Антиоксиданты — это соединения, которые ингибируют или задерживают начало окисления и могут быть классифицированы как природные или синтетические [30]. Растет потребность в природных антиоксидантах для лечения и профилактики заболеваний, что указывает на то, что соединения в натуральных составах более активны, чем их изолированные формы [31]. За последние годы произошло много изменений в лечении аллергического ринита с использованием лекарств в различных традиционных лекарственных системах [32, 33]. Ряд научных исследований доказали, что связь между антиоксидантами и аллергическими заболеваниями, и прием антиоксидантов, по-видимому, оказывает защитное действие на аллергические заболевания, такие как ринит [34–36].Таким образом, в этом исследовании мы изучили антиоксидантную активность четырех препаратов, чтобы выявить наиболее сходную антиоксидантную активность с TD (Таблица 3). TD продемонстрировал самую высокую антиоксидантную активность с точки зрения способности улавливать радикалы DPPH, антиоксидантной способности восстановления железа и общего содержания фенолов и флавоноидов (Таблица 3). Кроме того, среди модифицированных лекарственных форм FDF-TD показал лучшую антиоксидантную активность и более близок к таковой для TD. Причина снижения антиоксидантной активности SDF-TD и GSF-TD может быть связана с температурой, используемой при обработке лекарственного средства.Результаты недавних исследований показали, что температура влияет на антиоксидантную активность растительных материалов, а разложение термочувствительных соединений, как сообщается, сводится к минимуму при низкой температуре [37]. Кроме того, температура влияла на общее содержание флавоноидов и фенолов в растении, которые вносят основной вклад в активность по улавливанию радикалов [38-40]. Среди четырех препаратов общее содержание флавоноидов и фенолов имеет высокое содержание TD, и поэтому он показал большую активность по улавливанию радикалов DPPH, чем три модифицированных препарата.Также результаты антиоксидантного анализа показали, что значение FRAP является самым высоким в FDF-TD. Аналогичные результаты наблюдались на лиофилизированных образцах листьев и ягод Cayratia trifolia [41] и листьев мяты курчавой [42]. Это может быть связано с образованием кристаллов льда внутри тканевого матрикса во время процесса сублимационной сушки, которые могут разрушить клеточную структуру, что делает возможным выход клеточных компонентов и доступ растворителя [43]. Следовательно, он может проявлять больше антиоксидантной активности в среде.

48 148,2 ± 0. Экстракт DPPH активность улавливания свободных радикалов (IC 50 ; μ FRAP г / мл) 9014 мг экстракта) TPC (мг GAE / г экстракта) TFC (мг QE / г экстракта) Отвар Tamalakyadi 8,2 ± 0. 572.5 ± 2. 206,0 ± 2. 8,2 ± 0. Лиофилизированная форма отвара Тамалакьяди 10,6 ± 0. 634,2 ± 1. 6,2 ± 0. Отвар Тамалакьяди, высушенный распылением 20,8 ± 0. 154,8 ± 1. 63,8 ± 2 2,9 ± 0. Ганасара Форма отвара Тамалакьяди 17.9 ± 0. 222,4 ± 1. 69,5 ± 0. 2,9 ± 0. Trolox (стандартный) 5,35 ± 0,2 — — — —

Результаты представлены как Среднее ± SEM (n = 4). Значения с разными скриптами P≤ 0,05 значительно отличаются друг от друга. TE : эквиваленты Trolox, GAE : эквиваленты галловой кислоты, QE : эквиваленты кверцетина.

4. Заключение

Фитохимические исследования, образцы ВЭТСХ и антиоксидантные исследования показали, что FDF-TD больше похож на TD, который был приготовлен традиционным методом. Следовательно, FDF-TD можно использовать в качестве новой лекарственной формы для лечения аллергического ринита. Однако для дальнейшего подтверждения необходима клиническая оценка.

Доступность данных

Данные, использованные для подтверждения выводов этого исследования, можно получить у соответствующего автора по запросу.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Этот проект финансировался Комиссией по грантам университетов Шри-Ланки (UGC / VCDRIC / PG2016 (II) / IIM / 02, 02.02.2017).

Традиционная китайская медицина: от водных экстрактов до лечебных формул

2. От водных экстрактов до лечебных формул

2.1. История традиционной китайской медицины

Астрономия, арифметика, агрономия и традиционная медицина были наиболее развитыми областями науки Древнего Китая.Традиционная китайская медицина (ТКМ) — одна из старейших систем лечения в мире с тысячелетней историей. Сюда входят фитотерапия, медицина для животных, иглоукалывание, прижигание [традиционная китайская медицина, при которой используется сушеная полынь (или другие травы), пригоревшие на коже или рядом с ней для ускорения заживления], лечебный массаж, пищевая терапия и физические упражнения [16]. Сегодня TCM все еще используется в Китае и других азиатских странах, таких как Япония, Корея, Сингапур и Малайзия. Традиционная китайская медицина — одна из наиболее важных известных систем альтернативного лечения, которая в настоящее время получает все большее признание и более широкое распространение в западном мире.В отчете Департамента здравоохранения Тайваня за 2009 год говорится, что примерно 28% населения старше 15 лет хотя бы раз принимали лечение традиционной китайской медициной [17]. Одним из ключевых примеров является лечение болезни Альцгеймера с использованием традиционной китайской медицины, такой как Ji-Sheng-Shen-Qi-Wan, Ma-Zi-Ren-Wan и Tian-Wang-Bu-Xin-Dan. Эти лекарства обычно используются для лечения психических расстройств и заболеваний нервной системы, включая болезнь Альцгеймера [18]. Клинические испытания фармакологической активности Тянь-Ван-Бу-Синь-Дан показывают, что он может снижать уровень интерлейкина-6 (ИЛ-6) и фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α) у пожилых пациентов с деменцией и нарушениями сна. , таким образом демонстрируя измеримый эффект на биохимические маркеры [19].

В древнем Китае влияние многих медицинских материалов определялось дегустацией, а вкус трав был разделен на пять вкусов (острый, сладкий, кислый, горький и соленый), каждый из которых представлял разные свойства лекарства [20 ]. Со временем люди узнали больше о целебных свойствах трав и научились использовать их для лечения различных заболеваний; например, Coptis chinensis (Huang lian 黄 连), который, как известно, имеет горький вкус, использовался для лечения диареи [21].В легенде Янь Ди Шен Нонг организовал дегустацию сотен трав и часто отмечал ядовитые эффекты. Таким образом, были накоплены обширные знания об активности и токсичности, и после многих испытаний были зарегистрированы и обобщены применения эффективных лекарств, что привело к самым ранним записям традиционной китайской медицины (рис. 2). Две из самых ранних книг по китайской медицине, «Хуан-ди-ней-цзин» (770–221 до н. развитие ТКМ в долгой истории Китая [23].

Рис. 2.

Хронология некоторых древних китайских книг по медицине [22].

Отвар трав, самый важный метод приготовления в китайской медицине, был впервые изобретен и получил дальнейшее развитие между 2000 и 474 годами до нашей эры. Медицинские ингредиенты были экстрагированы путем кипячения в воде или спирте с особым временем приготовления, которое зависит от свойств ингредиентов. После этого отвар фильтровали, а полученную жидкость принимали пациенты. В современном Китае метод отварки по-прежнему является наиболее часто используемым методом традиционной китайской медицины [24].

В традиционной китайской медицине большая часть диагностики заболеваний и принципы медицинского применения основаны на особой китайской философии, которая соответствует конфуцианству и даосизму [25]. Теория традиционной китайской медицины относится к Инь и Ян, пяти элементам, цзанфу, каналам-коллатералям, ци, крови, жидкостям организма, методам диагностики, дифференциации симптомокомплексов и т. Д. Инь и Ян являются противоположными и взаимодополняющими сторонами природы. во Вселенной, и, согласно китайской философии, все можно описать Инь и Ян (рис. 3) [16].В традиционной китайской медицине Инь относится к материальным аспектам организма, а Ян — к функциям. Это интерпретация, согласно которой болезнь вызвана дисбалансом Инь и Ян в человеческом теле. Смысл китайской медицины состоит в том, чтобы вернуть Инь и Ян в равновесие, что приводит к общему здоровью и излечению от болезни [24].

Рис. 3.

Теория инь и ян [26].

Кроме того, согласно древнекитайской теории, все во Вселенной состоит из пяти элементов (металла, дерева, воды, огня и земли) (рис. 4).Все органы и ткани были отнесены к разным элементам, различающимся по своим свойствам [20]. Это особая китайская теория систем, которая составляет основу традиционной китайской медицины. Китайская медицина сильно отличается от западной медицины, и методология лечения заболеваний не может быть объяснена так же, как в современной медицине, поскольку это вид лечения, основанный на опыте и особой философии [25].

Рисунок 4.

Принцип пятиэлементной системы (У син 五行) [27].

После 1950-х годов начались передовые исследования традиционной китайской медицины, которые были направлены на удовлетворение потребностей растущего китайского населения, а также на достижение стандартов безопасности, эффективности и качества западной медицины [28]. В 1970-х годах Youyou Tu был вдохновлен книгой о традиционной китайской медицине «Чжоу-Хоу-Бей-Цзи-Фан» (317–420 гг. Н.э.), в которой было описано извлечение Artemisia carvifolia (Qing hao 青蒿). с водой для приготовления отвара, который использовался для лечения симптомов малярии. Это привело ее к выделению артемизинина из растения Цин хао.Артемизинин был успешно протестирован для лечения эпидемических заболеваний, включая малярию, в Китае, что в конечном итоге привело к присуждению Youyou Tu Нобелевской премии в 2015 году [29].

С течением времени ТКМ поставлялась во все более разнообразных составах, помимо отваров, таких как вина, пилюли и пластыри. В настоящее время на рынок поступают модернизированные формулы, такие как гранулы, жидкости для перорального применения, капсулы, растворенные лекарства и мази. Эти современные составы производятся небольшим числом, в настоящее время шестью, одобренными государством фармацевтическими предприятиями [30].Китай представил концепцию «интернационализации традиционной китайской медицины» в 1996 году для решения проблем устойчивого производства и содействия экспорту и международной торговле, и в результате требования к качеству, безопасности и нормативным требованиям для традиционной китайской медицины привлекли все большее внимание международного сообщества и способствовали формированию с этой целью работают международные консорциумы (например, GP-TCM; http://www. gp-tcm.org/) [31].

2.2. Травяная медицина Даоди

Даоди — это термин, уникальный для традиционной китайской медицины, и он зарезервирован для лекарственных растений, выращиваемых в определенной географической зоне с определенными природными условиями, собираемых и обрабатываемых в соответствии со стандартами.«Дао» относится к единицам измерения округов в древнем Китае, а «ди» относится к земле, земле или почве. В древней Материи медике «Синь-Сю-Бен-Цао» говорится, что медицинская эффективность будет другой, если лекарственный материал не будет выращен в естественной среде [32]. Медицинский материал Даоди на протяжении веков считался передовым лекарством и признан таковым современной фармацевтической промышленностью ТКМ (рис. 5). По наблюдениям автора за растительным материалом Daodi Houttuynia cordata и не-Daodi Houttuynia cordata , материал Daodi более яркий и менее плотный.В Китайской фармакопее (2015) признано, что 284 различных вида растительного сырья традиционной китайской медицины имеют спецификации Daodi из всего 584 широко используемых лекарственных растений [7].

Рис. 5.

Коммерческие продукты TCM: (A) Houttuynia cordata (Yu xing cao 鱼腥草). (B) Radix Dioscoreae oppositae (Shan yao 山药). (C) Кусочки отвара Daodi Houttuynia cordata. (D) Кусочки отвара не Даоди Houttuynia cordata.

