maculatum). J.Toxicol.Clin.Toxicol. 2002; 40 (4): 517-518. Просмотреть аннотацию.

Фостер, П. Ф., Макфадден, Р., Тревино, Р., Галлиард, С., Копчевски, Л. А., Гуглиуцца, К., Гонсалес, З., и Райт, Ф. Успешная трансплантация донорских органов от жертвы отравления болиголовом. Трансплантация 9-15-2003; 76 (5): 874-876. Просмотреть аннотацию.

Монтемурро, Н. Э., Ди Маджио, А., Стрипполи, П., Ковьелло, Ф., Годино, Ф., Милоро, Г., и Скатицци, А. Комбинированный диализ и плазмаферез при острой почечной недостаточности. Biomater.Artif.Cells Immobilization Biotechnol. 1993; 21 (2): 283-287. Просмотреть аннотацию.

Рейнольдс, Т. Алкалоиды болиголова из Сократа для отравления алоэ.Фитохимия 2005; 66 (12): 1399-1406. Просмотреть аннотацию.

Рицци, Д., Базиль, К., Ди Маджио, А., Себастио, А., Интрона, Ф., младший, Рицци, Р., Бруно, С., Скатицци, А., и Де Марко, С. Рабдомиолиз и острый некроз канальцев при отравлении кониином (болиголовом). Ланцет 12-16-1989; 2 (8677): 1461-1462. Просмотреть аннотацию.

Рицци, Д., Базиль, К., Ди Маджио, А., Себастио, А., Интрона, Ф., младший, Рицци, Р., Скатицци, А., Де Марко, С., и Смиалек, JE. Клинический спектр случайного отравления болиголовом: нейротоксические проявления, рабдомиолиз и острый некроз канальцев.Нефрол.Диал.Трансплантат. 1991; 6 (12): 939-943. Просмотреть аннотацию.

Рицци, Д., Интрона, Ф., мл., Гальяно, Кандела Р., Ди Нунно, К., Рикко, Р., Реккья, Р., и Де, Микеле, В. [Токсический рабдомиолиз и некроз канальцев при отравлении болиголовом. 4 истории болезни]. Clin.Ter. 2-15-1988; 124 (3): 193-201. Просмотреть аннотацию.

Скатиззи, А., Ди Маджио, А., Рицци, Д., Себастио, А. М., и Базиль, С. Острая почечная недостаточность из-за некроза канальцев, вызванного отравлением болиголовом, опосредованным дикими птицами. Ren Fail.1993; 15 (1): 93-96. Просмотреть аннотацию.

Швеппе, К. В. и Пробст, К. [Попытки лекарственной терапии рака Антоном Шторком (1731-1803). История экспериментальной фармакологии в старой Венской медицинской школе. Wien.Med Wochenschr. 3-15-1982; 132 (5): 107-117. Просмотреть аннотацию.

Веттер Дж. Ядовитый болиголов (Conium maculatum L.). Food Chem.Toxicol. 2004; 42 (9): 1373-1382. Просмотреть аннотацию.

Брталик Д., Стопира Дж., Ханнум Дж. Внутривенная инъекция яда болиголова, приводящая к длительной дыхательной недостаточности и энцефалопатии.J Med Toxicol. 2017; 13 (2): 180-182. Просмотреть аннотацию.

Carod-Artal FJ. [Неврологические синдромы, связанные с употреблением в пищу растений и грибов, содержащих токсичный компонент (I). Нейротоксические синдромы, вызванные употреблением в пищу растений, семян и фруктов. Rev Neurol 2003; 36: 860-71. Просмотреть аннотацию.

Чен Х.Й., Хорнг Х., Роули Ф., Смоллин С. Быстрая остановка дыхания после употребления ядовитого болиголова, ошибочно принимаемого за дикий сельдерей. Clin Toxicol (Phila). 2017; 55 (2): 155-156. Просмотреть аннотацию.

Барабанщик О.Н., Робертс А.Н., Бедфорд П.Дж. и др.Три случая смерти от отравления болиголовом. Med J Aust 1995; 162: 592-3.

Франк Б.С., Пантер К.Е. Проглатывание ядовитого болиголова (Conium maculatum). Вест Дж. Мед. 1995; 163: 573-4.

Hove KD, Brøns C, Færch K, Lund SS, Rossing P, Vaag A. Влияние 12 недель лечения ферментированным молоком на артериальное давление, метаболизм глюкозы и маркеры сердечно-сосудистого риска у пациентов с диабетом 2 типа: рандомизированный двойной -слепое плацебо-контролируемое исследование. Eur J Endocrinol. 2015; 172 (1): 11-20. Просмотреть аннотацию.

Konca C, Kahramaner Z, Bosnak M, Kocamaz H. Отравление болиголова (Conium Maculatum) у ребенка. Turk J Emerg Med. 2016; 14 (1): 34-6. Просмотреть аннотацию.

Кренцелок Е.П., Якобсен Т.Д., Аронис Дж. М.. Проглатывание болиголова: наиболее смертоносное воздействие на растения. NACCT Abstracts 1996: Abstract # 131.

Лопес Т.А., Сид М.С., Бьянкини М.Л. Биохимия алкалоидов болиголова (Conium maculatum L.) и их острая и хроническая токсичность для домашнего скота. Обзор. Токсикон 1999; 37: 841-65. Просмотреть аннотацию.

Пантер К.Е., Киллер РФ, Бейкер округ Колумбия. Токсикоз домашнего скота от болиголов (Conium и Cicuta spp.). J Anim Sci 1988; 66: 2407-13. Просмотреть аннотацию.

Взаимодействие лекарственного средства с ДНК и его способность вызывать апоптоз посредством генерации АФК

Реферат

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве традиционного лекарства от рака шейки матки, включая гомеопатию. Однако до сих пор не проводилось систематической работы по тестированию его противоракового потенциала против клеток рака шейки матки in vitro .Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кония вызывать цитотоксичность в различных линиях нормальных и раковых клеток, включая подробное исследование на клетках HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кония на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии. Могут ли Conium повредить ДНК и вызвать морфологические изменения, также определяли микроскопически.Экспрессия различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, была критически изучена методами вестерн-блоттинга и ELISA. Может ли Conium напрямую взаимодействовать с ДНК, было также определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД).

Результаты:

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и ингибирует пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии суб-G. Обработка кониумом приводит к увеличению генерации активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, увеличению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов.В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный путь, зависимый от каспазы-3. КД-спектроскопия показала, что Коний взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и подтверждают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарств и ДНК, пролиферация, активные формы кислорода

ВВЕДЕНИЕ

Conium maculatum — чрезвычайно ядовитый цветущий сорняк, известный как Hemlock и принадлежит к семейству Apiaceae.Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N, -метилкониин, конгидрин, псевдокогидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова. [1] Структуры этих алкалоидов показаны на рисунке. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого аналогичны никотину. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина. [2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт долгое время использовался как традиционное средство от различных заболеваний.[4] Например, Conium является основным лекарством от предстательной железы и отека яичек. В гомеопатии он используется как лекарство от рака груди и рака шейки матки [4], но его действие еще не было научно подтверждено, за исключением сообщения о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК) [4]. 5] В этом исследовании мы планируем выяснить вероятный механизм действия препарата, индуцирующего апоптоз в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium.(b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг / мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и PBMC и инкубировали в течение 48 часов. Далее 70-840 мкг / мл лекарств добавляли в культуру HeLa в течение 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев, чтобы оценить процент жизнеспособности клеток [Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывает на снижение пролиферативных свойств клеток HeLa после обработки Conium в дозе 450 мкг / мл, а затем контрольных планшетов через различные интервалы времени.Наименьшая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток при M1 = суб-G1 состоянии клеточного цикла по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы ДНК-таргетная терапия приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК была связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтеза белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-ДНК), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Растительные экстракты считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов. [7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами допустимого предела обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. [8] АФК также деполяризует потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и вызывает апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, мы заинтересовались тем, чтобы изучить, имеет ли он какое-либо противораковое действие против клеток HeLa, может ли он производить АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками. [12] Следовательно, ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно обладать способностью подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазой обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК. [14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, этот подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью вызывать цитотоксичность в клетках HeLa, а также препятствует их пролиферации; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в цДНК и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать АФК и деполяризовать ММП, модулируя определенные сигнальные белки клетки, связанные с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические вещества и реагенты

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотики пенициллина, стрептомицина, неомицина (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальная бычья сыворотка (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) были получены от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для культивирования тканей были закуплены у Tarson (Индия). Акридиновый апельсин (АО) и бромид этидия (EB) были приобретены в SRL (Индия). 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ), пропидия иодид (PI), дихлор-дигидрофлуоресцеиндиацетат (H ₂ DCFDA), 4 ×, 6-диамидино-2- дигидрохлорид фенилиндола (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеина изотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

Клетки HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) были собраны из Национального центра клеточных исследований, Индия. Клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе (ESCO, Singapore) с кислородом окружающей среды и 5% уровнем углекислого газа при 37 ° C. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% PSN.Клетки собирали с 0,025% трипсин-ЭДТА в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), высевали на чашки с требуемым количеством клеток и оставляли для прилипания в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque стандартным методом и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и PBMC помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном для микротиттера (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 ³ клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм на ридере для ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium оказалась наиболее заметной и в подавляющем большинстве случаев выше у HeLa, чем у других линий раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял значительной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и PBMC. Следовательно, клетки HeLa были предпочтительнее других раковых клеток как наиболее подходящие материалы для проведения всех других экспериментов, связанных с его вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результата анализа МТТ были выбраны три различных дозы, а именно: D1 = 150 мкг / мл, D2 = 300 мкг / мл и D3 = 450 мкг / мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Набор положительного контроля (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разведения), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарственного средства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал какой-либо ощутимой разницы в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного препарата выбирали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa анализировали на цитотоксические эффекты Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарств в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), предварительно нагретым до 37 ° C, обрабатывали трипсином и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток / лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом. [16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и обрабатывали трипсином.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эту процедуру повторяли для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторяли три раза. После анализа данных была получена гистограмма пролиферации клеток.

Анализ клеточного цикла

Иодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление ROS количественно оценивали после инкубации 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 часов соответственно с 450 мкг / мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальной мембраны

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al . [6] После 48 ч инкубации, контроль и лечение (150, 300 и 450 мкг / мл Conium ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамином 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина 123 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США), а данные анализировали с использованием программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. После 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO / EB: для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы лекарственного средства (150, 300 и 450 мкг / мл Conium). После 48-часовой обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и AO / EB в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V / PI

Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали в течение 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI, соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно) клетки HeLa промывали PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг / мл) и протеиназа K (0,1 мг / мл)) в течение ночи, затем центрифугировали при 1200 g при 4 ° C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25: 24: 1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4 ° C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали из водного слоя с использованием 100% этанола и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избытка белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с использованием электрофореза в 1,5% агарозном геле, и полосы визуализировали под УФ-транс-осветителем с последующей цифровой фотографией.

