Определение свободного гемоглобина плазмы (гаптоглобин) в сыворотке крови в Санкт-Петербурге

Описание анализа

Гаптоглобин является одним из основных элементов, который связывает гемоглобин в крови. Его основная функция – предотвращение любых видов повреждений почечных канальцев и сохранение необходимого уровня железа в крови благодаря исключению экскреции гемоглобина.

Лабораторный анализ на концентрацию гаптоглобина позволяет обнаружить в организме острые воспалительные процессы, нефротические изменения, генетические отклонения, появление злокачественных опухолей или начинающийся некроз тканей – уровень белка может как снижаться, так и увеличиваться. Этот белок относится к острофазным элементам, но изменения его показателей не настолько закономерны, как у других белков. Исследование проводится с использованием сыворотки крови методом иммунотурбидиметрии.

 

Показания к проведению

Анализ применяется в случае:

• контроля за процедурой переливания крови пациенту;

• необходимости диагностики гемолитического состояния больного.

 

Факторы, влияющие на результаты анализа

Точность лабораторного анализа может быть нарушена из-за проведенного гемолиза, хилеза пробы, употребления андрогенов или кортикостероидов во время медикаментозной терапии.

 

Врач, назначающий исследование

Направление на анализ можно получить у неонатолога, педиатра, терапевта, онколога, гематолога, ревматолога.

Подготовка к анализу

Забор материала у пациента производится исключительно натощак, прием еды перед исследованием следует ограничить – ничего жареного, жирного, никакого алкоголя за 8 часов до процедуры. С утра при необходимости можно выпить воды. Прием лекарственных препаратов нежелателен на время забора крови, но в особых ситуациях следует в точности указать дозировку и количество употребляемых лекарств.

Нежелательно совмещать проведение анализа и другие диагностические процедуры – флюорографию, ректальный осмотр, физиотерапию, УЗИ-диагностику.

 

Интерпретация результатов

После получения на руки окончательных результатов лабораторных анализов обязательно проконсультируйтесь с профильным врачом. Не занимайтесь самодиагностикой, показатели могут немного отличаться в зависимости от использованного оборудования в лаборатории. Референсные значения нормального уровня гаптоглобина в крови:

• для детей до 1 месяца 0,1-3,0 г/л;

• 2 месяца-14 лет 0,2-3,0 г/л;

• для взрослых 0,3-3,0 г/л.

 

Анализ на гаптоглобин — норма в крови

Гаптоглобин — белок плазмы крови, который захватывает гемоглобины, высвобождающиеся при распаде эритроцитов, и транспортирует молекулы, в которых содержится железо. Важной функцией этого белка является обеспечение экономичного расхода запасов железа. В случае внутрисосудистого гемолиза гаптоглобин защищает почки от негативного воздействия. Кроме того, он вырабатывается в ответ на попадание в организм инфекции. При воспалительных заболеваниях белок работает, как антиоксидант, подавляет рост некоторых бактерий, уменьшает повреждение клеток.

В здоровом организме постоянно происходит процесс обновления эритроцитов. В течение 24-х часов разрушается примерно один процент от общего количества эритроцитов, циркулирующих в кровотоке. Если количество разрушенных клеток превысит норму вдвое, гаптоглобин полностью исчезнет из сыворотки. Отсутствие этого белка влечет за собой оседание молекул гемоглобина в почках. Происходит образование большого количества гемосидерина и ферритина. Организм стремится вывести избыток железа вместе с мочой. Эти процессы становятся причиной нарушения работы почек. При наличии воспалительных процессов,

анализ крови на гаптоглобин покажет повышенный уровень, но он не связан с концентрацией свободного гемоглобина.

Показания к исследованию

Анализ назначается, если у пациента имеются симптомы гемолитической анемии. К ним относится появление желтоватого оттенка кожи, бледность, потемнение мочи, общая слабость. Также он проводится при возможности развития гемолиза (например, у пациентов с искусственным сердечным клапаном, при поражении рядом токсических веществ, при переливании крови, гемодиализе). Исследование проводится при обследовании пациентов с патологиями печени, сниженным гемоглобином или количеством эритроцитов.

Исследование используется для:

• установления причины анемии;

• наблюдения за пациентами с искусственными сердечными клапанами;

• диагностики внутрисосудистого гемолиза;

• оценки функций печени;

• выявления реакций острой фазы;

• наблюдения пациентов после переливания крови.

Чаще всего результаты теста используется для диагностирования гемолитических анемий, в также для оценки степени их тяжести.

Интерпретация результатов

Уровень гаптоглобина зависит от работы печени, наличия воспалений и целого ряда других факторов. На него может оказать влияние прием многих лекарств.

Повышение количество белка характерно для:

• развития злокачественного процесса;

• масштабного повреждения тканей вследствие травм, ожогов, хирургических вмешательств;

• приема препаратов, содержащих гормоны;

• непроходимости желчных протоков.

Сниженный уровень белка наблюдается при:

• развитии эндокардита;

• генетических заболеваниях;

• искусственном сердечном клапане;

• патологиях печени.