Знания и опыт TCM выросли за тысячелетия клинического опыта, что привело к открытию и пониманию различных свойств растительного материала, которые зависят от их качества и часто зависят от источника.Самое раннее описание определенных регионов для выращивания лекарственных растений восходит к поздней династии Восточная Хань (25–220 гг. До н.э.) и было записано в «Шен-Нонг-Бен-Цзин» (рис. 6). В книге говорится, что свойства лекарственных растений варьируются от региона к региону [32]. Во времена династии Мин (1368–1644 гг. До н.э.) концепция Даоди была первоначально описана в Materia medica «Бен-Цао-Пин-Хуэй-Цзин-Яо» [33].

Рис. 6.

Древние тексты TCM: (A) «Шен-Нун-Бен-Цао-Цзин».(B) «Бен-Цао-Ган-Му» [34, 35].

В то время детали, относящиеся к производственному региону, фиксировались очень простыми и базовыми описаниями, например, «растет в горных долинах, речных долинах или болотах». По мере накопления опыта и знаний древние люди стали называть некоторые лекарственные растения названиями регионов, например, Radix Morindae officinalis (Ba ji tian 巴戟 天) или Crotonis fructus (Ba dou 巴豆) [36] . «Ба» было названием провинции Сычуань, поэтому область Даоди в Бадоу и Бацзитянь называется Сычуань.В 420 г. до н.э. в книге «Бен-Цао-Цзин-Цзи-Чжу» было ясно сказано, что термин «Цзуй цзя», что в переводе с китайского означает «лучший», должен использоваться для описания внешнего вида и качества растений. выращивается в определенных регионах. Позже, во времена династии Тан, термин «король медицины» применялся для описания лучшего лекарства, которое записано в книге «Бэй-Цзи-Цянь-Цзинь-Яо-Фан (Цянь-Цзинь-Фан)», а вскоре и затем Сунь simiao в своей книге под названием «Синь-Сю-Бен-Цао» создал термин Даоди [32].

В древние времена китайцы обнаружили, что мандарин, производимый к югу от реки Хуай, имеет сладкий вкус; однако мандарины, выращенные на севере реки Хуай, были горькими.Хотя листья и внешний вид были похожи, вкус был совершенно другим. Таким образом, древние китайцы знали о том, что географические изменения могут влиять на активность растительного материала, используемого в традиционной китайской медицине [32]. Характеристики растений определяются генетикой; однако разнообразные формы рельефа и погодные условия в Китае привели к возникновению различных экосистем, которые внесли свой вклад в разнообразие происхождения зародышевой плазмы растений [37]. Кроме того, конкретные экологические условия, такие как топография, почва, климат, влажность и свет, также влияют на количество вторичных метаболитов растений, что приводит к различной биоактивности конкретного травяного материала. Таким образом, сочетание географического положения и специфической зародышевой плазмы привело к превосходному качеству медицинского материала Даоди [38].

В первой современной монографии лекарственного материала Даоди в Китайской Фармакопее (1953 г.) 159 различных лекарственных материалов классифицированы по 8 категориям в соответствии с различными производственными регионами в Китае (рис. 7): Чуань (Сычуань), Гуан ( Гуан дон / Гуан си), Юнь (Юнь нань), Гуй (Гуй чжоу), Нан (Южный Китай), Бэй (Северный Китай), Чжэ (Чжэ цзян) и Хуай (Хэ нань).Интересные примеры включают Liguisticum chuanxiong Hort. (Chuan xiong 川芎), который принадлежит материалу Chuan Daodi medica, потому что провинция Сычуань является родным регионом для выращивания и, как известно, имеет самый большой объем производства и самую долгую историю медицинского применения Chuan xiong. Liguisticum chuanxiong Hort. резюме. Fuxiong (Fu xiong 付 芎) производится в провинции Цзянси и имеет крупные мясистые корневища, похожие на Daodi Chuan Xiong; однако химическим анализом было показано, что он содержал меньше эфирного масла, что привело к различной биоактивности [39]. Женьшень является одним из самых известных и дорогих растительных материалов традиционной китайской медицины, а регион производства женьшеня Даоди находится на северо-востоке Китая. В 1958 году женьшень выращивали на острове Хайлань в Южном Китае, что привело к появлению крупных корней, в которых отсутствовали биологически активные компоненты [32]. За последние 10 лет химические компоненты эфирного масла в корневищах и корнях Notopterygium incisum Ting (Qiang huo 羌活) из разных регионов были исследованы с помощью GC. В образце Сычуань Даоди было идентифицировано и количественно определено 769 соединений, которые показали значительные различия в химическом составе образцов, которые были произведены в других географических регионах, не относящихся к Даоди [40].

Рис. 7.

Карта лекарств Даоди, производимых в 10 регионах Китая [24].

В настоящее время, в связи с возросшей потребностью в лекарственных травах для здоровья, включая пищевые добавки, нутрицевтики и средства по уходу за кожей, признано, что регион Даоди не может производить достаточное количество растительных материалов для удовлетворения рыночного спроса [41]. С 2002 года правительство Китая делает упор на Надлежащую сельскохозяйственную практику (GAP) выращивания лекарственных материалов, которая направлена ​​на расширение регионов производства.Согласно отчету Европейской комиссии о надлежащей практике традиционной китайской медицины в 2012 г., лекарственным растениям Даоди, а также новым лекарствам Даоди будет разрешено появиться [42]. Например, Daodi Radix Salviae miltiorrhizae (Dan shen 丹参), который культивировался исключительно в провинции Сычуань, в настоящее время производится на крупных стандартизированных плантациях в провинции Шаньси, не относящейся к Даоди, современными фармацевтическими компаниями, специализирующимися на традиционной китайской медицине [32]. Фармацевтическая компания Tasly была первой, одобренной GAP, в Китае для крупномасштабной стандартизированной плантации [43].Годжи (плоды Lycium barbarum L. и Lycium chinense Mill), который тысячелетиями применялся в традиционной китайской медицине для лечения дисбаланса инь, в настоящее время пользуется повышенным спросом, так как он также считается «суперпродуктом» и рекомендован как мощный антиоксидант в западном мире [44, 45]. Провинция Нинся признана регионом Даоди для Годжи, но растущий рынок привел к появлению новых культур в других регионах, таких как провинции Хубэй, Цинхай и Синьцзян, где географические и климатические условия отличаются от региона Даоди.Годжи, произведенный из этих регионов, также имеет очень высокое качество, но отличается по количеству метаболитов, таких как полисахариды, флавоноиды, бетаин и каротиноиды [46]. Таким образом, все еще сложно достичь цели GAP. В группе Яо изучали антиоксидантную активность Даоди Годжи и не Даоди Годжи, и было определено, что значения IC50 эффекта улавливания радикалов для обеих групп лечения Годжи были даже выше, чем в группе положительного контроля, которую лечили кверцетином. Примечательно, что Daodi Goji показывает самую высокую антиоксидантную активность из всех протестированных материалов в этом исследовании [44].

Лекарственный материал Даоди играет важную роль в лечении традиционной китайской медицины, но его высокое качество еще не было адекватно объяснено современной наукой [47]. Сравнение материалов Даоди и других материалов было изучено в основном с точки зрения биоактивных ингредиентов или состава, свойств почвы, геологической фоновой системы (GBS) и некоторых методологий идентификации для оценки атрибутов Даоди, которые могут быть тесно связаны с производством биоактивных ингредиентов [33 ].Однако превосходное качество, безопасность и эффективность продуктов Daodi еще предстоит исследовать. Текущие исследования продуктов Даоди сосредоточены на идентификации и аутентификации видов в регионе Даоди, установлении и внедрении критериев коммерческой спецификации и стандартизации плантаций и обработки [48]. Следовательно, существует необходимость в дальнейших исследованиях традиционной китайской медицины для установления многих факторов, влияющих на эффективность медицинских материалов Даоди.

2.3. Выращивание в сравнении со сбором урожая в дикой природе

Сообщается, что в Китае имеется наибольшее количество лекарственных трав: в 2016 году было использовано примерно 11 146 растений [49]. Традиционная китайская медицина основана на ресурсах диких лекарственных трав, и в 2015 году было заявлено, что они составляют примерно 80% от общих ресурсов китайских трав [11]. Для удовлетворения растущего спроса на внутреннем и мировом рынке, а также для достижения устойчивого использования лекарственных трав были созданы некоторые проекты по расширению масштабов выращивания трав традиционной китайской медицины [49].Более того, естественное лесоразведение, которое ближе к заготовке в дикой природе, но отличается от консервативного искусственного выращивания, рекомендуется применять для производства некоторых лекарственных трав, таких как Fritillaria cirrhosa (Chuan bei mu 川贝 母) , Radix Ginseng ( Ren shen 人参) и Huang lian, , но цена намного выше, чем у выращивания [50]. Ожидается, что выращивание лекарственных трав удовлетворит рыночный спрос и снизит экологическое давление, вызываемое сбором урожая в дикой природе.Результаты выращивания показывают, что этот подход подходит для некоторых травяных материалов, а внешний вид и эффективность очень близки к травам, собранным в дикой природе. Однако высокие первоначальные затраты могут быть связаны с созданием особой среды, необходимой для массового выращивания, но признаются экономические и экологические преимущества выращивания по сравнению со сбором урожая в дикой природе [51].

Тем не менее, постоянное качество трав, полученных в результате искусственного выращивания и сбора дикорастущих растений, по-прежнему является проблемой для большинства трав традиционной китайской медицины, поскольку на качество, безопасность и эффективность лекарственных трав могут повлиять различия в выращивании.Например, активными компонентами Ranunculus ternatus являются полисахариды, концентрация которых значительно варьируется между образцами, собранными в естественных условиях и в дикой природе, 10 и 14% соответственно [52]. Для решения проблем искусственного культивирования требуются стандартные рабочие процедуры, которые включают отбор зародышевой плазмы, разведение, удобрение, орошение, борьбу с вредителями и ограничение токсичных веществ, чтобы улучшить качество традиционной китайской медицины, близкое к качеству трав, собранных в дикой природе [53 ].В «Руководстве по надлежащей сельскохозяйственной практике китайского сырого лекарственного сырья» подробно описаны стандарты GAP для четырех лекарственных трав, женьшеня, , годжи, Radix glycyrrhizae (Gan cao 甘草) и yu xing cao [54].

Выращивание и сбор дикорастущих растений имеют свои достоинства и недостатки. При выращивании плодородие почвы оказывает значительное влияние на урожайность основных химических компонентов в растительных материалах, а отсутствие стандартов плодородия почвы приведет к неуверенной биомассе и качеству производства лекарственных трав.Стандарты плодородия почвы должны включать текстуру почвы, плотность, содержание влаги, кислотность почвы, содержание азота и фосфора, а также количество микроорганизмов. При сборе урожая в дикой природе качество лекарственных трав определяется такими факторами, как идентификация, время сбора, методы сбора и транспортировка. Методы сбора урожая должны избегать повреждения собранного материала и окружающих трав. Идеальное количество собранного травяного материала должно быть рассмотрено и сбалансировано с научной точки зрения, чтобы обеспечить устойчивость.Период сбора урожая важен, поскольку эффективный химический состав трав меняется в зависимости от сезона и климата, что влияет на биологическую активность отваров, полученных из растительного сырья [50, 55]. В ближайшие годы необходимо будет рассмотреть влияние глобального потепления на выращивание, устойчивость и качество растений, и эта тема изучается в Кью-Гарден (https://www.kew.org/science/projects/chinese-medicinal-plants- and-their-materia-medica).