Вестерн-блот-анализ

Клеток HeLa высевали в чашки диаметром 75 мм (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 ⁵ клеток на лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (150, 300 и 450 мкг / мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) обрабатывали 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. После блокирования 3% BSA мембраны отдельно инкубировали со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4 ° C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. BCIP-NBT использовался в качестве проявителя, а количественное определение белков было выполнено методом денситометрии с использованием программного обеспечения image J. [17]

Оценка активности цитохрома c с помощью непрямого ELISA

Для этого эксперимента клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома c измеряли с помощью ридера ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность цвета измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил геном домашнего хозяйства в этом анализе. [18]

Взаимодействие лекарств с ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были выполнены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК голых клеток тимуса теленка (ктДНК) с концентрацией лекарственного средства 450 мкл / мл с использованием необработанной цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия лекарственного средства с ДНК внутри клеток инкубацию проводили с конием в концентрации 450 мкл / мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора GeneiPure для очистки геномной ДНК млекопитающих, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственное средство-ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro [19].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорных тестов LSD с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения значимости различий между средними значениями различных групп.Результаты выражали в виде среднего значения ± стандартная ошибка (стандартная ошибка). * P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa к образованию колоний

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибели клеток произошли при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг / мл на A375, HepG2 и A549, соответственно, в течение 48 часов лечения [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат MTT показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличивалась через 48 часов, больше, чем наблюдалась через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa было дозозависимым, как и у других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности снизился до 36,48 ± 1 для дозы лекарственного средства 840 мкг / мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% произошло при 722,6 ± 8,0 мкг / мл. За 48 ч инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности клеток снизился до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг / мл и 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при 575,5 ± 5,0 мкг / мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и PBMC) показали, что Conium имеет минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снизился до 85 ± 1,1 при обработке кониумом 840 мкг / мл в течение 48 часов, а для РВМС процент жизнеспособности снизился при более высоких дозах и составил 78,3 ± 2,4% при обработке кониумом 840 мкг / мл. на 48 часов.

Результат клоногенного анализа показал, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. После 24 и 48 ч обработки конием (450 мкг / мл) колониеобразующая способность снизилась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти данные позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний из клеток HeLa [].

Обработка конием уменьшала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла.

Обработка конием уменьшала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение Conium не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 ^-го часа лечения пролиферация клеток постепенно снижалась, и наименьшая пролиферация была достигнута через 48 часов лечения [].

Признак остановки клеточного цикла был обнаружен в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, указывая, таким образом, на то, что индукция фрагментации ДНК началась через 24 и 48 часов [].

Обработка конием инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Образование АФК: это зависящее от времени исследование выявило накопление АФК при лечении лекарственными препаратами (450 мкг / мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывает на накопление ROS.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию ММП. Исследования FACS показали, что смещение меток было в сторону оси Y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования.

Обработка конием деполяризовала потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения показали уменьшение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация была дозозависимой, и максимальная деполяризация наблюдалась при 450 мкг / мл обработки Conium [].

Обработка Conium вызвала морфологические изменения в клетках HeLa с нуклеосомной фрагментацией

Морфологические изменения наблюдались в клетках HeLa при обработке Conium с округлением периферии цитоплазмы и постепенным отрывом клеток от субстрата. Особенности включали образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдали в клетках, окрашенных AO / EB, по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], причем наибольшая степень фрагментации наблюдалась при дозе кониума 450 мкг / мл.

Определение апоптоза: клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium в течение 48 часов. (а) Морфологический анализ: результат показал образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO / EB: конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляют индукцию апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальное количество нуклеосомной фрагментации наблюдалось при дозе 450 мкг / мл Conium, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов обработки. Точечная диаграмма предполагала присутствие клеток с ранним апоптозом обработкой кониумом через 24 и 48 часов [верхний левый = мертвые клетки, нижний левый = живые клетки, верхний правый = поздние апоптотические клетки и нижний правый = ранние апоптотические клетки]. (e) Анализ фрагментации ДНК: присутствие фрагментации наблюдали в обработанных Conium клетках через 48 часов обработки.Фрагментация была наибольшей при максимальной дозе

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина через плазматическую мембрану с инициированием фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза проводилось путем оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V / PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг / мл). Клетки показали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на поверхности клетки [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, обработанной Conium [].

Обработка Conium модулировала экспрессию различных белков, связанных с пролиферацией и апоптозом клеток, в клетках HeLa.

Обработка Conium усиливала экспрессию определенных белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозе препарата 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно. Экспрессия Bax увеличивалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе лекарственного средства, а активность TNF-α также усиливалась обработкой Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно.Обработка кониумом увеличивала расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при максимальной дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 могут указывать на индукцию апоптоза в обработанных Conium клетках [].

(a) Вестерн-блоттинг: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt снижалась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась обработкой Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) ELISA-анализ: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции путем обработки лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет активность цитохрома с, выражающуюся в показателях оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Нативный Akt вместе с его активированной формой экспрессии pAkt подавлялся обработкой кониумом.Отношения pAkt / Akt уменьшились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг / мл обработки Conium, соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также подавлялась на ~ 23%, а экспрессия NFkB также подавлялась на ~ 28% при обработке Conium в клетках HeLa [Фиг.6]. GAPDH служил контролем загрузки [].

ELISA-анализ цитохрома c показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Спектральные изменения кругового дихроизма, индуцированные конием как в ct-ДНК, так и в HeLa ДНК

Результаты спектроскопии КД показали, что Conium может взаимодействовать с нативной B-конформацией ДНК как ct-ДНК [], так и ядерной ДНК [] обработанной Conium Клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В обработанной Conium ct-ДНК и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составили 262 (+4) и 255 (0), соответственно, а для отрицательных полос — 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие лекарств с ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (a) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения лекарства

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на наших первоначальных результатах, которые показали, что жизнеспособность клеток HeLa резко снижается, мы решили продолжить исследования на клетках HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что ДНК-таргетная терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. [20,21,22] Анализ CD-спектра выявил значительное изменение Conium на ДНК в бороздке. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, если предположить, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум активирует активность АФК в ранние часы в клетках HeLa.Это событие могло проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в обработанных Conium клетках. Обработка кониумом снижает жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени / дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением популяции клеток в квадранте аннексин V-положительный / PI-отрицательный, что подтверждает способность кония вызывать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 часов после обработки; одновременно, такое событие, как скорость роста клеток, снижалась с увеличением популяции клеток в фазе суб-G1 после обработки кониумом, что добавляет дополнительную поддержку роли кония в остановке деления клеток, демонстрируя его ингибирующее действие на рост раковых клеток. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком pAkt / Akt. [23] Введение лекарственного средства снижает уровень pAkt / Akt и, вероятно, вызывает состояние, которое приводит к снижению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, показывающих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа MTT также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы лекарственного средства, но такое состояние не наблюдалось в случае WRL-68 и PBMC. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO / EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV / PI. По нашим данным, увеличение популяции клеток, находящихся в раннем апоптозном состоянии (что проявляется в клетках с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных сериях, обработанных лекарствами.Таким образом, были четкие доказательства того, что лекарство может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после лечения.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать повышенную чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров, таких как р53. [13] Экспрессия р53 повышалась вместе с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. С остановкой роста экспрессия Akt / pAkt, важной для дифференцировки и пролиферации клеток молекулы [12], подавляется.Одна из гипотез, объясняющих это событие, может заключаться в том, что перекрестное взаимодействие p53-Akt имело место после индукции лекарственного средства.

Накопление АФК и деполяризация ММП — параллельные процессы [24], приводящие к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз по внутреннему пути. [26] В нашем исследовании деполяризация ММП происходила с увеличением цитозольного цитохрома с при лечении препаратом. Это может указывать на то, что раннее повышение ROS играет регуляторный механизм для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax повышается с помощью белка-супрессора опухолей p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпевал конформационный сдвиг, чтобы стать ассоциированным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз. [26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и может тем самым нейтрализовать его проапоптотический эффект.Следовательно, изменения уровней Bax и Bcl-2, то есть отношения Bcl-2 / Bax, являются решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток. [27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

ROS участвует в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α является фактором или рецептором, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ. [28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижнем [29] уровне. Наши результаты показали повышенную регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 в ее нижнем течении, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие лекарственного средства с ДНК и его способность вызывать апоптоз посредством генерации АФК

Реферат

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве традиционного лекарства от рака шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по тестированию его противоракового потенциала против клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кония вызывать цитотоксичность в различных линиях нормальных и раковых клеток, включая подробное исследование на клетках HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кония на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Могут ли Conium повредить ДНК и вызвать морфологические изменения, также определяли микроскопически. Экспрессия различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, была критически изучена методами вестерн-блоттинга и ELISA. Может ли Conium напрямую взаимодействовать с ДНК, было также определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД).

Результаты:

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и ингибирует пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии суб-G.Обработка кониумом приводит к увеличению генерации активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, увеличению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный путь, зависимый от каспазы-3. КД-спектроскопия показала, что Коний взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и подтверждают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарств и ДНК, пролиферация, активные формы кислорода

ВВЕДЕНИЕ

Conium maculatum — чрезвычайно ядовитый цветущий сорняк, известный как Hemlock и принадлежит к семейству Apiaceae. Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N, -метилкониин, конгидрин, псевдогидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на a. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого аналогичны никотину. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина. [2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт долгое время использовался как традиционное средство от различных заболеваний. [4] Например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичек. В гомеопатии он используется как лекарство от рака груди и рака шейки матки [4], но его действие еще не было научно подтверждено, за исключением сообщения о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы планируем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг / мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и PBMC и инкубировали в течение 48 часов. Далее 70-840 мкг / мл лекарств добавляли в культуру HeLa в течение 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев, чтобы оценить процент жизнеспособности клеток [Значение * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывает на снижение пролиферативных свойств клеток HeLa после обработки Conium в дозе 450 мкг / мл, а затем контрольных планшетов через различные интервалы времени. Наименьшая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток при M1 = суб-G1 состоянии клеточного цикла по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы ДНК-таргетная терапия приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК была связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтеза белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-ДНК), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Растительные экстракты считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов. [7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами допустимого предела обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. [8] АФК также деполяризует потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и вызывает апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, мы заинтересовались тем, чтобы изучить, имеет ли он какое-либо противораковое действие против клеток HeLa, может ли он производить АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками. [12] Следовательно, ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно обладать способностью подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазой обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК. [14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, этот подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью вызывать цитотоксичность в клетках HeLa, а также препятствует их пролиферации; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в цДНК и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать АФК и деполяризовать ММП, модулируя определенные сигнальные белки клетки, связанные с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические вещества и реагенты

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотики пенициллина, стрептомицина, неомицина (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальная бычья сыворотка (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) были получены от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для культивирования тканей были закуплены у Tarson (Индия). Акридиновый апельсин (АО) и бромид этидия (EB) были приобретены в SRL (Индия). 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ), пропидия иодид (PI), дихлор-дигидрофлуоресцеиндиацетат (H ₂ DCFDA), 4 ×, 6-диамидино-2- дигидрохлорид фенилиндола (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеина изотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

Клетки HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) были собраны из Национального центра клеточных исследований, Индия. Клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе (ESCO, Singapore) с кислородом окружающей среды и 5% уровнем углекислого газа при 37 ° C. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% PSN.Клетки собирали с 0,025% трипсин-ЭДТА в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), высевали на чашки с требуемым количеством клеток и оставляли для прилипания в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque стандартным методом и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и PBMC помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном для микротиттера (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 ³ клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм на ридере для ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium оказалась наиболее заметной и в подавляющем большинстве случаев выше у HeLa, чем у других линий раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял значительной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и PBMC. Следовательно, клетки HeLa были предпочтительнее других раковых клеток как наиболее подходящие материалы для проведения всех других экспериментов, связанных с его вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результата анализа МТТ были выбраны три различных дозы, а именно: D1 = 150 мкг / мл, D2 = 300 мкг / мл и D3 = 450 мкг / мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Набор положительного контроля (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разведения), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарственного средства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал какой-либо ощутимой разницы в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного препарата выбирали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa анализировали на цитотоксические эффекты Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарств в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), предварительно нагретым до 37 ° C, обрабатывали трипсином и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток / лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом. [16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и обрабатывали трипсином.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эту процедуру повторяли для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторяли три раза. После анализа данных была получена гистограмма пролиферации клеток.