Общие сведения

Гемоглобин входит в состав эритроцитов, участвует в транспорте кислорода и углекислого газа. Эритроциты существуют 120 суток, после чего разрушаются. В сосудах в норме происходит разрушение только незначительной их части (основное количество этих клеток распадаются в печени и селезенке). Железо из распавшихся клеток используется организмом при образовании новых эритроцитов. Если свободный гемоглобин не связывается, он поступает в почки и может повреждать их.

Разрушение большого количества эритроцитов в кровотоке ведет к увеличению количества свободного гемоглобина. Гаптоглобин связывает его, соответственно, концентрация этого белка снижается. При этом его синтез не увеличивается. Поэтому недостаток белка служит важным показателем внутрисосудистого гемолиза.

Подготовка к сдаче теста

Биоматериалом для исследования служит кровь из вены. Ее необходимо сдавать в первой половине дня натощак. Время голодной паузы должно быть в пределах 8-14-ти часов. Разрешено пить воду (негазированную).

Анализы в KDL. Гаптоглобин

Гаптоглобин — это вырабатываемый печенью белок плазмы крови. Его функция – связывание гемоглобина и участие в воспалительных реакциях. Гемоглобин – железосодержащий белок, который содержится в эритроцитах и обеспечивает транспорт кислорода к тканям и клеткам организма. Со временем эритроциты разрушаются – обычно их жизненный цикл составляет около 120 дней – и свободный гемоглобин попадает в кровь, где связывается с помощью гаптоглобина и перерабатывается в селезенке.

Если связывания не происходит, то свободный гемоглобин попадает в почки и может привести к их повреждению. Такие ситуации возникают, когда расход гаптоглобина организмом быстрее, чем его выработка печенью, например, при разрушении большого количества эритроцитов (гемолиз), либо при заболеваниях печени, при которой снижается выработка гемоглобина.

Причины гемолиза могут быть как наследственными, так и приобретенными – среди них несовместимость групп крови и резус-фактора при переливании, лекарственное и токсическое воздействие, механические повреждения, гемодиализ, инфекции – малярия, гемолитический стрептококк, газовая гангрена. В этих случаях развивается гемолитическая анемия, при которой наблюдаются слабость, бледность или желтушность кожи и слизистых, потемнение мочи и почечная недостаточность.

Другая важная функция гаптоглобина – участие в реакции острой фазы, которая развивается в ответ на инфекцию, повреждение, опухолевый процесс. Гаптоглобин выполняет роль антиоксиданта, снижает процессы повреждения клеток, замедляет рост бактерий, угнетает выработку простагландинов, участвует в регуляции работы иммунной системы. При наличии воспалительных процессов в организме уровень гаптоглобина в крови повышается.

В каких случаях обычно назначают исследование?

• Для выявления и оценки степени тяжести гемолитической анемии;
• Для различия гемолитической анемии и других видов анемий, вызванных иными причинами;
• При снижении количества эритроцитов, гемоглобина, появлении незрелых эритроцитов в анализе крови пациента;
• В качестве вспомогательного маркера воспаления.

Что именно определяется в процессе анализа?

Происходит измерение концентрации гаптоглобина в образце сыворотки крови пациента методом иммунотурбидиметрии.  

Что означают результаты теста?

Снижение уровня гаптоглобина указывает на его избыточное потребление и является признаком усиленного гемолиза. Обычно это наблюдается при наличии гемолитической анемии. При других видах анемий уровень гаптоглобина не изменяется. Также гаптоглобин может снижаться при заболеваниях печени, беременности, нефротическом синдроме, применении эстрогенов и эстрогенсодержащих препаратов. У младенцев в первые 3-6 месяцев жизни концентрация гаптоглобина в крови снижена.

Повышение гаптоглобина – один из признаков реакции острой фазы, причинами которой могут быть воспаление, инфекция или опухоль, повреждения тканей и органов, аутоиммунные заболевания.

Сроки выполнения теста.

Обычно результат анализа можно получить через 1-2 дня после взятия крови.

Как подготовиться к анализу?

Следует придерживаться общих правил подготовки к взятию крови из вены. С подробной информацией можно ознакомиться в соответствующем разделе статьи.

Гаптоглобин (Haptoglobin) — цена анализа в Ереване в ИНВИТРО

Исследуемый материал Сыворотка крови

Метод определения Иммунотурбидиметрия.

Белок, связывающий свободный гемоглобин, предотвращая выведение его из организма.

Открыт в 1938 г. М. Polonovski и М. Jajle. Это белок острой фазы воспаления, обладающий способностью связывать свободный гемоглобин, освобождающийся из эритроцитов, предотвращая выведение гемоглобина из организма и поражение почек. Он, как и трансферрин, церуроплазмин, относится к белкам, представляющим собой наиболее древнюю систему иммунной защиты организма.