Сбор урожая в дикой природе можно считать «сокровищем природы», так как материал поступает из природных ресурсов без добавления пестицидов. Кроме того, для большинства лекарственных трав лучше всего используются дикорастущие растения, а получаемые в результате отвары обладают более сильным действием. Однако перегрузка лесозаготовок вызывает дисбаланс в экологической среде и угрожает количеству диких ресурсов особенно редких или исчезающих видов. Codonopsis pilosula (Dang shen 党参), Dan shen, Radix isatidis seu Baphcacanthi (Ban lan gen 板蓝根), женьшень и Coptis chinensis (Huang lian 黄 连) являются одними из основных трав, выращиваемых в разных регионах. Китай [50].Без сомнения, политика управления и практика добычи природных ресурсов в дикой природе требуют дальнейшего развития, если мы хотим достичь целей устойчивого снабжения этим ресурсом.

В заключение, выращивание лекарственного растительного материала снижает воздействие на окружающую среду, вызванное обширным сбором урожая в дикой природе, а также может защитить стандартизованные генотипы видов, способствуя устойчивому производству и использованию китайских лекарственных трав. Выращивание также имеет экономическую выгоду, поскольку появляются новые отрасли и модели занятости, которые гарантируют поставки для расширяющихся и значительных китайских и / или мировых рынков.Однако одним из негативных последствий является сокращение естественного разнообразия генофонда ресурсов дикой природы из-за стандартизации методов массового выращивания [49]. Разумный баланс выращивания, сбора дикорастущих растений и естественного лесоразведения в конечном итоге будет лучшей моделью и будет способствовать устойчивости ресурсов трав традиционной китайской медицины (Рисунок 8).

Рис. 8.

Сбор урожая в дикой природе, естественное лесоразведение и культивирование способствуют устойчивости ресурсов китайских лекарственных трав [56, 57, 58, 59].

2.4. Паожи

Паожи — это уникальная традиционная технология обработки, которая отличает традиционную китайскую медицину от западной фитотерапии. Продукты переработки после Паожи известны как кусочки отвара [60]. Под руководством теории традиционной китайской медицины и в соответствии со свойствами лекарственных растений сырые лечебные травы обрабатываются для достижения терапевтических целей традиционной китайской медицины [8]. В теории традиционной китайской медицины считается, что болезнь вызвана дисбалансом Инь и Ян, и древние китайцы верят, что процедура обработки может регулировать «Ци» (тепло, тепло, холод и прохладу) сырых травяных лекарств [ 61], чтобы уравновесить баланс Инь и Ян в человеческом теле.

Способы обработки у разных лекарственных растений обычно разные, и это связано с природой материала, например, Radix (корень), корневище (корневище или боковой корень), herba (трава , целое растение) и flos ( цветок ) и цель их клинического применения. Основная цель Паожи — повысить эффективность и снизить токсичность [60]. Например, Radix Aconiti kusnezofii (Cao Wu tou tou 草乌 头) обрабатывается для снижения токсичности для безопасного использования путем пропаривания или кипячения с Radix glycyrrhizae (Gan cao 甘草) и Semen Sojae hispidae (Hei dou 黑豆). Паожи также применяется для удаления неприятных запахов и привкусов лекарственных растений, например, Herba sargassii (Hai zao 海藻) обрабатывается ополаскиванием чистой водой. Большинство трав нарезают, бреют или измельчают, что удобно для приготовления, хранения и фармацевтического производства [62].

Механизм обработки Paozhi можно объяснить прямым уменьшением токсичного содержания и компонентов, структурной трансформацией компонентов и влиянием вспомогательных веществ (рис. 9).Большинство китайских лекарственных трав (CHMs) необходимо обработать перед использованием в клинической терапии. В Китайской фармакопее (2015) кусочки отвара и соответствующие методы обработки изложены в конкретных главах CHM, а некоторые кусочки отвара зарегистрированы с особыми стандартами контроля качества и показаниями, такими как Radix Astragalimbranacei (Huang qi 黄 芪) , что способствует усилению иммунного ответа [63].

Рис. 9.

org/1998/Math/MathML» xmlns:xlink=»http://www.w3.org/1999/xlink» xmlns:xsi=»http://www.w3.org/2001/XMLSchema-instance»> Паожи обработал образцы корней и коры.(A) Radix sanguisorba Officinalis L. (Di yu 地榆). (B) Феллодендрон китайский Шнейд (Хуанг бай 黄 柏).

Самое раннее описание Паочжи восходит к 200 г. до н.э., а классические методы, включая сжигание, тушение и замачивание с вином и уксусом, были записаны в «У-Ши-Эр-Бинг-Фан» [60]. Во времена династии Мин (1368–1644 гг. Н.э.) методы обработки, согласно Паожи, процветали и становились более изощренными и творческими, поскольку в обработку лекарственных трав были введены различные дополнительные вспомогательные вещества [64].Позже, в первой монографии о методах обработки «Лэй-Гонг-Пао-Чжи-Лунь» (примерно в V веке), были записаны методы обработки Паожи 268 материалов традиционной китайской медицины, из которых 178 лекарств были приготовлены с вспомогательными веществами (Таблица 1 ). Они соответствуют теории «семи отношений совместимости» в системе теории TCM [65]. Когда два или более ТКМ на травах объединяются в одну формулу, применяется «совместимость с семью отношениями», что очень важно для Паочжи. Например, «xiang wei» означает, что одно лекарственное средство на травах может снизить токсичность другого лекарства, поэтому токсичное лекарственное средство на травах Rhizoma arisaematis Preparatum (Tian nan xing 天南星) традиционно обрабатывается имбирем для снижения его токсичности в целях клинической безопасности.Исследования химических изменений в обработанном Тянь Наньсин показали, что уровни оксалата кальция, который признан токсичным веществом, были снижены на 50% по сравнению с сырым растительным материалом [66]. В 1662 году методы обработки 439 китайских лекарств были описаны в Материи медике «Пао-Чжи-Да-Фа». При династии Цин монография о методе Паочжи была записана в книге «Синь-Ши-Чжи-Нан», которая охватывала многие классические методы из долгой истории обработки лекарственных трав [67].

Таблица 1.

Часто используемые методы Паожи с примерами лекарств [61].

Обработка — это способ преобразования натуральных лекарств в ТКМ физическими или химическими методами. Обработка также увеличивает эффективность и / или снижает присущую токсичность. Основные методы обработки включают в себя различные методы, такие как очистка, нарезка, измельчение, обжарка, кипячение, выпечка и жарка с перемешиванием, с жидкими / твердыми наполнителями или без них [8]. «Чао» по-китайски означает жаркое. Чистые и нарезанные материалы обжаривают при перемешивании до тех пор, пока не будет наблюдаться изменение цвета на желтый, или они могут быть либо обугленными, либо «карбонизированными».Карбонизированный в «чао» относится к кусочкам отвара, которые черные снаружи и коричневые внутри. Эти три стадии обработки представляют собой разную степень «Чао» и предполагают разную медицинскую эффективность. Например, Crataegi fructus (Shan zha 山楂) используется для улучшения пищеварения, которое может быть разделено на эти три этапа. Желтый «Чао» шань чжа обычно используется для лечения расстройства желудка, а обугленный «Чао» шань чжа используется при диарее, тогда как карбонизированный «Чао» шань чжа используется при желудочно-кишечном кровотечении (рис. 10).

Рис. 10.

Три различных метода обработки Paozhi фруктовых ломтиков (кусочков отвара) Crataegi Fructus (Shan zha 山楂): (A) Желтый «Чао» (обжаривается до тех пор, пока не станет желтым) ). (B) Обугленный «Чао» (обжаривать до тех пор, пока цвет не станет коричневым). (C) Карбонизированный «Чао» (обжаривать до тех пор, пока цвет не изменится на черный снаружи и коричневый внутри).

«Жи» означает жаркое с жидкими вспомогательными веществами. Чистый и разрезанный материал обжаривают с жидкостью, такой как уксус, соленая вода, мед, желтое рисовое вино или имбирный соус, что позволяет жидкости впитаться в медицинский материал.Например, хорошо известно, что Radix Angelicae sinensis (Dang gui 当归) улучшает кровообращение в организме человека, и этот эффект усиливается, когда Dang gui жарят с желтым рисовым вином. Химический анализ обработанного Radix Angelicae sinensis показывает значительные различия в количестве феруловой кислоты и Z-лигустилида, и доказано, что эти химические вещества влияют на агрегацию тромбоцитов [68].

«Чжэн» означает приготовление на пару, которое может изменить свойства различных лекарственных трав.Например, Radix polygoni Multiflora (He shou wu 何首乌) пропитывают соусом из черной фасоли, затем варят на пару в емкости для цветных металлов, пока цвет не изменится на коричневый, затем нарезают на кусочки и сушат на солнце. Сырой хэ шоу ву используется из-за его противомалярийных свойств, в то время как «чжи» хэ шоу ву имеет различные терапевтические показания, включая улучшение функции почек, почернение волос и укрепление костей. Фармакокинетические исследования типичных компонентов обработанного Radix polygoni Multiflora с помощью LC-ESI-MS / MS показывают, что метод обработки может улучшить биодоступность чесночной кислоты и снизить абсорбцию 2,3,5,4′-тетрагидроксистильбена-2- O-β-d-глюкозид (PM-SG), ресвератрол и эмодин в плазме крови крыс [69].

Различные методы обработки по-разному влияют на лекарственные травы, что способствует разнообразной медицинской деятельности и снижению токсичности. Например, Radix et Rhizoma rhei (Da huang 大黄) обычно обрабатывается четырьмя классическими методами, которые описаны в Китайской фармакопее (2015). Сюда входят «шэн» да хуан (сушеное сырье), «чжи» да хуанг (жарка с вином), «чжэн» да хуан (приготовление на пару с вином) и карбонизированный «чао» да хуан (жарка с перемешиванием до карбонизации). (Рисунок 11).Каждый из этих четырех обработанных продуктов Da huang имеет различные медицинские эффекты. «Sheng» Da huang часто используется при запоре в клинической практике, а «Zhi» Da huang эффективен при гематемезисе, головной и зубной боли. Химически это можно объяснить разложением конъюгированных антрахинонов на соответствующие свободные антрахиноны. «Чжи» Да хуанг действует при запорах; однако эффект более слабый, чем у «Шэн» Да хуан, который улучшает кровообращение, и это может быть результатом снижения содержания дубильных веществ. Карбонизированный «Чао» да хуанг оказывает влияние на гемостаз при гематохезии и не влияет на кровообращение [70].

Рис. 11.

Примеры да хуан, обработанных разными методами и примененных для разных показаний. * Да хуанг тан используется редко, поэтому изображение недоступно.

В настоящее время разница между обработанными и непереработанными лекарствами изучается современными научными аналитическими методами. Например, Radix aconiti (Chuan wu 川乌) является важным лекарственным средством на травах, которое имеет долгую историю применения в традиционной китайской медицине, поскольку имеет широкий спектр медицинских эффектов, таких как противовоспалительные и обезболивающие.Однако необработанный чуань ву очень токсичен и вызывает значительную нейро- и кардиотоксичность. Чуань ву обрабатывают кипячением и сушкой [61]. Комплексные метаболомные характеристики необработанных и обработанных образцов были исследованы методом ЖХ-МС, который выявил конкретные изменения метаболитов. В этом исследовании 22 ключевых биомаркера были связаны с детоксикацией путем обработки. Диэфирдитерпеновые алкалоиды (DDA) и токсичные моноэфирные дитерпеновые алкалоиды (MDA) были идентифицированы как основные компоненты, которые были восстановлены этим методом обработки для Chuan wu [71].Содержание магноло и гонокиола из Cortex magnoliae Officinalis (Hou pu) снизилось на 14 и 40%, соответственно, после обработки путем обжаривания с имбирем, и образовался новый компонент гингерол [40, 72]. Растворимость активных компонентов может быть улучшена для повышения эффективности путем обработки, например, Huang lian, традиционно используемого при зубной боли, заболеваниях печени или воспалениях, и может обрабатываться путем жарки с перемешиванием с вином, уксусом, солью, желчью или Fructus evodiae (У чжу ю).Химический анализ обработанного Huang lian показывает, что содержание алкалоидов различается в зависимости от метода обработки, но все они выше, чем в непереработанном материале, а жарка с вином приводит к максимальному содержанию [73].