Анализ клеточного цикла

Иодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление ROS количественно оценивали после инкубации 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 часов соответственно с 450 мкг / мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальной мембраны

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al . [6] После 48 ч инкубации, контроль и лечение (150, 300 и 450 мкг / мл Conium ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамином 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина 123 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США), а данные анализировали с использованием программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. После 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO / EB: для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы лекарственного средства (150, 300 и 450 мкг / мл Conium). После 48-часовой обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и AO / EB в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V / PI

Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали в течение 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI, соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно) клетки HeLa промывали PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг / мл) и протеиназа K (0,1 мг / мл)) в течение ночи, затем центрифугировали при 1200 g при 4 ° C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25: 24: 1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4 ° C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали из водного слоя с использованием 100% этанола и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избытка белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с использованием электрофореза в 1,5% агарозном геле, и полосы визуализировали под УФ-транс-осветителем с последующей цифровой фотографией.

Вестерн-блот-анализ

Клеток HeLa высевали в чашки диаметром 75 мм (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 ⁵ клеток на лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (150, 300 и 450 мкг / мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) обрабатывали 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. После блокирования 3% BSA мембраны отдельно инкубировали со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4 ° C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. BCIP-NBT использовался в качестве проявителя, а количественное определение белков было выполнено методом денситометрии с использованием программного обеспечения image J. [17]

Оценка активности цитохрома c с помощью непрямого ELISA

Для этого эксперимента клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома c измеряли с помощью ридера ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность цвета измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил геном домашнего хозяйства в этом анализе. [18]

Взаимодействие лекарств с ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были выполнены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК голых клеток тимуса теленка (ктДНК) с концентрацией лекарственного средства 450 мкл / мл с использованием необработанной цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия лекарственного средства с ДНК внутри клеток инкубацию проводили с конием в концентрации 450 мкл / мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора GeneiPure для очистки геномной ДНК млекопитающих, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственное средство-ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro [19].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорных тестов LSD с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения значимости различий между средними значениями различных групп.Результаты выражали в виде среднего значения ± стандартная ошибка (стандартная ошибка). * P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa к образованию колоний

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибели клеток произошли при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг / мл на A375, HepG2 и A549, соответственно, в течение 48 часов лечения [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат MTT показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличивалась через 48 часов, больше, чем наблюдалась через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa было дозозависимым, как и у других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности снизился до 36,48 ± 1 для дозы лекарственного средства 840 мкг / мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% произошло при 722,6 ± 8,0 мкг / мл. За 48 ч инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности клеток снизился до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг / мл и 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при 575,5 ± 5,0 мкг / мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и PBMC) показали, что Conium имеет минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снизился до 85 ± 1,1 при обработке кониумом 840 мкг / мл в течение 48 часов, а для РВМС процент жизнеспособности снизился при более высоких дозах и составил 78,3 ± 2,4% при обработке кониумом 840 мкг / мл. на 48 часов.

Результат клоногенного анализа показал, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. После 24 и 48 ч обработки конием (450 мкг / мл) колониеобразующая способность снизилась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти данные позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний из клеток HeLa [].

Обработка конием уменьшала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла.

Обработка конием уменьшала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение Conium не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 ^-го часа лечения пролиферация клеток постепенно снижалась, и наименьшая пролиферация была достигнута через 48 часов лечения [].

Признак остановки клеточного цикла был обнаружен в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, указывая, таким образом, на то, что индукция фрагментации ДНК началась через 24 и 48 часов [].

Обработка конием инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Образование АФК: это зависящее от времени исследование выявило накопление АФК при лечении лекарственными препаратами (450 мкг / мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывает на накопление ROS.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию ММП. Исследования FACS показали, что смещение меток было в сторону оси Y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования.

Обработка конием деполяризовала потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения показали уменьшение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация была дозозависимой, и максимальная деполяризация наблюдалась при 450 мкг / мл обработки Conium [].

Обработка Conium вызвала морфологические изменения в клетках HeLa с нуклеосомной фрагментацией

Морфологические изменения наблюдались в клетках HeLa при обработке Conium с округлением периферии цитоплазмы и постепенным отрывом клеток от субстрата. Особенности включали образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдали в клетках, окрашенных AO / EB, по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], причем наибольшая степень фрагментации наблюдалась при дозе кониума 450 мкг / мл.

Определение апоптоза: клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium в течение 48 часов. (а) Морфологический анализ: результат показал образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO / EB: конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляют индукцию апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальное количество нуклеосомной фрагментации наблюдалось при дозе 450 мкг / мл Conium, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов обработки. Точечная диаграмма предполагала присутствие клеток с ранним апоптозом обработкой кониумом через 24 и 48 часов [верхний левый = мертвые клетки, нижний левый = живые клетки, верхний правый = поздние апоптотические клетки и нижний правый = ранние апоптотические клетки]. (e) Анализ фрагментации ДНК: присутствие фрагментации наблюдали в обработанных Conium клетках через 48 часов обработки.Фрагментация была наибольшей при максимальной дозе

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина через плазматическую мембрану с инициированием фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза проводилось путем оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V / PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг / мл). Клетки показали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на поверхности клетки [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, обработанной Conium [].

Обработка Conium модулировала экспрессию различных белков, связанных с пролиферацией и апоптозом клеток, в клетках HeLa.

Обработка Conium усиливала экспрессию определенных белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозе препарата 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно. Экспрессия Bax увеличивалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе лекарственного средства, а активность TNF-α также усиливалась обработкой Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно.Обработка кониумом увеличивала расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при максимальной дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 могут указывать на индукцию апоптоза в обработанных Conium клетках [].

(a) Вестерн-блоттинг: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt снижалась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась обработкой Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) ELISA-анализ: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции путем обработки лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет активность цитохрома с, выражающуюся в показателях оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Нативный Akt вместе с его активированной формой экспрессии pAkt подавлялся обработкой кониумом.Отношения pAkt / Akt уменьшились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг / мл обработки Conium, соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также подавлялась на ~ 23%, а экспрессия NFkB также подавлялась на ~ 28% при обработке Conium в клетках HeLa [Фиг.6]. GAPDH служил контролем загрузки [].

ELISA-анализ цитохрома c показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Спектральные изменения кругового дихроизма, индуцированные конием как в ct-ДНК, так и в HeLa ДНК

Результаты спектроскопии КД показали, что Conium может взаимодействовать с нативной B-конформацией ДНК как ct-ДНК [], так и ядерной ДНК [] обработанной Conium Клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В обработанной Conium ct-ДНК и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составили 262 (+4) и 255 (0), соответственно, а для отрицательных полос — 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие лекарств с ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (a) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения лекарства

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на наших первоначальных результатах, которые показали, что жизнеспособность клеток HeLa резко снижается, мы решили продолжить исследования на клетках HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что ДНК-таргетная терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. [20,21,22] Анализ CD-спектра выявил значительное изменение Conium на ДНК в бороздке. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, если предположить, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум активирует активность АФК в ранние часы в клетках HeLa.Это событие могло проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в обработанных Conium клетках. Обработка кониумом снижает жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени / дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением популяции клеток в квадранте аннексин V-положительный / PI-отрицательный, что подтверждает способность кония вызывать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 часов после обработки; одновременно, такое событие, как скорость роста клеток, снижалась с увеличением популяции клеток в фазе суб-G1 после обработки кониумом, что добавляет дополнительную поддержку роли кония в остановке деления клеток, демонстрируя его ингибирующее действие на рост раковых клеток. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком pAkt / Akt. [23] Введение лекарственного средства снижает уровень pAkt / Akt и, вероятно, вызывает состояние, которое приводит к снижению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, показывающих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа MTT также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы лекарственного средства, но такое состояние не наблюдалось в случае WRL-68 и PBMC. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO / EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV / PI. По нашим данным, увеличение популяции клеток, находящихся в раннем апоптозном состоянии (что проявляется в клетках с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных сериях, обработанных лекарствами.Таким образом, были четкие доказательства того, что лекарство может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после лечения.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать повышенную чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров, таких как р53. [13] Экспрессия р53 повышалась вместе с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. С остановкой роста экспрессия Akt / pAkt, важной для дифференцировки и пролиферации клеток молекулы [12], подавляется.Одна из гипотез, объясняющих это событие, может заключаться в том, что перекрестное взаимодействие p53-Akt имело место после индукции лекарственного средства.

Накопление АФК и деполяризация ММП — параллельные процессы [24], приводящие к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз по внутреннему пути. [26] В нашем исследовании деполяризация ММП происходила с увеличением цитозольного цитохрома с при лечении препаратом. Это может указывать на то, что раннее повышение ROS играет регуляторный механизм для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax повышается с помощью белка-супрессора опухолей p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпевал конформационный сдвиг, чтобы стать ассоциированным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз. [26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и может тем самым нейтрализовать его проапоптотический эффект.Следовательно, изменения уровней Bax и Bcl-2, то есть отношения Bcl-2 / Bax, являются решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток. [27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

ROS участвует в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α является фактором или рецептором, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ. [28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижнем [29] уровне. Наши результаты показали повышенную регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 в ее нижнем течении, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие лекарственного средства с ДНК и его способность вызывать апоптоз посредством генерации АФК

Реферат

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве традиционного лекарства от рака шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по тестированию его противоракового потенциала против клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кония вызывать цитотоксичность в различных линиях нормальных и раковых клеток, включая подробное исследование на клетках HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кония на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Могут ли Conium повредить ДНК и вызвать морфологические изменения, также определяли микроскопически. Экспрессия различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, была критически изучена методами вестерн-блоттинга и ELISA. Может ли Conium напрямую взаимодействовать с ДНК, было также определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД).