Было обнаружено, что тритерпеновые сапонины являются основными биологически активными компонентами женьшеня, который обладает антиоксидантной, антидиабетической, иммуномодулирующей, противовоспалительной и противораковой активностью [74]. После обработки паром и сушки химические профили обработанного и непереработанного женьшеня заметно различаются.Структурная трансформация гинсенозидов в обработанном женьшене, который, как было доказано, обладает более высокой биоактивностью, способствует его повышенной эффективности [61]. На растворимость влияет обработка и добавление вспомогательных веществ, таких как вино, мед, уксус, соленая вода и имбирный сок. Наполнители могут вступать в реакцию с компонентами лечебных трав и могут оказывать влияние на активные компоненты, например, сообщалось, что имбирный сок сам по себе обладает противовоспалительным действием, что способствует детоксикационному эффекту обработанного Rhizoma pinelliae Tematae (Ban xia 半夏) .Следовательно, обработка может привести к уменьшению количества токсичных компонентов, структурной трансформации и улучшению растворимости активных компонентов.

Помимо даоди, Паочжи также играет важную роль в традиционной китайской медицине, влияя на качество, безопасность и эффективность медицинских материалов. Существует постоянная потребность в междисциплинарных исследованиях, чтобы полностью оценить эффекты этих практик, чтобы лучше понять их влияние на химические отпечатки терапевтических отваров и на механизм действия полученных ТКМ [60].В разных регионах Китая методы обработки TCM различаются; например, белое рисовое вино обычно используется в провинции Хунань, а желтое рисовое вино используется в провинциях Фуцзянь, Аньхой и Гуанси. Сегодня в Китае по-прежнему нет единообразия в практике обработки. Гонконг является международным центром TCM, и большая часть отваров TCM в западном мире импортируется из Гонконга. Сообщается, что 66% из 365 видов отварных частей TCM обычно используемых TCM перерабатываются на месте в Гонконге, где методы обработки отличаются от методов обработки на материковой части Китая.Такие различия могут привести к эффекту бабочки, что не удалось ускользнуть от Sheridan et al. [8] и может привести к очень разным терапевтическим эффектам, связанным с окончательной ТКМ. Для глобального развития традиционной китайской медицины требуются согласованные и стандартизированные методы обработки [75].

В последние годы изучение Паочжи сосредоточено на понимании и подтверждении традиционного аспекта обработки. Химические профили обработанных лекарственных трав исследуются методами анализа ЯМР, ГХ и ЖХ-МС, а метаболомные профили изучаются с помощью химических маркеров.Кроме того, токсичность или побочные эффекты могут возникать в результате неправильных методов обработки, и поэтому важна стандартизация методов обработки для TCM. Представляется целесообразным, чтобы при модернизации традиционной китайской медицины значительный химический состав и фармакологические показания использовались в качестве маркеров оценки, должен быть установлен стандарт контроля качества для усиления GMP обработанных продуктов, оптимизации процедуры процесса и стандартизации качества, безопасности и качества. эффективность кусочков отвара.

2.5. Совместимость с семью отношениями

В TCM можно комбинировать несколько трав, используя до 20 трав в одной формуле, что дает очень сложные отвары. Такая сложная формула называется по-китайски Фанцзи, и она корректируется для каждого отдельного пациента в соответствии с теорией традиционной китайской медицины. Иногда отдельные травы используются для приготовления лечебных отваров, и, например, Radix Astragalimbranacei (Huang qi 黄 芪) используется сам по себе для лечения заболеваний легких. Комбинация трав в одной формуле находится под руководством «семи отношений совместимости» (таблица 2), которая включает в себя следующее: «взаимное подчеркивание», «взаимное усиление», «взаимное противодействие», «взаимное подавление», « «взаимный антагонизм» и «взаимная несовместимость» между двумя травами.Кроме того, отдельные травы могут использоваться в рамках «семи соотношений совместимости» в «индивидуальном применении» для лечения определенных заболеваний [76].

Таблица 2.

Объяснение и применение «семи отношений совместимости» [24].

2.6. Fangji

Fangji определяется как формула, состоящая из нескольких трав с интегрированным лечебным действием, и основана на теории «Цзюнь Чен Цзо Ши» [3]. Одна формула традиционной китайской медицины обычно состоит из четырех различных видов лечебных трав, которые называются «цзюнь», «чен», «цзо» и «ши» (рис. 12).Каждый из них играет свою роль в формуле. Все эти лекарственные травы гармонично работают вместе для достижения терапевтического эффекта и восстановления баланса Инь и Ян в организме человека [77]. В системе теории формул традиционной китайской медицины «джун» означает «хозяин» и обеспечивает основной терапевтический эффект при заболевании; и «чен» представляет «советника», который функционирует как второй главный лекарственный компонент, поддерживая медицинскую эффективность лекарства «джун». «Цзо» представляет «солдат» и применяется для лечения сопутствующих симптомов или снижения токсичности лекарства «цзюнь». «Ши» представляет собой «проводника», который может направлять другие лекарства к больному органу или способствовать гармонии всех трав в формуле [3]. Например, Radix glycyrrhizae (Gan cao) является наиболее часто используемым лекарством «ши», поскольку его сладкий аромат может улучшить вкус отвара формулы и усилить гармонию комбинированных трав [78]. Для формул, состоящих из одной травы, лекарственная трава является «джун» лекарством (основным лекарством), которое проявляет основные лечебные эффекты.

Рисунок 12.

Принцип теории «Цзюнь Чэнь Цзо Ши» [79].

Например, «Ma-huang-tang» — это формула, традиционно используемая для лечения воспалительных заболеваний печени и состоящая из Ephedra sinica Stapf (Ma huang 麻黄), Ramulus cinnamomi Cassiae (Gui zhi 桂枝), Semen pruni Armeniacae (Xing ren 杏仁) и Radix glycyrrhizae (Gan cao 甘草) (рис. 13). Ма Хуанг работает как главный лекарственный препарат, обеспечивающий основные противовоспалительные эффекты при лечении заболеваний легких.Гуй чжи работает в качестве консультанта по медицине и помогает Ма Хуану хорошо функционировать, что составляет «сян ши» («взаимное улучшение») из «семи отношений совместимости». Син жэнь — это солдатское лекарство, которое увеличивает эффективность Ма хуан. Ган цао действует как направляющее лекарство, которое может регулировать свойства других лекарств и улучшать гармонизацию формулы. Общая эффективность формулы TCM является результатом смеси химических компонентов в нескольких лекарственных травах [76].Однако сообщалось, что чистые и активные компоненты, которые были отделены и очищены от одной или нескольких трав, отличаются по своему химическому профилю по сравнению с традиционными отварами [80]. Это может быть связано с синергетическим действием сложного лекарства или с химическими реакциями и другими изменениями, которые могут произойти во время процедуры отвара.

Рис. 13.

Состав трав и их роли в формуле «Ма-хуан-тан».

2.7. Составы TCM

2.7.1. Отвары

Отвар — самый ранний и наиболее часто используемый метод приготовления при клиническом применении традиционной китайской медицины [81]. Отвар TCM — это травяной чай, приготовленный из обработанных лекарственных трав, которые кипятят в течение нескольких часов [82]. Приготовление отвара традиционной медицины состоит из нескольких этапов, таких как последовательность кипячения травяного материала и разное время кипячения и фильтрации. Приготовление отвара сложное, так как требует опыта и часто требует значительного времени.Травяные ингредиенты в составе отвара могут быть изменены для каждого пациента в зависимости от заболевания. Фитотерапия может включать листья, цветы, корни, кору или плоды, а процедура приготовления зависит от используемой части травы. Вызывает беспокойство то, что в некоторых случаях нельзя гарантировать качество и стабильность травяного материала [14]. Кроме того, неприятный привкус отвара был проблемой для пациентов на протяжении тысячелетий. По мере развития оборудования и увеличения рыночного спроса современные отвары из-за их удобства стали очень популярными в больницах традиционной китайской медицины [83].Отвары быстро и часто полностью всасываются с хорошей биодоступностью [81]. В модернизированном методе отварки лекарственные травы смешивают с водой и экстрагируют в отварочных машинах TCM [83]. Современные составы также включают гранулы, жидкости для перорального применения, таблетки, капсулы и инъекции. Это изменение в методологии может фактически повлиять на состав окончательной ТКМ, и это еще одна область, в которой будут полезны сравнительные исследования, направленные на классические и современные методы отварки.

2.7.2. Современные гранулированные составы

Использование гранул в Китае резко возросло, поскольку с ними легко обращаться, хранить и готовить. Гранула, состоящая из одной травы, называется одной дозируемой гранулой; когда он сделан из нескольких трав, он называется гранулом с дозирующей формулой [84]. Приготовление гранул входит в обширный процесс отвара: их получают отваром или водной экстракцией с помощью подходящих вспомогательных веществ. После растворения в теплой воде они могут попадать внутрь пациента.С ростом разработки гранул TCM, международные исследования были сосредоточены на том, можно ли заменить отвар гранулами с аналогичной эффективностью и безопасностью [15]. Во время процедуры приготовления гранул разница в водной экстракции, концентрации, сушке и гранулировании может влиять на растворение и химические профили активных ингредиентов [85]. Таким образом, это может привести к различной клинической эффективности гранул и отвара.

В последнее время сообщалось о некоторых случаях, связанных с эквивалентностью эффекта между гранулами и отваром.Действительно, были выявлены некоторые различия в химической консистенции, которые предполагают, что эффективность обоих лекарств может не быть эквивалентной. Ge-Gen-Qin-Lian-Tang — это классическая формула традиционной китайской медицины для лечения воспалительных заболеваний кишечника [86]. Сравнение химических отпечатков традиционного отвара и гранул Ge-Gen-Qin-Lian-Tang было исследовано с помощью жидкостного хроматографического диодного матричного детектора (LC-DAD), чтобы гарантировать постоянство эффективности. Отпечатки пальцев продемонстрировали небольшие вариации между 20 пиками, но площадь пиков пуэрена, берберина и байкалеина из образца гранул была на 50% меньше, чем у отвара [87].Формула TCM Da-Cheng-Qi-Tang обычно используется для лечения заболеваний пищеварительной системы. Исследована химическая стойкость отваров Да-Чэн-Ци-Тан, приготовленных традиционными и современными методами. Пять соединений были идентифицированы как химические маркеры, анализ которых показал, что химические отпечатки пальцев между этими двумя видами отваров несовместимы. Исследование показало, что традиционный метод отварки оказывает более сильное слабительное действие за счет более высоких концентраций реина и сеннозидов [83]. Следовательно, очень важно понимать влияние метода рецептуры на терапевтический эффект конечного гранулированного продукта TCM.

2.8. Анализ эффективности отпечатков пальцев в TCM

За последние 30 лет методы хроматографической и спектрофотометрической дактилоскопии значительно улучшились, а применение переносимых через дефис методов, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС), жидкостная хроматография-ядерный магнитный резонанс (ЖХ-ЯМР) или газовая хроматография, масс-спектрометрия (ГХ-МС) при анализе TCM облегчает определение качества в исследованиях и в фармацевтической промышленности [4].Однако стандарты качества сложно установить, поскольку в традиционной китайской медицине используется комплекс потенциальных активных ингредиентов лекарственных трав. Сегодня обычно применяемые модели для контроля качества TCM включают традиционные методы, такие как микроскопическая и макроскопическая идентификация и сравнение с монографиями, химический анализ отпечатков пальцев с использованием тонкослойной жидкостной хроматографии (ТСХ), жидкостной хроматографии (ЖХ), ВЭЖХ, газовой хроматографии (ГХ). ), ГХ-МС и др., А также множественные маркерные анализы.

Химические отпечатки пальцев и анализ биоактивности, связанный с несколькими маркерами, в настоящее время признан эффективным для анализа TCM [88].Использование известных и ранее охарактеризованных маркеров для анализа компонентов — самый популярный метод идентификации и контроля качества в традиционной китайской медицине. Например, профили отпечатков пальцев гинсенозидов применяются для аутентификации видов Panax [89]. Кроме того, зависимость эффективности Lycii fructus (Goji 枸杞) от отпечатков пальцев была изучена Чжаном в 2018 году. Спектр тандемной масс-спектрометрии с ультраэффективной жидкостной хроматографией (UPLC-MS / MS) трех партий годжи коррелировал с биологическими данными. с использованием тестов 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH) и 2,2′-азино-бис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) (ABTS).Соединения, относящиеся к антиоксидантной активности Годжи, такие как хлорогеновая кислота, кверцетин и кемпферол, впоследствии были идентифицированы с помощью анализа данных UPLC-MS / MS [90].

Из-за сложности традиционной китайской медицины редко когда какой-либо отдельный ингредиент обеспечивает полное доказательство медицинской эффективности. Хемометрические методы, такие как оценка сходства или анализ главных компонентов, часто используются для исследования взаимосвязи отпечатков пальцев и биоактивности в TCM [91]. ГХ-МС обычно применяется для анализа летучих метаболитов, тогда как ЖХ-МС часто используется для идентификации и количественного определения нелетучих компонентов.Методы с переносом через дефис, такие как ЖХ-МС, могут предоставить информацию о фрагментах составляющих, что может помочь в выяснении и идентификации химических структур. В последние годы анализ ЖХ-МС широко используется в ТКМ из-за его высокой чувствительности, селективности и получения специфической информации [92]. Метаболомное профилирование ЯМР в настоящее время признано быстрым и универсальным методом изучения и контроля качества материала TCM. Например, сообщалось, что контроль качества Radix Angelica Sinensis был изучен с помощью профилирования ЯМР [93], что привело к наблюдаемым различиям между образцами, приготовленными разными методами.

Для обеспечения единообразия фитотерапии была разработана концепция фитоэквивалентности. Фитоэквивалентность — это сравнение хроматографического отпечатка лекарственного средства на травах с профилем стандартного эталонного продукта. Отпечаток пальца определяется как характерный профиль, который отражает общий сложный химический состав образца, проанализированного с помощью хроматографических или электрофоретических методов. Хроматографические отпечатки пальцев принимаются Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в заявках на одобрение новых продуктов [94].В исследованиях традиционной китайской медицины отпечатки пальцев могут предоставить полный набор информации о химических компонентах, включая относительное количество всех определяемых аналитов [95]. Снятие отпечатков пальцев широко используется для аутентификации или различения видов, географических регионов или методов обработки в традиционной китайской медицине.

«Взаимосвязь отпечатков пальцев и эффективности» — это метод, который связывает отпечатки пальцев TCM с определенным фармакологическим эффектом [96]. Различные методы связывают химические отпечатки пальцев, такие как характерные пики, с биоактивностью.Процедура исследования взаимосвязи отпечатков пальцев и эффективности (Рисунок 14) включает в себя поиск подходящих аналитических методов для отпечатков пальцев, определение анализов для различных видов биоактивности, использование статистических методов для определения взаимосвязи эффективности отпечатков пальцев, выбор компонентов-кандидатов и проверку биоактивности идентифицированные компоненты-кандидаты [88]. Например, Валериана джатаманси Джонс (Zhi zhu xiangI 蜘蛛 香) давно используется в традиционной китайской медицине для лечения таких расстройств настроения, как тревожность.«Взаимосвязь отпечатков пальцев и эффективности» была изучена путем сопоставления отпечатков пальцев ВЭЖХ с тестами in vitro и in vivo . Четыре химических компонента, гесперидин, изохлорогеновая кислота A, изохлорогеновая кислота B и изохлорогеновая C, считаются множественными биологическими маркерами этого успокаивающего действия [97].

Рис. 14.

Метод «взаимосвязи отпечатков пальцев и эффективности» в ТКМ [88].

Анализ главных компонентов (PCA) — это статистический метод, который может уменьшить количество переменных и размерность и создать главные компоненты (ПК) для объяснения переменных в исходных данных.PCA обычно сочетается с кластерным анализом, корреляционным анализом или регрессионным анализом для определения взаимосвязи отпечатков пальцев и эффективности. Он извлекает данные и может удалять избыточную информацию, чтобы сосредоточиться на основных факторах. PCA часто используется вместе с другими хемометрическими методами из-за отсутствия конкретной математической модели количественной оценки переменных [98]. Например, Andrographis herba (Chuan xin lian 穿心莲) хорошо известен в Китае из-за его горького вкуса, который является одним из пяти вкусов в теории традиционной китайской медицины. Горький вкус признан связанным с фармакологическим действием Andrographis herba . В группе Чжана химические компоненты 30 различных типов Andrographis herba и спектр отпечатков пальцев были определены с помощью ВЭЖХ, а PCA был применен для анализа химических компонентов, связанных с горьким вкусом. По результатам PCA, андрографолид, неоандрографолид, 1,4-дезоксиандрографолид и дегиандрографлид были определены как вещества, ответственные за горький вкус Chuan xin lian [99]. Ephedra sinica Stapf (Ma huang 麻黄) обычно применяется при ревматизме, астме, лихорадке и ревматоидном артрите в Китае. Значение неорганических элементов Ма Хуанга из разных географических регионов было изучено с помощью масс-спектроскопии элементарных частиц и PCA, и исследование показало, что это эффективная стратегия для различения образцов TCM [100].

6. Обсуждение

6.1 Обогащение и выделение бактерий, разлагающих карбазол

Согласно Зулхарнайну и Така [37], в нашей естественной среде существует множество различных типов бактерий. Хотя большинство исследований сосредоточено на изолировании бактерий, разлагающих гетероциклические углеводороды, из сточных вод или мест с высокой вероятностью заражения, эти бактерии-разлагатели можно найти где угодно в окружающей среде, а не только в определенной области. Таким образом, окружающая среда озера выбрана для обнаружения новых видов бактерий, разлагающих карбазол. Проект начался с взятия озерной воды из озера западного кампуса Унимаса, Саравак, для выделения гетероциклических углеводородов, в основном бактерий, разлагающих карбазол. Отбор проб проводился на берегу озера ближе к суше, поскольку количество бактерий выше на прибрежных мелководных участках [38].После отбора пробы проводили обогащение с использованием минимальной солевой среды (МСМ) с карбазолом в качестве единственного источника углерода, где разложение карбазола можно было наблюдать в таблице 6. Примерно через три-четыре недели после первого обогащения можно было наблюдать изменение цвета. где обогащение превратилось в прозрачный желтый из ранее мутно-белого. Здесь, на основе исследования Зулхарнайна и Така [37], это доказывает, что бактерии, присутствующие в обогащении, использовали карбазол в качестве единственного источника углерода и разлагали его, вызывая изменение цвета.Это также объясняет, что накопление и выработка различных метаболитов во время разложения вызвали изменение цвета [37]. Другое исследование Stope et al. [39] и Maeda et al. [40] объяснили, что изменение цвета обогащения было связано с образованием продуктов мета-расщепления, которые являются промежуточными продуктами. Когда было выполнено второе и третье обогащение, изменение цвета можно было наблюдать с большей скоростью в течение двух недель по мере увеличения скорости разложения. Согласно концепции, согласно которой 3-кольцевая структура более устойчива и непоколебима, чем 2d-структура, бактериям требуется около 10 дней для полного разложения [37].

После обогащения были приготовлены чашки с агаром MSM с добавлением карбазола и использованы в этом эксперименте для обеспечения селективных условий и предотвращения роста любых других бактерий [41]. В этом эксперименте использовали двухслойный агар, чтобы легко наблюдать за чистыми зонами. Для наблюдения за ростом и разложением на чашках с агаром MSM делали штрихи. Через две недели на пластинах, показанных на Рисунке 4, можно было наблюдать чистые или полые зоны. Согласно Takahashi et al. [42], появление прозрачных зон на бактериальной колонии происходит из-за минерализации нерастворимого CAR бактериями.Поскольку можно наблюдать чистую зону, это доказывает способность или способность бактерий разрушать субстрат и использовать его в качестве единственного источника энергии.

После того, как была обнаружена чистая зона, было выполнено субкультивирование для выделения чистой колонии бактерий, демонстрирующих деградацию, при этом шесть бактерий были выделены и обозначены как штаммы IM1, IM2, IM3, IM4, IM5 и IM6. Основываясь на показанном результате, все бактерии смогли расти на агаре с МСМ с добавлением карбазола. Хотя не все шесть выделенных показали четкие зоны или образование ореола, изоляты смогли расти на чашках, что доказывает возможность использования субстрата. Чтобы наблюдать за производством промежуточного продукта и подтвердить разложение, изолированные бактерии были инокулированы на жидких средах с МСМ, так как в жидких средах субстрат разрушается легче, потому что бактерии становятся свободно движущимися клетками и имитируют исходное или естественное состояние бактерий. в озерной воде. Культуру MSM с бактериями помещали на орбитальный шейкер, чтобы убедиться, что бактерии получают достаточно питательных веществ, поскольку шейкер движется круговыми движениями.

6.2 Окрашивание по Граму

Затем выделенные бактерии были охарактеризованы морфологически с помощью окрашивания по Граму.На основании результатов в таблице 7 все изолированные бактерии (IM1, IM2, IM3, IM4, IM5, IM6) были идентифицированы как грамотрицательные палочковидные бактерии после просмотра под световым микроскопом со 100-кратным увеличением с иммерсионным маслом. Было известно, что для различения грамположительных и грамотрицательных бактерий окрашивание по Граму является лучшим и самым простым методом. Бактерии, которые могут сохранять первичный штамм, который является кристаллическим фиолетовым (пурпурный цвет), являются грамположительными бактериями, в то время как классификация грамотрицательных бактерий — это бактерии, которые не могут удерживать первичный штамм, и вместо этого они окрашиваются в розовый цвет сафранином [43].По данным нескольких исследований, некоторые грамотрицательные бактерии, такие как Pseudomonas sp. LD2 [44], Achromobacter sp. Штамм CAR1389 [45] и Sphingomonas sp. Сообщается, что GTIN1 1 [46] использует и разлагает карбазол. Это показывает, что большинство или многие из бактерий, разлагающих гетероциклические углеводороды, являются грамотрицательными.

6.3 Молекулярная характеристика

Молекулярная характеристика сначала была проведена с помощью процедуры экстракции ДНК, основанной на методе в 3.6.1. Детергент, который представляет собой SDS и протеиназу К, использовали для разрушения клеток и переваривания загрязненного белка в клетке. Процесс переваривания белка проводили при оптимальных условиях 37 ° C и инкубировали, при этом пробирки переворачивали каждые 10 минут для увеличения переваривания. Когда смесь стала вязкой, это означает, что процесс пищеварения закончился. Для поглощения ДНК в водной фазе добавляли фенол: хлороформ: изоамил (25: 24: 1) и помещали на роторный шейкер для максимального поглощения бактериальной ДНК.Центрифугирование проводили для образования двойного слоя органической и водной фазы и разделения верхнего слоя, содержащего ДНК, на новые пробирки. Затем перед центрифугированием добавляли изопропанол, оставляя осадок ДНК сбоку и на дне пробирки. Для дальнейшей амплификации с использованием ПЦР-машины осадок ДНК повторно растворяли в ТЕ-буфере.