Результаты:

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и ингибирует пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии суб-G.Обработка кониумом приводит к увеличению генерации активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, увеличению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный путь, зависимый от каспазы-3. КД-спектроскопия показала, что Коний взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и подтверждают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарств и ДНК, пролиферация, активные формы кислорода

ВВЕДЕНИЕ

Conium maculatum — чрезвычайно ядовитый цветущий сорняк, известный как Hemlock и принадлежит к семейству Apiaceae. Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N, -метилкониин, конгидрин, псевдогидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на a. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого аналогичны никотину. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина. [2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт долгое время использовался как традиционное средство от различных заболеваний. [4] Например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичек. В гомеопатии он используется как лекарство от рака груди и рака шейки матки [4], но его действие еще не было научно подтверждено, за исключением сообщения о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы планируем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг / мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и PBMC и инкубировали в течение 48 часов. Далее 70-840 мкг / мл лекарств добавляли в культуру HeLa в течение 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев, чтобы оценить процент жизнеспособности клеток [Значение * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывает на снижение пролиферативных свойств клеток HeLa после обработки Conium в дозе 450 мкг / мл, а затем контрольных планшетов через различные интервалы времени. Наименьшая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток при M1 = суб-G1 состоянии клеточного цикла по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы ДНК-таргетная терапия приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК была связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтеза белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-ДНК), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Растительные экстракты считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов. [7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами допустимого предела обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. [8] АФК также деполяризует потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и вызывает апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, мы заинтересовались тем, чтобы изучить, имеет ли он какое-либо противораковое действие против клеток HeLa, может ли он производить АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками. [12] Следовательно, ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно обладать способностью подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазой обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК. [14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, этот подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью вызывать цитотоксичность в клетках HeLa, а также препятствует их пролиферации; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в цДНК и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать АФК и деполяризовать ММП, модулируя определенные сигнальные белки клетки, связанные с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические вещества и реагенты

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотики пенициллина, стрептомицина, неомицина (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальная бычья сыворотка (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) были получены от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для культивирования тканей были закуплены у Tarson (Индия). Акридиновый апельсин (АО) и бромид этидия (EB) были приобретены в SRL (Индия). 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ), пропидия иодид (PI), дихлор-дигидрофлуоресцеиндиацетат (H ₂ DCFDA), 4 ×, 6-диамидино-2- дигидрохлорид фенилиндола (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеина изотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

Клетки HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) были собраны из Национального центра клеточных исследований, Индия. Клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе (ESCO, Singapore) с кислородом окружающей среды и 5% уровнем углекислого газа при 37 ° C. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% PSN.Клетки собирали с 0,025% трипсин-ЭДТА в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), высевали на чашки с требуемым количеством клеток и оставляли для прилипания в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque стандартным методом и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и PBMC помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном для микротиттера (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 ³ клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм на ридере для ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium оказалась наиболее заметной и в подавляющем большинстве случаев выше у HeLa, чем у других линий раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял значительной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и PBMC. Следовательно, клетки HeLa были предпочтительнее других раковых клеток как наиболее подходящие материалы для проведения всех других экспериментов, связанных с его вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результата анализа МТТ были выбраны три различных дозы, а именно: D1 = 150 мкг / мл, D2 = 300 мкг / мл и D3 = 450 мкг / мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Набор положительного контроля (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разведения), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарственного средства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал какой-либо ощутимой разницы в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного препарата выбирали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa анализировали на цитотоксические эффекты Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарств в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), предварительно нагретым до 37 ° C, обрабатывали трипсином и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток / лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом. [16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и обрабатывали трипсином.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эту процедуру повторяли для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторяли три раза. После анализа данных была получена гистограмма пролиферации клеток.

Анализ клеточного цикла

Иодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление ROS количественно оценивали после инкубации 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 часов соответственно с 450 мкг / мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальной мембраны

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al . [6] После 48 ч инкубации, контроль и лечение (150, 300 и 450 мкг / мл Conium ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамином 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина 123 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США), а данные анализировали с использованием программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. После 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO / EB: для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы лекарственного средства (150, 300 и 450 мкг / мл Conium). После 48-часовой обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и AO / EB в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V / PI

Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали в течение 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI, соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно) клетки HeLa промывали PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг / мл) и протеиназа K (0,1 мг / мл)) в течение ночи, затем центрифугировали при 1200 g при 4 ° C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25: 24: 1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4 ° C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали из водного слоя с использованием 100% этанола и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избытка белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с использованием электрофореза в 1,5% агарозном геле, и полосы визуализировали под УФ-транс-осветителем с последующей цифровой фотографией.

Вестерн-блот-анализ

Клеток HeLa высевали в чашки диаметром 75 мм (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 ⁵ клеток на лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (150, 300 и 450 мкг / мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) обрабатывали 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. После блокирования 3% BSA мембраны отдельно инкубировали со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4 ° C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. BCIP-NBT использовался в качестве проявителя, а количественное определение белков было выполнено методом денситометрии с использованием программного обеспечения image J. [17]

Оценка активности цитохрома c с помощью непрямого ELISA

Для этого эксперимента клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома c измеряли с помощью ридера ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность цвета измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил геном домашнего хозяйства в этом анализе. [18]

Взаимодействие лекарств с ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были выполнены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК голых клеток тимуса теленка (ктДНК) с концентрацией лекарственного средства 450 мкл / мл с использованием необработанной цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия лекарственного средства с ДНК внутри клеток инкубацию проводили с конием в концентрации 450 мкл / мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора GeneiPure для очистки геномной ДНК млекопитающих, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственное средство-ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro [19].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорных тестов LSD с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения значимости различий между средними значениями различных групп.Результаты выражали в виде среднего значения ± стандартная ошибка (стандартная ошибка). * P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa к образованию колоний

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибели клеток произошли при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг / мл на A375, HepG2 и A549, соответственно, в течение 48 часов лечения [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат MTT показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличивалась через 48 часов, больше, чем наблюдалась через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa было дозозависимым, как и у других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности снизился до 36,48 ± 1 для дозы лекарственного средства 840 мкг / мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% произошло при 722,6 ± 8,0 мкг / мл. За 48 ч инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности клеток снизился до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг / мл и 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при 575,5 ± 5,0 мкг / мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и PBMC) показали, что Conium имеет минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снизился до 85 ± 1,1 при обработке кониумом 840 мкг / мл в течение 48 часов, а для РВМС процент жизнеспособности снизился при более высоких дозах и составил 78,3 ± 2,4% при обработке кониумом 840 мкг / мл. на 48 часов.

Результат клоногенного анализа показал, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. После 24 и 48 ч обработки конием (450 мкг / мл) колониеобразующая способность снизилась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти данные позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний из клеток HeLa [].

Обработка конием уменьшала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла.

Обработка конием уменьшала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение Conium не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 ^-го часа лечения пролиферация клеток постепенно снижалась, и наименьшая пролиферация была достигнута через 48 часов лечения [].

Признак остановки клеточного цикла был обнаружен в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, указывая, таким образом, на то, что индукция фрагментации ДНК началась через 24 и 48 часов [].

Обработка конием инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Образование АФК: это зависящее от времени исследование выявило накопление АФК при лечении лекарственными препаратами (450 мкг / мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывает на накопление ROS.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию ММП. Исследования FACS показали, что смещение меток было в сторону оси Y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования.

Обработка конием деполяризовала потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения показали уменьшение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация была дозозависимой, и максимальная деполяризация наблюдалась при 450 мкг / мл обработки Conium [].

Обработка Conium вызвала морфологические изменения в клетках HeLa с нуклеосомной фрагментацией

Морфологические изменения наблюдались в клетках HeLa при обработке Conium с округлением периферии цитоплазмы и постепенным отрывом клеток от субстрата. Особенности включали образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдали в клетках, окрашенных AO / EB, по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], причем наибольшая степень фрагментации наблюдалась при дозе кониума 450 мкг / мл.

Определение апоптоза: клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium в течение 48 часов. (а) Морфологический анализ: результат показал образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO / EB: конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляют индукцию апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальное количество нуклеосомной фрагментации наблюдалось при дозе 450 мкг / мл Conium, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов обработки. Точечная диаграмма предполагала присутствие клеток с ранним апоптозом обработкой кониумом через 24 и 48 часов [верхний левый = мертвые клетки, нижний левый = живые клетки, верхний правый = поздние апоптотические клетки и нижний правый = ранние апоптотические клетки]. (e) Анализ фрагментации ДНК: присутствие фрагментации наблюдали в обработанных Conium клетках через 48 часов обработки.Фрагментация была наибольшей при максимальной дозе

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина через плазматическую мембрану с инициированием фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза проводилось путем оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V / PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг / мл). Клетки показали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на поверхности клетки [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, обработанной Conium [].

Обработка Conium модулировала экспрессию различных белков, связанных с пролиферацией и апоптозом клеток, в клетках HeLa.

Обработка Conium усиливала экспрессию определенных белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозе препарата 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно. Экспрессия Bax увеличивалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе лекарственного средства, а активность TNF-α также усиливалась обработкой Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно.Обработка кониумом увеличивала расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при максимальной дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 могут указывать на индукцию апоптоза в обработанных Conium клетках [].

(a) Вестерн-блоттинг: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt снижалась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась обработкой Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) ELISA-анализ: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции путем обработки лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет активность цитохрома с, выражающуюся в показателях оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Нативный Akt вместе с его активированной формой экспрессии pAkt подавлялся обработкой кониумом.Отношения pAkt / Akt уменьшились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг / мл обработки Conium, соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также подавлялась на ~ 23%, а экспрессия NFkB также подавлялась на ~ 28% при обработке Conium в клетках HeLa [Фиг.6]. GAPDH служил контролем загрузки [].

ELISA-анализ цитохрома c показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Спектральные изменения кругового дихроизма, индуцированные конием как в ct-ДНК, так и в HeLa ДНК

Результаты спектроскопии КД показали, что Conium может взаимодействовать с нативной B-конформацией ДНК как ct-ДНК [], так и ядерной ДНК [] обработанной Conium Клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В обработанной Conium ct-ДНК и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составили 262 (+4) и 255 (0), соответственно, а для отрицательных полос — 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие лекарств с ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (a) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения лекарства

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на наших первоначальных результатах, которые показали, что жизнеспособность клеток HeLa резко снижается, мы решили продолжить исследования на клетках HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что ДНК-таргетная терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. [20,21,22] Анализ CD-спектра выявил значительное изменение Conium на ДНК в бороздке. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, если предположить, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум активирует активность АФК в ранние часы в клетках HeLa.Это событие могло проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в обработанных Conium клетках. Обработка кониумом снижает жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени / дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением популяции клеток в квадранте аннексин V-положительный / PI-отрицательный, что подтверждает способность кония вызывать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 часов после обработки; одновременно, такое событие, как скорость роста клеток, снижалась с увеличением популяции клеток в фазе суб-G1 после обработки кониумом, что добавляет дополнительную поддержку роли кония в остановке деления клеток, демонстрируя его ингибирующее действие на рост раковых клеток. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком pAkt / Akt. [23] Введение лекарственного средства снижает уровень pAkt / Akt и, вероятно, вызывает состояние, которое приводит к снижению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, показывающих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа MTT также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы лекарственного средства, но такое состояние не наблюдалось в случае WRL-68 и PBMC. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO / EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV / PI. По нашим данным, увеличение популяции клеток, находящихся в раннем апоптозном состоянии (что проявляется в клетках с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных сериях, обработанных лекарствами.Таким образом, были четкие доказательства того, что лекарство может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после лечения.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать повышенную чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров, таких как р53. [13] Экспрессия р53 повышалась вместе с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. С остановкой роста экспрессия Akt / pAkt, важной для дифференцировки и пролиферации клеток молекулы [12], подавляется.Одна из гипотез, объясняющих это событие, может заключаться в том, что перекрестное взаимодействие p53-Akt имело место после индукции лекарственного средства.

Накопление АФК и деполяризация ММП — параллельные процессы [24], приводящие к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз по внутреннему пути. [26] В нашем исследовании деполяризация ММП происходила с увеличением цитозольного цитохрома с при лечении препаратом. Это может указывать на то, что раннее повышение ROS играет регуляторный механизм для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax повышается с помощью белка-супрессора опухолей p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпевал конформационный сдвиг, чтобы стать ассоциированным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз. [26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и может тем самым нейтрализовать его проапоптотический эффект.Следовательно, изменения уровней Bax и Bcl-2, то есть отношения Bcl-2 / Bax, являются решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток. [27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

ROS участвует в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α является фактором или рецептором, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ. [28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижнем [29] уровне. Наши результаты показали повышенную регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 в ее нижнем течении, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие лекарственного средства с ДНК и его способность вызывать апоптоз посредством генерации АФК

Реферат

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве традиционного лекарства от рака шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по тестированию его противоракового потенциала против клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кония вызывать цитотоксичность в различных линиях нормальных и раковых клеток, включая подробное исследование на клетках HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кония на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Могут ли Conium повредить ДНК и вызвать морфологические изменения, также определяли микроскопически. Экспрессия различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, была критически изучена методами вестерн-блоттинга и ELISA. Может ли Conium напрямую взаимодействовать с ДНК, было также определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД).

Результаты:

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и ингибирует пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии суб-G.Обработка кониумом приводит к увеличению генерации активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, увеличению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный путь, зависимый от каспазы-3. КД-спектроскопия показала, что Коний взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и подтверждают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарств и ДНК, пролиферация, активные формы кислорода

ВВЕДЕНИЕ

Conium maculatum — чрезвычайно ядовитый цветущий сорняк, известный как Hemlock и принадлежит к семейству Apiaceae. Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N, -метилкониин, конгидрин, псевдогидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на a. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого аналогичны никотину. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина. [2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт долгое время использовался как традиционное средство от различных заболеваний. [4] Например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичек. В гомеопатии он используется как лекарство от рака груди и рака шейки матки [4], но его действие еще не было научно подтверждено, за исключением сообщения о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы планируем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг / мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и PBMC и инкубировали в течение 48 часов. Далее 70-840 мкг / мл лекарств добавляли в культуру HeLa в течение 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев, чтобы оценить процент жизнеспособности клеток [Значение * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывает на снижение пролиферативных свойств клеток HeLa после обработки Conium в дозе 450 мкг / мл, а затем контрольных планшетов через различные интервалы времени. Наименьшая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток при M1 = суб-G1 состоянии клеточного цикла по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы ДНК-таргетная терапия приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК была связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтеза белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-ДНК), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Растительные экстракты считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов. [7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами допустимого предела обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. [8] АФК также деполяризует потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и вызывает апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, мы заинтересовались тем, чтобы изучить, имеет ли он какое-либо противораковое действие против клеток HeLa, может ли он производить АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками. [12] Следовательно, ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно обладать способностью подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазой обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК. [14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, этот подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью вызывать цитотоксичность в клетках HeLa, а также препятствует их пролиферации; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в цДНК и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать АФК и деполяризовать ММП, модулируя определенные сигнальные белки клетки, связанные с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические вещества и реагенты

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотики пенициллина, стрептомицина, неомицина (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальная бычья сыворотка (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) были получены от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для культивирования тканей были закуплены у Tarson (Индия). Акридиновый апельсин (АО) и бромид этидия (EB) были приобретены в SRL (Индия). 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ), пропидия иодид (PI), дихлор-дигидрофлуоресцеиндиацетат (H ₂ DCFDA), 4 ×, 6-диамидино-2- дигидрохлорид фенилиндола (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеина изотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

Клетки HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) были собраны из Национального центра клеточных исследований, Индия. Клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе (ESCO, Singapore) с кислородом окружающей среды и 5% уровнем углекислого газа при 37 ° C. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% PSN.Клетки собирали с 0,025% трипсин-ЭДТА в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), высевали на чашки с требуемым количеством клеток и оставляли для прилипания в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque стандартным методом и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и PBMC помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном для микротиттера (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 ³ клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм на ридере для ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium оказалась наиболее заметной и в подавляющем большинстве случаев выше у HeLa, чем у других линий раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял значительной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и PBMC. Следовательно, клетки HeLa были предпочтительнее других раковых клеток как наиболее подходящие материалы для проведения всех других экспериментов, связанных с его вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результата анализа МТТ были выбраны три различных дозы, а именно: D1 = 150 мкг / мл, D2 = 300 мкг / мл и D3 = 450 мкг / мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Набор положительного контроля (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разведения), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарственного средства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал какой-либо ощутимой разницы в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного препарата выбирали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa анализировали на цитотоксические эффекты Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарств в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), предварительно нагретым до 37 ° C, обрабатывали трипсином и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток / лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом. [16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и обрабатывали трипсином.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эту процедуру повторяли для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторяли три раза. После анализа данных была получена гистограмма пролиферации клеток.

Анализ клеточного цикла

Иодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление ROS количественно оценивали после инкубации 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 часов соответственно с 450 мкг / мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальной мембраны

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al . [6] После 48 ч инкубации, контроль и лечение (150, 300 и 450 мкг / мл Conium ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамином 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина 123 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США), а данные анализировали с использованием программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. После 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO / EB: для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы лекарственного средства (150, 300 и 450 мкг / мл Conium). После 48-часовой обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и AO / EB в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V / PI

Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали в течение 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI, соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно) клетки HeLa промывали PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг / мл) и протеиназа K (0,1 мг / мл)) в течение ночи, затем центрифугировали при 1200 g при 4 ° C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25: 24: 1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4 ° C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали из водного слоя с использованием 100% этанола и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избытка белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с использованием электрофореза в 1,5% агарозном геле, и полосы визуализировали под УФ-транс-осветителем с последующей цифровой фотографией.

Вестерн-блот-анализ

Клеток HeLa высевали в чашки диаметром 75 мм (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 ⁵ клеток на лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (150, 300 и 450 мкг / мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) обрабатывали 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. После блокирования 3% BSA мембраны отдельно инкубировали со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4 ° C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. BCIP-NBT использовался в качестве проявителя, а количественное определение белков было выполнено методом денситометрии с использованием программного обеспечения image J. [17]

Оценка активности цитохрома c с помощью непрямого ELISA

Для этого эксперимента клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома c измеряли с помощью ридера ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность цвета измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил геном домашнего хозяйства в этом анализе. [18]

Взаимодействие лекарств с ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были выполнены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК голых клеток тимуса теленка (ктДНК) с концентрацией лекарственного средства 450 мкл / мл с использованием необработанной цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия лекарственного средства с ДНК внутри клеток инкубацию проводили с конием в концентрации 450 мкл / мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора GeneiPure для очистки геномной ДНК млекопитающих, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственное средство-ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro [19].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорных тестов LSD с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения значимости различий между средними значениями различных групп.Результаты выражали в виде среднего значения ± стандартная ошибка (стандартная ошибка). * P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa к образованию колоний

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибели клеток произошли при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг / мл на A375, HepG2 и A549, соответственно, в течение 48 часов лечения [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат MTT показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличивалась через 48 часов, больше, чем наблюдалась через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa было дозозависимым, как и у других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности снизился до 36,48 ± 1 для дозы лекарственного средства 840 мкг / мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% произошло при 722,6 ± 8,0 мкг / мл. За 48 ч инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности клеток снизился до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг / мл и 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при 575,5 ± 5,0 мкг / мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и PBMC) показали, что Conium имеет минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снизился до 85 ± 1,1 при обработке кониумом 840 мкг / мл в течение 48 часов, а для РВМС процент жизнеспособности снизился при более высоких дозах и составил 78,3 ± 2,4% при обработке кониумом 840 мкг / мл. на 48 часов.

Результат клоногенного анализа показал, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. После 24 и 48 ч обработки конием (450 мкг / мл) колониеобразующая способность снизилась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти данные позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний из клеток HeLa [].

Обработка конием уменьшала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла.

Обработка конием уменьшала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение Conium не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 ^-го часа лечения пролиферация клеток постепенно снижалась, и наименьшая пролиферация была достигнута через 48 часов лечения [].

Признак остановки клеточного цикла был обнаружен в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, указывая, таким образом, на то, что индукция фрагментации ДНК началась через 24 и 48 часов [].

Обработка конием инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Образование АФК: это зависящее от времени исследование выявило накопление АФК при лечении лекарственными препаратами (450 мкг / мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывает на накопление ROS.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию ММП. Исследования FACS показали, что смещение меток было в сторону оси Y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования.

Обработка конием деполяризовала потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения показали уменьшение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация была дозозависимой, и максимальная деполяризация наблюдалась при 450 мкг / мл обработки Conium [].

Обработка Conium вызвала морфологические изменения в клетках HeLa с нуклеосомной фрагментацией

Морфологические изменения наблюдались в клетках HeLa при обработке Conium с округлением периферии цитоплазмы и постепенным отрывом клеток от субстрата. Особенности включали образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдали в клетках, окрашенных AO / EB, по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], причем наибольшая степень фрагментации наблюдалась при дозе кониума 450 мкг / мл.

Определение апоптоза: клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium в течение 48 часов. (а) Морфологический анализ: результат показал образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO / EB: конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляют индукцию апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальное количество нуклеосомной фрагментации наблюдалось при дозе 450 мкг / мл Conium, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов обработки. Точечная диаграмма предполагала присутствие клеток с ранним апоптозом обработкой кониумом через 24 и 48 часов [верхний левый = мертвые клетки, нижний левый = живые клетки, верхний правый = поздние апоптотические клетки и нижний правый = ранние апоптотические клетки]. (e) Анализ фрагментации ДНК: присутствие фрагментации наблюдали в обработанных Conium клетках через 48 часов обработки.Фрагментация была наибольшей при максимальной дозе

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина через плазматическую мембрану с инициированием фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза проводилось путем оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V / PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг / мл). Клетки показали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на поверхности клетки [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, обработанной Conium [].

Обработка Conium модулировала экспрессию различных белков, связанных с пролиферацией и апоптозом клеток, в клетках HeLa.

Обработка Conium усиливала экспрессию определенных белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозе препарата 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно. Экспрессия Bax увеличивалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе лекарственного средства, а активность TNF-α также усиливалась обработкой Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно.Обработка кониумом увеличивала расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при максимальной дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 могут указывать на индукцию апоптоза в обработанных Conium клетках [].

(a) Вестерн-блоттинг: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt снижалась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась обработкой Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) ELISA-анализ: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции путем обработки лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет активность цитохрома с, выражающуюся в показателях оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Нативный Akt вместе с его активированной формой экспрессии pAkt подавлялся обработкой кониумом.Отношения pAkt / Akt уменьшились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг / мл обработки Conium, соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также подавлялась на ~ 23%, а экспрессия NFkB также подавлялась на ~ 28% при обработке Conium в клетках HeLa [Фиг.6]. GAPDH служил контролем загрузки [].