В соответствии с методом в 3.6.2. амплификацию проводили с использованием термоциклера перед секвенированием 16S рДНК для идентификации бактерий. В ПЦР-амплификации были задействованы три основных процесса: денатурация, отжиг и фаза удлинения, которая повторяется в течение 30 циклов, таким образом создавая миллион копий примерно за 2 часа. Как показано в результатах анализа AGE, все шесть изолятов (IM1, IM2, IM3, IM4, IM5, IM6) были успешно амплифицированы с использованием 27F в качестве прямого и 1492R (обратного) праймеров, показывающих четкую интактную полосу, которая расположена на 1500 п.н. после сравнивается с лестницей ДНК размером 1Кб на дорожке 1. Согласно Анджелине [47], сумма двух праймеров и последовательность целевой ДНК равна размеру продуктов ПЦР.

В этом эксперименте был использован один из наиболее распространенных методов разделения ДНК — гель-электрофорез.В этом эксперименте, согласно методу в 3.6.3., Использовали 1% геля с 1 мл 50X TAE и 50 мл дистиллированной воды. Поскольку разрешение полосы ДНК зависит от концентрации геля, большинство концентраций гелей находятся в диапазоне от 0,7% до 2% [48]. Согласно Ченгу и Чжану [48], четыре основных фактора, которые влияют на скорость миграции ДНК, — это концентрация агарозы, при которой более низкая концентрация дает лучшие результаты для больших фрагментов ДНК. Кроме того, размер ДНК также является важным фактором, поскольку более мелкие фрагменты имеют тенденцию мигрировать быстрее по сравнению с более крупными фрагментами.Кроме того, конформация ДНК, в которой ДНК в суперспиральной форме, быстрее, чем в линейной форме. Наконец, во время электрофореза важную роль играет подаваемое напряжение, а также чем ниже напряжение, тем медленнее скорость миграции. После того как полосы ПЦР просматривали в УФ-свете, оставшиеся продукты очищали с использованием правильного протокола перед отправкой на секвенирование для идентификации изолированных бактерий, разлагающих карбазол.

6.4 Идентификация изолированных бактерий

Данные последовательности для штаммов IM1, IM2, IM3, IM4, IM5 и IM6 были получены от First BASE Laboratories Sdn Bhd, которые показаны в таблице 8.Все данные о последовательностях были проанализированы с использованием программного обеспечения MEGA перед определением видов на молекулярном уровне с использованием программирования BLAST из NCBI (http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Анализ показывает, что сигналы для знаков IM1 и IM3 были недостаточно сильными, что привело к снижению процента идентификации. Для штамма IM1 результат BLAST показал, что бактерии принадлежат к роду Bradyrhizobium sp. с 90% идентичностью по сравнению с базой данных. Bradyrhizobium sp. — это грамотрицательные азотфиксирующие бактерии палочковидной формы. Чаще всего встречается в почве и растет медленно по сравнению с Rhizobium sp. Исследование, проведенное Ку и Спейном [49], показало первые четкие доказательства начальных этапов биодеградации нитроанилинов с помощью Bradyrhizobium JS329. Хотя было проведено не так много исследований разложения карбазола Bradyrhizobium sp., , исследование по выделению и характеристике видов, которые разлагают полициклические и гетероциклические ароматические соединения в условиях чрезвычайно низкого содержания кислорода, показало, что Shinorhizobium sp.C9 (AF227756), Mesorhizobium amorphae (AJ271899), Mesorhizobium sp. Sh3851 (AY141983) и Rhizobium ciceri (U07934) обладают способностью разлагать гетероциклические углеводороды [35].

Для штамма IM2 было обнаружено, что бактерии принадлежат к роду Ochrobactrum sp. с 99% идентичностью в базе данных, в то время как IM6 также был обнаружен как другой тип видов Ochrobactrum с указанным названием Ochrobactrum anthropi sp . со 100% идентичностью.Этот вид известен как грамотрицательные палочковидные непигментированные аэробные бактерии. Это объясняет, как два изолята могут принадлежать к одному виду, поскольку их трудно различить, если бактерии не пигментированы. Новый штамм Ochrobactrum anthropi HM-1 был выделен из загрязненной нефтью почвы, где сообщалось о возможном разложении, что способствует биоремедиации участков, загрязненных отработанным моторным маслом [50].

При 97% сходстве с базой данных штамм IM3 оказался Pseudomonas aeruginosa sp.этот вид является патогенной бактерией, которая может вызывать заболевания растений, животных и даже человека. Эта бактерия также представляет собой грамотрицательные палочковидные бактерии, которые можно широко найти в окружающей среде, особенно в почве, воде и растениях. В эксперименте, в котором оценивалось сильное биоразложение сырой нефти, Pseudomonas aeruginosa sp. Сообщалось, что разлагается на уровне 58% сырой нефти при прямом или косвенном участии глицерина или рамнолипида. Как Pseudomonas aeruginosa sp. обладает способностью использовать растительное масло или глицерин в качестве единственного источника углерода [51]. Сырая нефть в основном участвует в биоразложении, поскольку основным компонентом сырой нефти являются летучие углеводороды, которые необходимо подвергнуть биоразложению.

IM4 и IM5 принадлежат к роду Burkholderia sp.

со 100% сходством с базой данных после секвенирования 16S рДНК. Burkholderia sp. — облигатные аэробные грамотрицательные бактерии, хорошо известные своей устойчивостью к антибиотикам. Некоторая семья из Burkholderia sp. , например Burkholderia mallei sp. Известно, что патогенны в основном для лошадей и других родственных животных. Основываясь на исследовании Иноуэ [52], 27 бактерий, использующих карбазол, были изолированы из окружающей среды, причем трое из них были Burkholderia sp. штамм NE-7, Burkholderia sp.a и Burkholderia sp. штамм NW-1. Когда была проведена гибридизация, в этих изолятах был обнаружен ген CAR, подтверждающий способность использовать карбазол в качестве единственного источника углерода.

6.5 Анализ газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором (GC-FID)

Поскольку скорость разложения не может быть определена прямым наблюдением, был использован GC-FID-анализ, чтобы получить результат скорости разложения карбазола шестью (IM1, IM2, IM3, IM4, IM5, IM6) изолированные бактерии. Аппарат ГХ-ПИД использовали для анализа остаточного субстрата после 12-дневного периода инкубации бактерий с добавлением карбазола, где наблюдали и сравнивали характер разложения. В предыдущем исследовании Okoh et al. [53], разложение сырой нефти Pseudomonas aeruginosa определяли путем измерения скорости восстановления сырой нефти. Hedlund et al. [54] также выполнили анализ с использованием GC-FID, где скорость разложения субстрата рассчитывалась по исчезновению субстрата.

В этом эксперименте образец анализировали каждые два дня до дня 12. На основе хроматограммы, наблюдаемой по результатам анализа в 4.4, пик субстрата, CAR был обнаружен при времени удерживания от 14.От 0 до 15,0 минут, и выяснилось, что характер использования CAR варьируется среди всех изолятов. Это могло быть связано с различной природой или окружающей средой углеводородов, присутствующих в месте, из которого были взяты изоляты [55]. Для штамма IM1 процент остаточного карбазола снижался с 10,87% на 3-й день до 0% на 12-й день, в то время как процент деградации постепенно увеличивался с 89,13% на 3-й день, 95,14% на 6-й день, 97,71% на 9-й день. и 100% на 12 день. Это показывает, что Bradyrhizobium sp. обладают способностью постепенно разлагать карбазол с максимальным процентом на 12-й день, что приводит к нулевому количеству оставшегося карбазола.

Для штамма IM2 процент остаточного CAR был высоким на 3-й день с 94,35%, но значительно снизился до 16,13% на 6-й день, а затем до 12,7% на 9-й день и 4,63% на 12-й день. на третий день скорость разложения была низкой и составила 5,65%, но резко увеличилась на 6-й день до 83,87 и 87,3% на 9-й день, а затем 95,37 на 12-й день. Следовательно, скорость разложения была медленнее в первые 3 дня и значительно увеличилась. с шестого дня.Однако можно было заметить, что этот Ochrobactrum sp. не разлагает полностью CAR через 12 дней, так как в нем все еще остается остаточный субстрат. Таким образом, наблюдая за нанесенным на график графиком деградации, можно указать, что штамму может потребоваться больше времени для полного разложения субстрата по сравнению с другими бактериями.

Процент остаточного субстрата для изолята IM3 снизился с 96,57% на 3-й день, затем 60,51% на 6-й день и 57,67% на 9-й день, тогда как процент деградации на 3-й день был низким на 3-й день. 43% и увеличилось до 39,49% на 6-й день, 42,33% на 9-й день и, наконец, до 100% на 12-й день. Pseudomonas aeruginosa sp. , который был широко проанализирован как деструктор, показал, что штамму потребовалось 12 дней для полного использования и разложения карбазола в качестве единственного источника углерода на основе результатов анализа.

Для штамма IM4 по результатам можно было наблюдать, что скорость деградации была одной из самых высоких по сравнению с другими изолятами. Процент остаточного карбазола снижен до 14.06% в день 3 и был полностью загружен, оставив 0% с 6 дня и далее. Скорость деградации снизилась до 85,94% на третий день и полностью увеличилась до 100% на 6 день. Для штамма IM5, который был идентифицирован как тот же вид с IM4, скорость деградации, однако, отличалась от штамма IM4 с остаточным процентом субстрата 0,38,46% на 3-й день и постепенно снижается до 36,9% на 6-й день, 6,96% на 9-й день и полностью использовался на 12-й день. Скорость деградации на 3-й день составила 61,545, что было выше по сравнению со штаммом IM4 и постепенно снизилось до 93. 04% на 9-й день и 100% на 12-й день. Таким образом, как штамм IM4, так и штамм IM5, который был идентифицирован как Burkholderia sp. мог быть другим типом пятен, показывающим разный уровень разлагающей способности.

Штамм IM6, который был идентифицирован как Ochrobactrum anthropi sp. имеет самую высокую скорость разложения на основании результатов анализа GC-FID, где было показано, что скорость разложения на 3-й день составляла до 91,22%, а субстрат, CAR, был полностью разложен на 6-й день. Остаточный субстрат, оставшийся на 3-й день, составил 8.78% из 100% в первый день, а к 6-му дню субстрата не осталось. Основываясь на исследовании Abulgasem Alenabi [56], считалось, что способность бактерий к разложению на CAR или другом субстрате зависит от способности изолятов использовать субстрат в качестве единственного источника углерода. Оптимальные факторы роста, такие как температура, pH и наличие питательных веществ, также играют важную роль в способности бактерий разлагать субстрат [57].

Если вы связаны с каким-либо учреждением из нашего списка ниже, вы можете подать заявку на получение средств на публикацию открытого доступа, следуя инструкциям, приведенным в ссылках.

Авторы-корреспонденты получат 25% скидку на свои сборы за публикацию в открытом доступе (OAPF) для глав книг в открытом доступе. 20% скидка для публикации полной монографии, 25% для компактных и 23% для кратких монографий.

Аффилированные авторы CSIC могут также воспользоваться преимуществами центрального фонда открытого доступа (в размере 10 000 евро) для покрытия до 50% остальной части OAPF до истечения срока его действия. Действительно для глав, принятых с 1 января 2020 г.

Авторы-корреспонденты получат 25% скидку на свои сборы за публикацию в открытом доступе (OAPF) для глав книг в открытом доступе. 20% скидка для публикации полной монографии, 25% для компактных и 23% для кратких монографий.

Авторы-корреспонденты получат 25% скидку на свои сборы за публикацию в открытом доступе (OAPF) для глав книг в открытом доступе. 20% скидка для публикации полной монографии, 25% для компактных и 23% для кратких монографий.

Авторы-корреспонденты получат 25% скидку на свои сборы за публикацию в открытом доступе (OAPF) для глав книг в открытом доступе. 20% скидка для публикации полной монографии, 25% для компактных и 23% для кратких монографий.

Колледжи Клермонта выделяют средства через программу Knowledge Unlatched, чтобы ученые могли более легко публиковать материалы открытого доступа.