ELISA-анализ цитохрома c показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Спектральные изменения кругового дихроизма, индуцированные конием как в ct-ДНК, так и в HeLa ДНК

Результаты спектроскопии КД показали, что Conium может взаимодействовать с нативной B-конформацией ДНК как ct-ДНК [], так и ядерной ДНК [] обработанной Conium Клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В обработанной Conium ct-ДНК и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составили 262 (+4) и 255 (0), соответственно, а для отрицательных полос — 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие лекарств с ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (a) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения лекарства

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на наших первоначальных результатах, которые показали, что жизнеспособность клеток HeLa резко снижается, мы решили продолжить исследования на клетках HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что ДНК-таргетная терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. [20,21,22] Анализ CD-спектра выявил значительное изменение Conium на ДНК в бороздке. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, если предположить, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум активирует активность АФК в ранние часы в клетках HeLa.Это событие могло проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в обработанных Conium клетках. Обработка кониумом снижает жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени / дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением популяции клеток в квадранте аннексин V-положительный / PI-отрицательный, что подтверждает способность кония вызывать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 часов после обработки; одновременно, такое событие, как скорость роста клеток, снижалась с увеличением популяции клеток в фазе суб-G1 после обработки кониумом, что добавляет дополнительную поддержку роли кония в остановке деления клеток, демонстрируя его ингибирующее действие на рост раковых клеток. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком pAkt / Akt. [23] Введение лекарственного средства снижает уровень pAkt / Akt и, вероятно, вызывает состояние, которое приводит к снижению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, показывающих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа MTT также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы лекарственного средства, но такое состояние не наблюдалось в случае WRL-68 и PBMC. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO / EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV / PI. По нашим данным, увеличение популяции клеток, находящихся в раннем апоптозном состоянии (что проявляется в клетках с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных сериях, обработанных лекарствами.Таким образом, были четкие доказательства того, что лекарство может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после лечения.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать повышенную чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров, таких как р53. [13] Экспрессия р53 повышалась вместе с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. С остановкой роста экспрессия Akt / pAkt, важной для дифференцировки и пролиферации клеток молекулы [12], подавляется.Одна из гипотез, объясняющих это событие, может заключаться в том, что перекрестное взаимодействие p53-Akt имело место после индукции лекарственного средства.

Накопление АФК и деполяризация ММП — параллельные процессы [24], приводящие к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз по внутреннему пути. [26] В нашем исследовании деполяризация ММП происходила с увеличением цитозольного цитохрома с при лечении препаратом. Это может указывать на то, что раннее повышение ROS играет регуляторный механизм для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax повышается с помощью белка-супрессора опухолей p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпевал конформационный сдвиг, чтобы стать ассоциированным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз. [26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и может тем самым нейтрализовать его проапоптотический эффект.Следовательно, изменения уровней Bax и Bcl-2, то есть отношения Bcl-2 / Bax, являются решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток. [27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).

ROS участвует в повышающей и понижающей регуляции некоторых про- и противовоспалительных белков, таких как NFkβ и TNF-α.TNF-α является фактором или рецептором, который, в свою очередь, активируется путем подавления NFkβ. [28] Этот активированный TNF-α, в свою очередь, активирует каспазу 3 на нижнем [29] уровне. Наши результаты показали повышенную регуляцию TNF-α после введения Conium и дальнейшую активацию каспазы 3 в ее нижнем течении, что подтолкнуло клетки HeLa к апоптозу.

Взаимодействие лекарственного средства с ДНК и его способность вызывать апоптоз посредством генерации АФК

Реферат

Цель:

Экстракт Conium maculatum используется в качестве традиционного лекарства от рака шейки матки, включая гомеопатию.Однако до сих пор не проводилось систематической работы по тестированию его противоракового потенциала против клеток рака шейки матки in vitro . Таким образом, в этом исследовании мы исследовали, способен ли этанольный экстракт кония вызывать цитотоксичность в различных линиях нормальных и раковых клеток, включая подробное исследование на клетках HeLa.

Материалы и методы:

Влияние кония на клеточный цикл, накопление активных форм кислорода (АФК), потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и апоптоз, если таковой имеется, анализировали с помощью проточной цитометрии.Могут ли Conium повредить ДНК и вызвать морфологические изменения, также определяли микроскопически. Экспрессия различных белков, связанных с гибелью и выживанием клеток, была критически изучена методами вестерн-блоттинга и ELISA. Может ли Conium напрямую взаимодействовать с ДНК, было также определено с помощью спектроскопии кругового дихроизма (КД).

Результаты:

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и образование колоний через 48 часов и ингибирует пролиферацию клеток, останавливая клеточный цикл на стадии суб-G.Обработка кониумом приводит к увеличению генерации активных форм кислорода (АФК) через 24 часа, увеличению деполяризации ММП, морфологическим изменениям и повреждению ДНК в клетках HeLa наряду с экстернализацией фосфатидилсерина через 48 часов. В то время как высвобождение цитохрома с и активация каспазы-3 приводили клетки HeLa к апоптозу, подавление Akt и NFkB ингибировало клеточную пролиферацию, указывая на то, что сигнальный путь опосредуется через митохондриально-опосредованный путь, зависимый от каспазы-3. КД-спектроскопия показала, что Коний взаимодействует с молекулой ДНК.

Заключение:

Общие результаты подтверждают противораковый потенциал Conium и подтверждают его использование в традиционных системах медицины.

Ключевые слова: Апоптоз, Conium maculatum , взаимодействие лекарств и ДНК, пролиферация, активные формы кислорода

ВВЕДЕНИЕ

Conium maculatum — чрезвычайно ядовитый цветущий сорняк, известный как Hemlock и принадлежит к семейству Apiaceae. Кониум содержит несколько пиридиновых алкалоидов, таких как кониин, N, -метилкониин, конгидрин, псевдогидрин и гамма-коницеин, предшественники некоторых других алкалоидов болиголова.[1] Структуры этих алкалоидов показаны на a. Среди них наиболее заметным является кониин, свойства которого аналогичны никотину. Он нарушает функции центральной нервной системы, связываясь с никотиновыми рецепторами ацетилхолина. [2,3] Хотя это растение очень токсично по своей природе, его экстракт долгое время использовался как традиционное средство от различных заболеваний. [4] Например, Conium — основное средство от предстательной железы и отека яичек. В гомеопатии он используется как лекарство от рака груди и рака шейки матки [4], но его действие еще не было научно подтверждено, за исключением сообщения о том, что он может вызывать повреждение ДНК, генерируя активные формы кислорода (АФК).[5] В этом исследовании мы планируем выяснить вероятный механизм действия препарата в индукции апоптоза в клеточной линии рака шейки матки HeLa.

(a) Химическая структура основных алкалоидов, присутствующих в Conium. (b) Процент жизнеспособности клеток: 70-840 мкг / мл лекарственного средства добавляли к A375, A549, HepG2, WRL-68 и PBMC и инкубировали в течение 48 часов. Далее 70-840 мкг / мл лекарств добавляли в культуру HeLa в течение 24 и 48 часов. Анализ МТТ был выполнен для всех случаев, чтобы оценить процент жизнеспособности клеток [Значение * P <0.05 по сравнению с контрольной группой]. (c) Клоногенный анализ: обработка Conium снижает способность клеток HeLa образовывать колонии. (d) Анализ пролиферации: это указывает на снижение пролиферативных свойств клеток HeLa после обработки Conium в дозе 450 мкг / мл, а затем контрольных планшетов через различные интервалы времени. Наименьшая пролиферация достигается через 48 часов лечения. (e) Анализ клеточного цикла: в обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток при M1 = суб-G1 состоянии клеточного цикла по сравнению с контрольным набором, что указывает на индукцию фрагментации ДНК после 24 и 48 часов

В последние годы ДНК-таргетная терапия приобрела большое значение, и способность лекарства взаимодействовать с ДНК была связана с его способностью препятствовать процессу клеточной репликации и синтеза белка, что в конечном итоге приводит к остановке роста клеток и апоптоз.[6] В этом исследовании мы попытались оценить, обладает ли Conium способностью взаимодействовать либо с ДНК голого тимуса теленка (ct-ДНК), либо с клеточной ДНК клеток HeLa, которые ранее не изучались.

Растительные экстракты считаются богатым источником алкалоидов и флавоноидов. [7] У них есть возможность генерировать ROS. Чрезмерное накопление АФК за пределами допустимого предела обычно подталкивает раковые клетки к апоптотическому каскаду. [8] АФК также деполяризует потенциал митохондриальной мембраны (ММП) и вызывает апоптоз.[9] Поскольку кониум является богатым источником алкалоидов [10,11], которые, как сообщается, обладают противораковыми свойствами, мы заинтересовались тем, чтобы изучить, имеет ли он какое-либо противораковое действие против клеток HeLa, может ли он производить АФК и вызывать деполяризация митохондриальной мембраны.

События гибели и роста клеток контролируются определенными сигнальными белками. [12] Следовательно, ожидается, что любое антипролиферативное лекарство должно обладать способностью подавлять активность этих сигнальных молекул, чтобы препятствовать процессу роста раковых клеток.[13] Альтернативно, апоптоз тесно опосредуется различными антиапоптотическими и апоптогенными белками. Расщепление каспазой обычно инициирует апоптоз с последующей индукцией фрагментации ДНК. [14] В этом исследовании мы попытались оценить способность Conium модулировать определенные сигнальные белки, связанные с апоптозом и пролиферацией; насколько нам известно, этот подход не применялся ни в одном из предыдущих исследований.

Таким образом, в настоящем исследовании необходимо проверить следующие гипотезы: (i) Conium обладает способностью вызывать цитотоксичность в клетках HeLa, а также препятствует их пролиферации; (ii) Conium действует как ДНК-связывающий агент, вызывая конформационные изменения в цДНК и клеточной ДНК обработанных лекарством клеток HeLa; и (iii) Conium может накапливать АФК и деполяризовать ММП, модулируя определенные сигнальные белки клетки, связанные с апоптозом и пролиферацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Химические вещества и реагенты

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), RPMI-1640 и антибиотики пенициллина, стрептомицина, неомицина (PNS) были приобретены у HiMedia (Индия). Фетальная бычья сыворотка (FBS), трипсин и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) были получены от Gibco BRL (США). Пластиковые изделия для культивирования тканей были закуплены у Tarson (Индия). Акридиновый апельсин (АО) и бромид этидия (EB) были приобретены в SRL (Индия). 3- (4,5-Диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ), пропидия иодид (PI), дихлор-дигидрофлуоресцеиндиацетат (H ₂ DCFDA), 4 ×, 6-диамидино-2- дигидрохлорид фенилиндола (DAPI) и родамин 123 и вторичные антитела были получены от Sigma (США).Аннексин V-флуоресцеина изотиоцианат (FITC) и первичные антитела были получены от Santacruz Biotechnology Inc. (США).

Клеточная культура

Клетки HeLa, A375, HepG2, A549 (все линии раковых клеток) и WRL-68 (нормальной печени) были собраны из Национального центра клеточных исследований, Индия. Клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе (ESCO, Singapore) с кислородом окружающей среды и 5% уровнем углекислого газа при 37 ° C. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% PSN.Клетки собирали с 0,025% трипсин-ЭДТА в фосфатном буферном солевом растворе (PBS), высевали на чашки с требуемым количеством клеток и оставляли для прилипания в течение необходимого времени перед обработкой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC; нормальные клетки крови здоровых мышей) немедленно выделяли градиентным центрифугированием в Ficoll-Hypaque стандартным методом и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и еще раз RPMI-1640.

Анализ жизнеспособности клеток

HeLa, A375, HepG2, A549, WRL-68 и PBMC помещали в 96-луночные планшеты с плоским дном для микротиттера (Tarson, Индия) при плотности 1 × 10 ³ клеток на лунку .Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (от 70 до 800 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Затем в каждую лунку добавляли раствор МТТ (10 мкМ) и инкубировали в течение 3 ч при 37 ° C. Образовавшиеся нерастворимые кристаллы формазана растворяли в 100 мкл кислого изопропанола и измеряли оптическую плотность при 595 нм на ридере для ELISA (Thermo Scientific, США) [15]. Из всех линий раковых клеток цитотоксичность Conium оказалась наиболее заметной и в подавляющем большинстве случаев выше у HeLa, чем у других линий раковых клеток.Кроме того, он также не проявлял значительной цитотоксичности в отношении нормальных клеток, таких как WRL-68 и PBMC. Следовательно, клетки HeLa были предпочтительнее других раковых клеток как наиболее подходящие материалы для проведения всех других экспериментов, связанных с его вероятным механизмом действия и сигнальным путем, участвующим в индукции апоптоза.

Выбор доз

В зависимости от результата анализа МТТ были выбраны три различных дозы, а именно: D1 = 150 мкг / мл, D2 = 300 мкг / мл и D3 = 450 мкг / мл. Перед экспериментальной обработкой препарат разводили в среде DMEM.Набор положительного контроля (носитель лекарственного средства) получал только разбавленный этанол (0,48% после разведения), в то время как отрицательный контроль не получал ни лекарственного средства, ни этанола. Поскольку положительный контроль не показал какой-либо ощутимой разницы в результатах по сравнению с отрицательным контролем, мы отказались от отрицательного контроля и сохранили положительный контроль только для сравнения результатов. Время инкубации лекарственного препарата выбирали в зависимости от требований конкретного эксперимента.

Анализ образования колоний

Клетки HeLa анализировали на цитотоксические эффекты Conium после выживания клеток в соответствии с установленными методами проведения клоногенного анализа.Субконфлюэнтные культуры подвергали воздействию лекарств в течение 6 часов. Затем клетки промывали PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), предварительно нагретым до 37 ° C, обрабатывали трипсином и высевали в 6-луночные планшеты (100 клеток / лунку). После 12 дней инкубации в полной культуральной среде колонии окрашивали красителем Гимзы после фиксации 2% параформальдегидом. [16]

Анализ пролиферации

Для проведения анализа пролиферации клеток обработанные клетки собирали через различные интервалы от 0 до 48 часов, дважды промывали PBS и обрабатывали трипсином.Затем клеточную суспензию переносили в гемоцитометр для подсчета клеток. Эту процедуру повторяли для всех образцов в каждый момент времени, и эксперименты повторяли три раза. После анализа данных была получена гистограмма пролиферации клеток.

Анализ клеточного цикла

Иодид пропидия (PI) использовали для анализа клеточного цикла. Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК. К ним добавляли 5 мкМ PI и инкубировали 20 мин в темноте.Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью FL-2H для PI.

Обнаружение накопления активных форм кислорода

Накопление ROS количественно оценивали после инкубации 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 и 48 часов соответственно с 450 мкг / мл Conium; клетки фиксировали 70% охлажденным этанолом, а затем инкубировали с 10 мкМ DCHFDA в течение 30 мин на холоде и в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H, а данные анализировали с помощью программного обеспечения Cyflogic.

Анализ изменений потенциалов митохондриальной мембраны

ММП измеряли как качественно, так и количественно, как описано Bishayee et al . [6] После 48 ч инкубации, контроль и лечение (150, 300 и 450 мкг / мл Conium ) клетки фиксировали 2% параформальдегидом, а затем инкубировали с 10 мкМ родамином 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте. Клетки немедленно анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, клетки фиксировали в 70% этаноле и инкубировали в 10 мкМ родамина 123 в течение 30 мин при 37 ° C в темноте.Для определения ММП интенсивность флуоресценции родамина 123 оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием фильтра FL-1H (BD FACS Calibur, США), а данные анализировали с использованием программного обеспечения Cyflogic.

Морфологический анализ клеток

Для этого исследования клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно. Контрольная группа не получала никаких препаратов. После 48 ч инкубации клетки HeLa наблюдали под инвертированным фазово-контрастным микроскопом (Leica, Германия), снабженным цифровой камерой, и делали фотографии.

Анализ ядерной морфологии

Окрашивание DAPI и AO / EB: для этого эксперимента были выбраны одна контрольная и три дозы лекарственного средства (150, 300 и 450 мкг / мл Conium). После 48-часовой обработки клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Затем клетки окрашивали DAPI и AO / EB в концентрации 10 мкМ каждый и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Leica, Германия).

Анализ аннексина V / PI

Клетки обрабатывали 450 мкг / мл Conium в течение 24 и 48 часов. Затем клетки фиксировали 70% этанолом и освобождали от РНК.К ним добавляли 10 мкМ аннексина V и 5 мкМ PI и инкубировали в течение 20 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции измеряли с использованием FL-1H и FL-2H для аннексина V и PI, соответственно.

Анализ фрагментации ДНК

Контрольные и обработанные (150, 300 и 450 мкг / мл Conium, соответственно) клетки HeLa промывали PBS и инкубировали с буфером для лизиса ДНК (10 мМ Трис, 400 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% Triton X-100, РНКаза (0,2 мг / мл) и протеиназа K (0,1 мг / мл)) в течение ночи, затем центрифугировали при 1200 g при 4 ° C.Затем супернатанты смешивали со смесью фенол-хлороформ-изоамил (25: 24: 1) и двухслойную смесь центрифугировали при 1500 g, 4 ° C в течение 15 минут. Затем ДНК осаждали из водного слоя с использованием 100% этанола и растворяли в 20 мкл буфера Трис-ЭДТА (10 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 1 мМ ЭДТА). Экстрагированную ДНК дополнительно очищали с использованием протеиназы К и РНКазы А для вычитания избытка белков и РНК соответственно. Очищенную ДНК разделяли с использованием электрофореза в 1,5% агарозном геле, и полосы визуализировали под УФ-транс-осветителем с последующей цифровой фотографией.

Вестерн-блот-анализ

Клеток HeLa высевали в чашки диаметром 75 мм (Tarson, Индия) с плотностью 1 × 10 ⁵ клеток на лунку. Клетки обрабатывали различными концентрациями Conium (150, 300 и 450 мкг / мл соответственно) и инкубировали в течение 48 часов. Равные количества белка (50 мкг) обрабатывали 12,5% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на PVDF-мембрану. После блокирования 3% BSA мембраны отдельно инкубировали со специфическими первичными антителами (p53, Bcl-2, Bax, TNF-α, PARP, Caspase3, Akt, pAkt, NFΚβ и GAPDH) в течение ночи при 4 ° C.Мембрану снова инкубировали в течение 2 ч с вторичным антителом, конъюгированным с ALKP. BCIP-NBT использовался в качестве проявителя, а количественное определение белков было выполнено методом денситометрии с использованием программного обеспечения image J. [17]

Оценка активности цитохрома c с помощью непрямого ELISA

Для этого эксперимента клетки HeLa обрабатывали различными дозами Conium (150, 300 и 450 мкг / мл) и инкубировали в течение 48 часов. Анализ проводили согласно протоколу производителя (Santa Cruz Biotechnology Inc, США).Уровень белковой активности цитохрома c измеряли с помощью ридера ELISA. PNPP (п-нитрофенилфосфат) использовали в качестве проявителя цвета, и интенсивность цвета измеряли при 405 нм относительно холостого опыта. G3PDH служил геном домашнего хозяйства в этом анализе. [18]

Взаимодействие лекарств с ДНК

Для оценки взаимодействия кония и ядерной ДНК были выполнены два режима исследования; первое взаимодействие проверяли на ДНК голых клеток тимуса теленка (ктДНК) с концентрацией лекарственного средства 450 мкл / мл с использованием необработанной цтДНК в качестве контроля; во-вторых, для измерения взаимодействия лекарственного средства с ДНК внутри клеток инкубацию проводили с конием в концентрации 450 мкл / мл в течение 3 часов.После 3-часовой инкубации клетки собирали, их ДНК экстрагировали и очищали с использованием набора GeneiPure для очистки геномной ДНК млекопитающих, Индия. Собранную ДНК использовали для анализа спектров КД для определения (JASCO J720, Япония) взаимодействия лекарственное средство-ДНК, если таковое имеется, с использованием программного обеспечения Origin 8 Pro [19].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорных тестов LSD с использованием программного обеспечения SPSS.14 для определения значимости различий между средними значениями различных групп.Результаты выражали в виде среднего значения ± стандартная ошибка (стандартная ошибка). * P <0,05 считалось значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Обработка кониумом снижает жизнеспособность клеток и способность клеток HeLa к образованию колоний

В нашем первоначальном исследовании с различными линиями раковых клеток было обнаружено, что Conium снижает жизнеспособность A375, HepG2 и A549. 50% гибели клеток произошли при дозах 657,7 ± 6,8, 616,6 ± 6,3 и 730,1 ± 6,9 мкг / мл на A375, HepG2 и A549, соответственно, в течение 48 часов лечения [].

Однако было обнаружено, что цитотоксичность значительно выше в отношении клеток HeLa. Результат MTT показал, что цитотоксичность Conium ощутимо увеличивалась через 48 часов, больше, чем наблюдалась через 24 часа лечения. Снижение жизнеспособности клеток HeLa было дозозависимым, как и у других клеточных линий, которые мы использовали. При 24-часовой инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности снизился до 36,48 ± 1 для дозы лекарственного средства 840 мкг / мл, а снижение жизнеспособности клеток на 50% произошло при 722,6 ± 8,0 мкг / мл. За 48 ч инкубации лекарственного средства процент жизнеспособности клеток снизился до 36.93 ± 0,2 для дозы препарата 840 мкг / мл и 50% снижение жизнеспособности клеток произошло при 575,5 ± 5,0 мкг / мл [].

Результаты МТТ для нормальных клеточных линий (WRL-68 и PBMC) показали, что Conium имеет минимальную цитотоксичность через 48 часов лечения []. В случае WRL-68 процент жизнеспособности снизился до 85 ± 1,1 при обработке кониумом 840 мкг / мл в течение 48 часов, а для РВМС процент жизнеспособности снизился при более высоких дозах и составил 78,3 ± 2,4% при обработке кониумом 840 мкг / мл. на 48 часов.

Результат клоногенного анализа показал, что Conium может снижать колониеобразующую способность клеток HeLa. После 24 и 48 ч обработки конием (450 мкг / мл) колониеобразующая способность снизилась до 55,5% и 58,8% соответственно по сравнению с контролем (100%). Эти данные позволяют предположить, что Conium обладает способностью предотвращать образование колоний из клеток HeLa [].

Обработка конием уменьшала пролиферацию клеток и вызывала остановку клеточного цикла.

Обработка конием уменьшала рост клеток по сравнению с контрольными наборами.В первые часы лечение Conium не влияло на клеточную пролиферацию, но после 9 ^-го часа лечения пролиферация клеток постепенно снижалась, и наименьшая пролиферация была достигнута через 48 часов лечения [].

Признак остановки клеточного цикла был обнаружен в клетках, обработанных Conium. В обработанных наборах (450 мкг / мл Conium) наблюдалось резкое увеличение популяции клеток в состоянии суб-G1 по сравнению с контрольным набором, указывая, таким образом, на то, что индукция фрагментации ДНК началась через 24 и 48 часов [].