Авторы-корреспонденты получат 15% скидку на свои сборы за публикацию в открытом доступе (OAPF) для глав книг или публикаций монографий в открытом доступе.Чтобы воспользоваться скидкой, вам необходимо подтвердить свой адрес электронной почты учреждения. Эти скидки действительны с 2020 по 2022 год.

Массачусетский университет, Амхерст, выделяет средства через программу Knowledge Unlatched, чтобы ученые могли более легко публиковать контент открытого доступа.

Авторы-корреспонденты получат 10% скидку на свои сборы за публикацию в открытом доступе (OAPF) для глав книг или публикаций монографий в открытом доступе. Чтобы воспользоваться скидкой, вам необходимо подтвердить свой адрес электронной почты учреждения.Эти скидки действительны с 2020 по 2022 год.

Университет Суррея выделяет средства через программу Knowledge Unlatched, чтобы ученые могли более легко публиковать контент открытого доступа.

Авторы-корреспонденты получат 10% скидку на свои сборы за публикацию в открытом доступе (OAPF) для глав книг или публикаций монографий в открытом доступе. Чтобы воспользоваться скидкой, вам необходимо подтвердить свой адрес электронной почты учреждения. Эти скидки действуют с 2020 по 2022 год.

Важно: вы должны быть членом или грантополучателем перечисленных выше организаций, чтобы подать заявку на их средства для публикации в открытом доступе.

Авторы-корреспонденты получат 25% скидку на свои сборы за публикацию в открытом доступе (OAPF) для глав книг в открытом доступе. 20% скидка для публикации полной монографии, 25% для компактных и 23% для кратких монографий.

Аффилированные авторы CSIC могут также воспользоваться преимуществами центрального фонда открытого доступа (в размере 10 000 евро) для покрытия до 50% остальной части OAPF до истечения срока его действия.Действует для глав, принятых с 1 января 2020 г.

Авторы-корреспонденты получат 25% скидку на свои сборы за публикацию в открытом доступе (OAPF) для глав книг в открытом доступе. 20% скидка для публикации полной монографии, 25% для компактных и 23% для кратких монографий.

Авторы-корреспонденты получат 25% скидку на свои сборы за публикацию в открытом доступе (OAPF) для глав книг в открытом доступе. 20% скидка для публикации полной монографии, 25% для компактных и 23% для кратких монографий.

Авторы-корреспонденты получат 25% скидку на свои сборы за публикацию в открытом доступе (OAPF) для глав книг в открытом доступе. 20% скидка для публикации полной монографии, 25% для компактных и 23% для кратких монографий.

Колледжи Клермонта выделяют средства через программу Knowledge Unlatched, чтобы ученые могли более легко публиковать материалы открытого доступа.

Авторы-корреспонденты получат 15% скидку на свои сборы за публикацию в открытом доступе (OAPF) для глав книг или публикаций монографий в открытом доступе. Чтобы воспользоваться скидкой, вам необходимо подтвердить свой адрес электронной почты учреждения. Эти скидки действительны с 2020 по 2022 год.

Массачусетский университет, Амхерст, выделяет средства через программу Knowledge Unlatched, чтобы ученые могли более легко публиковать контент открытого доступа.

Авторы-корреспонденты получат 10% скидку на свои сборы за публикацию в открытом доступе (OAPF) для глав книг или публикаций монографий в открытом доступе.Чтобы воспользоваться скидкой, вам необходимо подтвердить свой адрес электронной почты учреждения. Эти скидки действительны с 2020 по 2022 год.

Университет Суррея выделяет средства через программу Knowledge Unlatched, чтобы ученые могли более легко публиковать контент открытого доступа.

Авторы-корреспонденты получат 10% скидку на свои сборы за публикацию в открытом доступе (OAPF) для глав книг или публикаций монографий в открытом доступе. Чтобы воспользоваться скидкой, вам необходимо подтвердить свой адрес электронной почты учреждения.Эти скидки действительны с 2020 по 2022 год.

Важно: вы должны быть членом или получателем гранта в перечисленных выше организациях, чтобы подать заявку на их средства для публикации в открытом доступе.

Приготовление лекарственных трав: отвар Er-Xian и сыворотка, содержащая Er-Xian для экспериментов in vivo и in vitro

В последние годы все больше внимания уделяется лекарственным травам, одному из видов альтернативной медицины, который применяется клинические условия в восточном мире на протяжении тысячелетий.В отличие от модели «от скамейки к кровати» в современной медицине, традиционная фитотерапия сначала требует, чтобы модель «от кровати к скамейке» объясняла их механизмы. За этим может последовать проверка, выполняемая на лабораторном этапе, и обработка для разработки новых оптимизированных лекарств. Пока что существует несколько методов экстракции, которые, как сообщалось, высвобождают активные компоненты из целых смесей или трав. Среди них наиболее широко используется водная добыча.

Водная экстракция лекарственных трав состоит из четырех основных этапов. Первый шаг — замачивание. Комплексное лечебное средство на травах мацерируют в воде в течение периода времени, обычно от 0,5 до 1 часа. Продолжительность замачивания зависит от количества и свойств сырых трав. Чтобы сырые травы были полностью пропитаны, следует пропитать центр каждого кусочка или блока. Объем воды зависит от общего объема травы. Иногда вес трав используется, чтобы определить, сколько воды необходимо для замачивания. Однако плотность травы сильно различается. Поскольку целью замачивания является мацерация всех трав, способствующая высвобождению активных компонентов на следующих этапах, объем трав предпочтителен для использования в качестве эталона для объема воды.Второй этап — приготовление. Процессы кипячения и кипячения разрабатывались на протяжении тысячелетий. Разница во времени приготовления зависит в основном от вида трав из-за их различных физических, химических и фармакологических характеристик ¹² . Рекомендуется готовить потогоники в течение короткого периода времени, обычно менее 20 минут, в то время как ароматические вещества следует добавлять только за несколько минут до первого кипячения, чтобы избежать летучих реакций. Для тонизирующих трав требуется длительный период времени, чтобы вымыть их терапевтические составляющие.В этом случае EXD используется для лечения постменопаузального остеопороза на протяжении десятилетий ¹² . В теории традиционной китайской медицины считается, что этот синдром вызван почечной недостаточностью. EXD в основном предназначен для тонизирования почек. Поэтому EXD готовили в течение 2–3 часов, чтобы позволить EXD проявить свои антиостеопоротические эффекты ¹⁵ . Третий шаг — фильтрация. Фильтрация помогает предотвратить засорение иглы желудочного зонда травяными гранулами. Четвертый шаг — концентрация.Следует тщательно учитывать объем введения через желудочный зонд. Сообщалось, что большие объемы, такие как 10 мл / кг или более, вводимые через желудочный зонд, могут привести к нескольким проблемам, связанным с абсорбцией, включая быстрое шунтирование соединений в двенадцатиперстную кишку или аспирационную пневмонию, связанную с пассивным рефлюксом материал в пищевод ²⁵ . Таким образом, объемы, выбранные для мышей и крыс, составляли примерно 7,5 мл / кг и 5,5 мл / кг соответственно.

Важно подтвердить, сходны ли эффективные компоненты переваренного и метаболизированного EXD в крови с таковыми из сырого экстракта.Что касается биоэквивалентности EXD, Wu et al. сообщил об определении 7 компонентов в плазме крови собак: эпимедин A, эпимедин B, эпимедин C, икариин, сагиттатозид B, 2 ″ -O-рамнозиликаризид II и баохуозид I ²⁶ . Hu et al. обнаружил 21 соединение в плазме крыс после перорального приема ²⁷ . Пока о сыром экстракте из EXD не сообщается. Однако некоторые из эффективных компонентов, протестированных в крови, такие как икариин и берберин, были непосредственно применены к животным для сравнительного наблюдения ²⁸ .

Существует несколько подходов к расчету биоэквивалентной дозы для животных. Традиционный метод, основанный на массе тела (мг / кг), не подходит, поскольку фармакокинетика различается у разных видов. Часто используется расчет, основанный на площади поверхности тела (мг / м ² ), в которой скорость метаболизма зависит от размера отдельного животного ²⁹ . Применяемое здесь уравнение учитывает как площадь поверхности тела, так и массу тела и обычно используется в традиционной китайской медицине ³⁰ .

Многие виды животных, такие как кролики, морские свинки, крысы и мыши, могут быть выбраны для приготовления сыворотки, содержащей лекарственное средство. Тот же вид, что и у клеток , обработанных in vitro , является предпочтительным. В этом исследовании были выбраны крысы, потому что они производят больше сыворотки, чем мыши, и ближе к мышам с точки зрения вида по сравнению с другими животными. Кроме того, рекомендуется использовать эквивалент дозы в in vivo, или в клинике, как показано в протоколе in vitro .Разведение сыворотки (рекомендуется 1:10) не учитывается; то есть 10-кратная эквивалентная доза не применяется к животным, получавшим сыворотку, из-за потенциальной токсической реакции, вызванной обработанными клетками или органами ³¹ . Частота приема препарата варьируется от одного раза в день в течение 3-14 дней до двух раз в день (2 часа между каждым введением) ^{7 , 8 , 32} . Время сбора обычно происходит между 1 и 2 часами (до 6 часов) после последнего введения ^{33 , 34} .Цель состоит в том, чтобы поддерживать концентрацию лекарства в крови относительно стабильной и на пиковом уровне при отборе образцов ³⁵ . Процедуры введения могут включать инъекцию, введение через кожу или ингаляцию в соответствии с процедурами введения in vivo .

Инактивация сыворотки, содержащей лекарственное средство, все еще вызывает споры. Сторонники считают, что наличие многих активных компонентов, таких как гормоны, ферменты, антитела и комплементы в самой сыворотке, может привести к неожиданным реакциям, которые повлияют на результаты ³⁶ .Оппозиция считает, что активные компоненты, производимые лекарствами, также могут быть удалены в процессе инактивации ³⁷ . Чтобы уравновесить это, люди создают контрольную группу так, чтобы использовалась сыворотка животных, получавших физиологический раствор.

У протокола есть некоторые ограничения. Качество экстракта не оценивается перед началом экспериментов in vivo, и in vitro, . Во-вторых, в культуральной среде используются антибиотики, которые могут вызывать взаимодействия лекарственных растений и требуют дальнейшего тестирования.В-третьих, время замачивания и кипения определяется на основе опыта, полученного в клинической практике и экспериментах на животных. Для сравнения можно выбрать больше периодов времени. Время замачивания и кипения можно изменить для различных травяных смесей. Объем отвара для введения животным может быть изменен в зависимости от вида, возраста и веса животного. Животное, выбранное для приготовления сыворотки, содержащей лекарственное средство, и для процедуры введения, может быть изменено, как обсуждалось выше.

В совокупности протокол и результаты представляют собой пример приготовления и применения травяного отвара в исследованиях in vivo, и in vitro, . В разных случаях некоторые детали должны быть оптимизированы, включая периоды лечения, виды и режимы введения, на основе характеристик трав.

Требуется подписка. Пожалуйста, порекомендуйте JoVE своему библиотекарю.

Отвары, концентраты и сиропы

В чем разница между этими препаратами и как узнать, какой из них использовать и когда? Вот несколько основных правил.

Помните, что настой похож на чай, приготовленный путем заливки кипятком пригоршни трав и давая им настояться в течение 10-15 минут перед употреблением. Этот метод подходит для извлечения молекул из цветов, листьев и тонких стеблей. Он также используется для трав, содержащих смолы (сосна, пихта) или эфирные масла, потому что эти летучие вещества испаряются, и их полезные свойства теряются, если они подвергаются слишком большому нагреву.

Отвар

Для некоторых растений или частей растений настой недостаточно горячий, и предпочтительно кипятить траву, чтобы извлечь достаточное количество ее полезных компонентов. Это называется отвар. Делаем отвары из корней, коры и сушеных ягод. Эти растительные материалы жесткие, и простой мацерации в горячей воде недостаточно для извлечения активных компонентов из центра этих твердых трав.

• Замочите травы в большом количестве холодной воды на час или два, чтобы смягчить внешние слои травы.
• Довести до кипения.
• Варите на медленном огне 20-30 минут. Кипящая вода смягчит и съест траву, что позволит ей извлечь свои активные компоненты.
• Фильтр и напиток.

Отвар более концентрированный, чем настой, поэтому используются меньшие количества, одна или две чашки отвара в день. Отвар после фильтрации хранится двое суток в холодильнике, его можно пить горячим или холодным.

Концентрат

Концентрат — это отфильтрованный отвар, который кипит и восстанавливается, концентрируя его активные компоненты. Концентраты используются, если нам нужно более сильнодействующее средство. Их принимают в меньших дозах, что облегчает прием невкусных трав.

• Приготовить отвар.
• Фильтр и возврат в тепло.
• Варите на медленном огне без крышки несколько часов и уменьшите количество до половины от первоначального.

Концентрат можно хранить в холодильнике две недели. Принимайте по 20 мл один или два раза в день.

Сироп

Сироп — это концентрат с добавлением сахара (мед, кленовый сироп, сахар-сырец) и некоторого количества спирта для консервирования.

• Сделайте концентрат, который уменьшился до одной четверти вместо половины.Если вы начали с одного литра отвара, сократите его до 250 мл.
• Пока он еще горячий, добавьте сахар или мед и дайте ему раствориться. Используйте одну часть сахара или меда на четыре части жидкости.
• Дать остыть.
• Добавьте настойку, которая будет действовать как консервирующее и терапевтическое средство. Вы можете смешать более одной настойки, чтобы получить пользу от действия многих трав, или принять большое количество настойки для важного лечения.

Сироп — это простой способ объединить несколько трав вместе и замаскировать горький вкус некоторых из них.

Сделайте свой первый сироп из таких растений с хорошим вкусом, как бузина, шиповник или ягоды боярышника, и добавьте экстракты на ваш выбор. Вам всегда будет приятно иметь под рукой эликсир здоровья для решения ваших личных проблем со здоровьем.

Выделение и характеристика нанометровых агрегатов из отвара Бай-Ху-Тан и их жаропонижающее действие

Подготовка диализного мешка

Диализный мешок 20 см (Biosharp Biotechnology Co., Ltd.) с разрезом по молекулярной массе 3500- выключили и диаметром 36 мм кипятили в течение 10 мин в этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА) с бикарбонатом, точно доводя pH до 8.Мешок для диализа промывали дистиллированной водой для удаления примесей. Вышеуказанные операции были повторены 2 раза.

Высокоскоростное центрифугирование в сочетании с диализом

BHT (I) центрифугировали при 4000 об / мин в течение 30 мин; затем супернатант последовательно фильтровали через фильтровальную бумагу и мембрану 0,45 мкм. Фильтрат герметично закрывали в диализном мешке диаметром 20 см, чтобы получить единицу. Устройство было погружено в 200 мл воды в химическом стакане, который был помещен в водяную баню с постоянной температурой (Great Wall Material Industry and Trade Co., Ltd., Zhenzhou), а затем диализовали и разделяли при 120 об / мин ^-1 в течение 30 минут. В конце концов, жидкость в установке была удалена центрифугированием при 10000 об / мин ^-1 в течение 30 минут (центрифуга Xiang Yi H-2050R). Операции диализа и центрифугирования повторяли четыре раза. Посредством вышеуказанных операций осадок отвара Бай-Ху-Тан (S-BHT, II), диализат отвара Бай-Ху-Тан (D-BHT, III) и нанометровые агрегаты отвара Бай-Ху-Тан отвар (N-BHT, IV) (рис.8).

Выделение агрегатов нанометрового размера из BHT с помощью высокоскоростного центрифугирования и диализа.

Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ) и анализатор размера частиц

Каплю части IV помещали на медную сетку, покрытую углеродной пленкой, и сушили на воздухе. Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ, JEM2100, Япония) была проведена для наблюдения за морфологией и анализа составляющих элементов. Распределение частиц по размерам определяли с помощью лазерного анализатора размера частиц Malvern 2000.Стабильность Части IV также наблюдалась через 8, 16 и 24 часа исследования.

Высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой (RP-HPLC)

Анализ множества компонентов проводился на колонке C18 в системе HPLC (Thermo, Ultimate 3000). Подвижная фаза состояла из 25 мМ двухосновного фосфата калия (растворитель A) и ацетонитрила (растворитель B) со следующей программой градиентного элюирования: 10 → 28 (A: B, об. / Об.) При 0–18 мин, 28 → 33 (A : B, об. / Об.) Через 18–20 мин и 33 → 39 (A: B, об. / Об.) Через 20–26 мин.Подбиралась подходящая концентрация раствора образца, а объем инъекции составлял 10 мкл. Поглощение элюата контролировали при 257 нм. Скорость потока составляла 1 мл · мин ^-1 , а температура термостата колонки была установлена ​​на 30 ° C.

Первичные исходные растворы неомангиферина (0,2 мг · мл ^-1 ), мангиферина (0,3 мг · мл ^-1 ), глицирризиновой кислоты (0,1 мг · мл ^-1 ) и глицирризината аммония (0,1 мг · мл ^-1 ) получали в метаноле в соответствии с их растворимостью.Калибровочные кривые были подготовлены с семью уровнями концентрации, и факторы разведения вводились в различных объемах: 0,2 мкл, 0,5 мкл, 1 мкл, 2 мкл, 4 мкл, 8 мкл, 10 мкл, 12 мкл, 14 мкл, 16 мкл и 20 мкл.

Пики идентифицировали путем сравнения их времени удерживания (tR) и УФ-спектров со спектрами стандартных соединений (неомангиферин, мангиферин, глицирризиновая кислота и глицирризинат аммония). Фазы I ~ IV были конденсированы до 25 мл. Соответствующие количества (2 мл) I ~ IV суспендировали в метаноле (8 мл) и помещали в ультразвуковую ванну (SB-5200D, Ningbo Scientz Biotechnology Co.Ltd.) на 10 мин. Затем различные фазы центрифугировали при 2000 об / мин ^-1 в течение 10 минут, и супернатанты подвергали анализу RP-HPLC.

Измерение температуры и индукция лихорадки

Кролики были приобретены в центре лабораторных животных Хэйлунцзянского университета традиционной китайской медицины, сертификат № SCXK (Hei) 2008-004 (Хэйлунцзян, Китай). Температура, влажность и световые условия в среде кроликов поддерживались постоянными, пища и вода обеспечивались ad libitum.Все кролики были акклиматизированы в лаборатории не менее чем за одну неделю до эксперимента. Перед тестированием животных не кормили в течение ночи со свободным доступом к питьевой воде. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по этике животных Хэйлунцзянского университета китайской медицины (№ 2016101601).

Кроликов фиксировали в положении лежа на животе, а базальный уровень Tb контролировали с помощью мягкого электронного клинического термометра MC-347, вставленного примерно на 4 см в прямую кишку.Эту процедуру выполняли по крайней мере дважды за три дня до экспериментов, чтобы избежать изменений ректальной температуры после обработки. Tb каждого кролика регистрировали как среднее значение Tb за период 30 мин до введения и индукции лихорадки. Животных с Tb ниже 38 ° C или выше 40 ° C не использовали ни в каких экспериментах. В этом эксперименте всех животных использовали только один раз.

Внутривенное введение ЛПС (20 мкг · кг ^-1 ) вызывало двухфазное тепловое изменение температуры тела, начиная с 0.5 ч после инъекции. Первая тепловая фаза LPS-ответа может характеризовать Ян-мин-ре-чжэн (в теории традиционной китайской медицины), в то время как вторая тепловая фаза всегда приводит к слабости и угнетению духа ²¹ . Сорок два кролика были случайным образом разделены на семь групп, в каждой из которых было одинаковое количество кроликов (n = 6). Одна из групп служила «нормальной» группой, тогда как другие 6 групп были подвергнуты модели индукции лихорадки. Вызывали фебрильную реакцию, и ее отслеживали с течением времени.Вкратце, Tb измеряли сразу после того, как кроликам вводили ЛПС в растворе хлорида натрия (20 мкг · мл ^-1 ) в краевую ушную вену. Затем каждые 0.5 ч измеряли температуру один раз, и эти измерения продолжались в течение 5 ч. В каждый момент времени проводилось одно измерение, и отображаемые значения записывались.

Доза различных фаз диспергирования BHT соответствовала их содержанию в исходной рецептуре. Группировка была следующей: нормальная группа (нормальная), модельная группа (NS, группа физиологического раствора), группа прометазина гидрохлорида (PH, группа положительного контроля), группа BHT (BHT), осадок группы BHT (S-BHT), нанометр. агрегаты группы BHT (N-BHT) и диализат группы BHT (D-BHT).Группу ЛГ лечили инъекцией через зонд, а лечебный раствор или физиологический раствор закапывали в толстую кишку кроликов в других экспериментальных группах или контрольной группе, соответственно, за 0,5 ч до инъекции ЛПС. Уровень фебрильной реакции выражали как изменение температуры от базовой температуры (° C), где разница выражалась как ΔT (ΔT = температура измерения-Tb).

Уровни интерлейкина

Через пять часов после инъекции ЛПС из ушной артерии с помощью одноразового коллектора крови были взяты образцы крови объемом 2,0 мл. Кроликов сразу убили. Образцы крови переносили в асептические пробирки и центрифугировали при 3000 об / мин ^-1 в течение 10 минут для получения сыворотки. Образцы сыворотки хранили при -20 ° C для использования в биохимических анализах для определения уровней IL-6, IL-1β и TNF-α коммерчески доступными наборами ELISA в соответствии с протоколом производителя.

Клеточное поглощение

Флуоресцентная микроскопия. НК BHT диализовали при pH 9,0 (Na ₂ CO ₃ водн.) с ночевкой. FITC (1,0 мг), растворенный в воде (0,5 мл), добавляли к NA BHT с последующим перемешиванием на магнитной мешалке в темноте при 4 ° C в течение 8 часов с образованием нанометровых агрегатов, связанных с FITC. Клетки Caco-2 (приобретенные у Shanghai fu heng Biotechnology Co., Ltd.) высевали с плотностью 5,0 × 10 ⁵ клеток на 24-луночные планшеты и поддерживали до прилипания клеток. Затем 0,1 мл FITC-NA добавляли к 0,5 мл HBSS. Только FITC была контрольной группой. Клетки Caco-2 обрабатывали указанными выше образцами и инкубировали при 37 ° C и 5% CO ₂ в течение 24 часов.Монослои клеток трижды промывали предварительно нагретым PBS (pH 7,4) и наблюдали с помощью цифровой камеры Olympus DP-71 (Olympus, Center Valley, PA).

Проточная цитометрия. Для оценки скорости поглощения клетками записи изображений недостаточно. В этом исследовании мы также определили скорость поглощения с помощью проточной цитометрии (проточный цитометр BD Accuri C6, США). Вкратце, клетки Caco-2 высевали с плотностью 5,0 × 10 ⁵ клеток на 24-луночные планшеты и обрабатывали вышеуказанными образцами в течение 2 часов.После промывания PBS клетки переваривали раствором 0,25% трипсина и 0,02% EDTA в течение 3 минут после промывания PBS (pH = 7,4). Образцы центрифугировали 5 мин при 1000 об / мин. Клетки повторно растворяли в 2 мл PBS и анализировали проточной цитометрией.

Мышей были приобретены в центре лабораторных животных Хэйлунцзянского университета традиционной китайской медицины, сертификат № SCXK (Hei) 2013-0004 (Хэйлунцзян, Китай).