Обработка конием инициировала накопление ROS в клетках HeLa

Результат анализа DCHFDA показал, что обработка Conium инициировала накопление ROS. Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения [].

(a) Образование АФК: это зависящее от времени исследование выявило накопление АФК при лечении лекарственными препаратами (450 мкг / мл Conium). Внезапный сдвиг гистограммы наблюдался между 18 и 24 часами лечения, что указывает на накопление ROS.(b) Потенциал митохондриальной мембраны: интенсивность флуоресценции постепенно снижалась по сравнению с дозами Conium, что указывает на постепенную деполяризацию ММП. Исследования FACS показали, что смещение меток было в сторону оси Y по сравнению с контролем, что подтверждает результаты микроскопического исследования.

Обработка конием деполяризовала потенциалы митохондриальной мембраны

Флуоресцентные изображения показали уменьшение поляризации митохондриальной мембраны. Деполяризация была дозозависимой, и максимальная деполяризация наблюдалась при 450 мкг / мл обработки Conium [].

Обработка Conium вызвала морфологические изменения в клетках HeLa с нуклеосомной фрагментацией

Морфологические изменения наблюдались в клетках HeLa при обработке Conium с округлением периферии цитоплазмы и постепенным отрывом клеток от субстрата. Особенности включали образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium []. Интенсивность флуоресценции наблюдали в клетках, окрашенных AO / EB, по сравнению с контрольными клетками []. Конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляли индукцию апоптоза в обработанных клетках по сравнению с контролем.Фрагментация нуклеосом была подтверждена окрашиванием DAPI [], причем наибольшая степень фрагментации наблюдалась при дозе кониума 450 мкг / мл.

Определение апоптоза: клетки HeLa обрабатывали 150, 300 и 450 мкг / мл Conium в течение 48 часов. (а) Морфологический анализ: результат показал образование пузырей на клеточной мембране и сокращение клеток в клетках, обработанных Conium. (b) Окрашивание AO / EB: конденсация ядер и изменение цвета фрагментированных ядерных мембран с зеленого на красновато-оранжевый представляют индукцию апоптоза обработанных клеток по сравнению с контролем.(c) Окрашивание DAPI: максимальное количество нуклеосомной фрагментации наблюдалось при дозе 450 мкг / мл Conium, на что указывает более яркая интенсивность флуоресценции. (d) Анализ аннексина V: наличие апоптотических клеток наблюдали через 48 часов обработки. Точечная диаграмма предполагала присутствие клеток с ранним апоптозом обработкой кониумом через 24 и 48 часов [верхний левый = мертвые клетки, нижний левый = живые клетки, верхний правый = поздние апоптотические клетки и нижний правый = ранние апоптотические клетки]. (e) Анализ фрагментации ДНК: присутствие фрагментации наблюдали в обработанных Conium клетках через 48 часов обработки.Фрагментация была наибольшей при максимальной дозе

Кониум-индуцированная экстернализация фосфатидилсерина через плазматическую мембрану с инициированием фрагментации ДНК в клетках HeLa

Количественное измерение апоптоза проводилось путем оценки экстернализации фосфатидилсериновой части. Анализ FACS с аннексином V / PI проводили как через 24, так и через 48 часов обработки Conium (450 мкг / мл). Клетки показали отчетливое положительное связывание с аннексином V при обработке группой, обработанной Conium, что указывает на экстернализацию фосфотидилсерина на поверхности клетки [].

Результат анализа фрагментации ДНК также свидетельствует об инициации фрагментации клеточной ДНК в группе, обработанной Conium [].

Обработка Conium модулировала экспрессию различных белков, связанных с пролиферацией и апоптозом клеток, в клетках HeLa.

Обработка Conium усиливала экспрессию определенных белков, связанных с апоптозом. Экспрессия р53 повышалась на 19%, 37% и 45% при дозе препарата 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно. Экспрессия Bax увеличивалась на 12%, 23% и 24% при той же дозе лекарственного средства, а активность TNF-α также усиливалась обработкой Conium на 72%, 82% и 86% при дозах 150, 300 и 450 мкг / мл соответственно.Обработка кониумом увеличивала расщепление белка PARP дозозависимым образом. При расщеплении PARP активность каспазы 3 также увеличивалась примерно в 3 раза при максимальной дозе препарата. События расщепления PARP и активации каспазы 3 могут указывать на индукцию апоптоза в обработанных Conium клетках [].

(a) Вестерн-блоттинг: при обработке Conium активность p53, Bax, TNF-α и каспазы 3 повышалась, а экспрессия Bcl-2, NFkB, Akt и pAkt снижалась. Экспрессия расщепленного PARP увеличивалась обработкой Conium в течение 48 часов.GAPDH использовали в качестве контроля загрузки. (b) ELISA-анализ: активность цитохрома-c повышалась в цитоплазматической фракции путем обработки лекарственным средством в течение 48 часов. Ось абсцисс представляет активность цитохрома с, выражающуюся в показателях оптической плотности. Значимость * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Были некоторые белки, активность которых подавлялась обработкой кониумом. Они обладают свойством препятствовать апоптозу. Нативный Akt вместе с его активированной формой экспрессии pAkt подавлялся обработкой кониумом.Отношения pAkt / Akt уменьшились и составили 1, 1,02, 0,79 и 0,76 для контроля, 150, 300 и 450 мкг / мл обработки Conium, соответственно. С Akt, другим антиапоптотическим белком, экспрессия Bcl-2 также подавлялась на ~ 23%, а экспрессия NFkB также подавлялась на ~ 28% при обработке Conium в клетках HeLa [Фиг.6]. GAPDH служил контролем загрузки [].

ELISA-анализ цитохрома c показал его повышенную активность в клетках, обработанных Conium, в зависимости от дозы [].

Спектральные изменения кругового дихроизма, индуцированные конием как в ct-ДНК, так и в HeLa ДНК

Результаты спектроскопии КД показали, что Conium может взаимодействовать с нативной B-конформацией ДНК как ct-ДНК [], так и ядерной ДНК [] обработанной Conium Клетки HeLa.Ядерная ДНК ct-ДНК и HeLa показала положительную полосу при 258 и 255 нм и отрицательную полосу при 366 и 310 нм соответственно. В обработанной Conium ct-ДНК и ядерной ДНК HeLa сдвиги пиков для положительных полос составили 262 (+4) и 255 (0), соответственно, а для отрицательных полос — 375 (+9) и 303 (-7). Такие изменения могут быть результатом структурных изменений, вызванных Conium в двойной спиральной структуре ДНК.

Взаимодействие лекарств с ДНК: Conium может взаимодействовать с ct-ДНК (a) и с клеточной ДНК в течение 3 часов после введения лекарства

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на наших первоначальных результатах, которые показали, что жизнеспособность клеток HeLa резко снижается, мы решили продолжить исследования на клетках HeLa для оценки механизма действия Conium, включая его способность взаимодействовать с ДНК, вызывая в них апоптоз.Между прочим, недавно было доказано, что ДНК-таргетная терапия является эффективной мерой для разработки противоопухолевых препаратов благодаря ее ингибирующей роли в пролиферации клеток. [20,21,22] Анализ CD-спектра выявил значительное изменение Conium на ДНК в бороздке. режим привязки. Таким образом, цитотоксичность можно объяснить, если предположить, что она может ингибировать нормальный процесс синтеза ДНК и подталкивать раковые клетки к апоптозу. Настоящее исследование также показало, что кониум активирует активность АФК в ранние часы в клетках HeLa.Это событие могло проявляться морфологическими изменениями и фрагментацией ДНК в обработанных Conium клетках. Обработка кониумом снижает жизнеспособность и образование колоний в зависимости от времени / дозы с образованием гиподиплоидных клеток и увеличением популяции клеток в квадранте аннексин V-положительный / PI-отрицательный, что подтверждает способность кония вызывать апоптоз. клеток HeLa в течение 48 часов после обработки; одновременно, такое событие, как скорость роста клеток, снижалась с увеличением популяции клеток в фазе суб-G1 после обработки кониумом, что добавляет дополнительную поддержку роли кония в остановке деления клеток, демонстрируя его ингибирующее действие на рост раковых клеток. .Между прочим, пролиферация в основном усиливается белком pAkt / Akt. [23] Введение лекарственного средства снижает уровень pAkt / Akt и, вероятно, вызывает состояние, которое приводит к снижению клеточного роста раковых клеток.

Накопление АФК в клетках также может быть причиной снижения скорости пролиферации клеток. Эти события могли привести к проявлению морфологических изменений отделяющихся клеток, показывающих конденсированный и фрагментированный хроматин.Результаты анализа MTT также показали, что жизнеспособность раковых клеток постепенно снижалась с увеличением дозы лекарственного средства, но такое состояние не наблюдалось в случае WRL-68 и PBMC. Анализ феномена апоптоза был дополнительно подтвержден данными DAPI, окрашивания AO / EB, фрагментации ДНК и анализа AnnexinV / PI. По нашим данным, увеличение популяции клеток, находящихся в раннем апоптозном состоянии (что проявляется в клетках с ярко-оранжевым хроматином с сильно конденсированными и фрагментированными клеточными границами) с фрагментированной клеточной ДНК, было отмечено в различных сериях, обработанных лекарствами.Таким образом, были четкие доказательства того, что лекарство может вызывать клеточные события, способствующие апоптотической активности клеток в течение 48 часов после лечения.

Остановка клеточного цикла и ингибирование роста могут вызвать повышенную чувствительность клетки к большему количеству белков-супрессоров, таких как р53. [13] Экспрессия р53 повышалась вместе с остановкой клеточного цикла и ингибированием роста. С остановкой роста экспрессия Akt / pAkt, важной для дифференцировки и пролиферации клеток молекулы [12], подавляется.Одна из гипотез, объясняющих это событие, может заключаться в том, что перекрестное взаимодействие p53-Akt имело место после индукции лекарственного средства.

Накопление АФК и деполяризация ММП — параллельные процессы [24], приводящие к выбросу цитохрома с в цитоплазму [25], который инициирует апоптоз по внутреннему пути. [26] В нашем исследовании деполяризация ММП происходила с увеличением цитозольного цитохрома с при лечении препаратом. Это может указывать на то, что раннее повышение ROS играет регуляторный механизм для инициации апоптоза митохондриально-зависимым образом.

Экспрессия Bax повышается с помощью белка-супрессора опухолей p53, и было показано, что Bax участвует в p53-опосредованном апоптозе. Bax был обнаружен в цитозоле, но после инициации апоптотической передачи сигналов он претерпевал конформационный сдвиг, чтобы стать ассоциированным с митохондриальной мембраной. Это приводит к высвобождению цитохрома с и других проапоптотических факторов из митохондрий, что приводит к активации каспаз. [26] С другой стороны, было показано, что Bcl-2 образует гетеродимер с проапоптотическим Bax и может тем самым нейтрализовать его проапоптотический эффект.Следовательно, изменения уровней Bax и Bcl-2, то есть отношения Bcl-2 / Bax, являются решающим фактором, который играет важную роль в определении того, будут ли клетки подвергаться апоптозу, ведущему к гибели клеток. [27] Наши результаты показали, что уровень Bcl-2 снижался с увеличением уровня Bax, что указывает на активацию внутреннего пути апоптоза (гибель клеток 1-го типа).