Связывание токсичного свободного гемоглобина происходит с a-глобиновыми цепями гемоглобинов А, F, S и С. Метгемоглобин, гем и аномальные формы гемоглобина, в которых альфа-цепи отсутствуют, гаптоглобин не связывает. Гаптоглобин-гемоглобиновый комплекс быстро захватывается из циркулирующей крови ретикулоэндотелиальными клетками, благодаря чему предотвращается или минимизируется потеря гемоглобина и железа.

При гемолизе эритроцитов наблюдается быстрое снижение уровня гаптоглобина плазмы. В норме в день разрушается и удаляется из циркуляции около 1% эритроцитов. Увеличение этого количества до 2% ведёт к полному исчезновению гаптоглобина (в отсутствие таких стимулов для его продукции, как острое воспаление или кортикостероидная терапия). При патологиях, связанных с неэффективным гемопоэзом и разрушением эритроцитов при некоторых гемоглобинопатиях, наблюдается хроническое снижение уровня гаптоглобина (и гемопексина). Свободные димеры гемоглобина могут проходить через почечный фильтр, подвергаясь реабсорбции и катаболизму с включением железа в клеточный ферритин и гемосидерин. При насыщении способности к проксимальной реабсорбции свободный гемоглобин экскретируется в мочу. Железо в клетках почечных канальцев может достигать токсических концентраций, вызывающих нарушение функции почек.

Снижение гаптоглобина (в отсутствие других факторов, влияющих на его продукцию) является чувствительным маркёром внутрисосудистого гемолиза. Синтез гаптоглобина происходит преимущественно в печени, но также и в жировой ткани и лёгких. Стимулируется (посредством цитокинов) воспалением, но не гемолизом или снижением уровня гаптоглобина. Пик повышения наблюдается на 4 — 6 днях после стимуляции; снижение до нормального уровня – в течение 2 недель после удаления стимулирующих факторов.

В настоящее время продемонстрировано, что свободный гаптоглобин и его комплексы с гемоглобином играют важную роль не только в поддержании резерва железа, но и в контроле местных воспалительных процессов. Они являются мощными пероксидазами, которые гидролизуют пероксиды, освобождающиеся в процессе действия фагоцитов, гаптоглобин кроме того, ингибирует катепсин В и модулирует активность и пролиферацию лейкоцитов в участке воспаления. Комплексирование гемоглобина гаптоглобином предотвращает стимуляцию им перекисного окисления липидов и образование гидроксильного радикала в участках воспаления. Гаптоглобин относят к природным бактериостатическим агентам при инфекциях Fe-зависимыми бактериями (например, Escherichia coli), что связано, возможно, с предотвращением использования ими железа гемоглобина.

Длительно сохраняющиеся высокие значения гаптоглобина являются признаком неблагоприятного течения болезни. Уменьшение концентрации гаптоглобина чаще всего отмечается при заболеваниях, сопровождающихся внутрисосудистым гемолизом или повышенным высвобождением гемоглобина, например, при гемолитической анемии, пострансфузионном гемолизе и малярии. Внесосудистый гемолиз обычно не приводит к изменению концентрации гаптоглобина. Кроме того, снижение концентрации гаптоглобина может отмечаться при врождённой агаптоглобулинемии и тяжёлых заболеваниях печени с нарушением синтеза белков. Искусственные клапаны сердца и интенсивные занятия спортом, сопровождающиеся постоянным механическим повреждением эритроцитов, также могут приводить к снижению уровня гаптоглобина.

Уровень гаптоглобина низок в период новорожденности, а также у женщин во время беременности или терапии экзогенными эстрогенами, включая оральные контрацептивы.

 

Литература

1. Алексеев Н. А. Анемии: практическое руководство. — СПб.: Гиппократ, 2004. – 512 с.

2. Burtis C., Ashwood E., Bruns D. Tietz textbook of clinical chemistry and molecular diagnostics. — Elsevir Inc, 2006,  p. 2412.

3. Tietz Clinical guide to laboratory tests. 4-th ed. Ed. Wu A.N.B.- USA,W.B Sounders Company, 2006, p. 1798.

Анализ крови на гаптоглобин в Москве. Расшифровка и норма. Сдать анализы в МЦ «Здоровье» ЮАО (Варшавская и Аннино), ЦАО (Краснопресненская и Рижская).

Анализ на гаптоглобин — это обследование, которое назначается при подозрении на проблемы с гемоглобином: гемолитическую анемию, снижение уровня гемоглобина, гемолизе, заболеваниях печени и т. д. Также анализ применяют для оценки функции печени.

Подготовка к анализу на гаптоглобин

Подготовка к анализу на гемоглобин стандартная — такая же, как и в случае со многими другими анализами венозной крови. Вам необходимо:

• За 2—3 часа до исследования не есть. Пить в это время можно только простую негазированную воду
• Не курить в течение получаса перед сдачей крови
• На протяжении получаса перед анализом сохранять полное спокойствие как в эмоциональном, так и в физическом плане

Как делают анализ на гаптоглобин?

Кровь из вены берут утром, в процедурном кабинете (или, если речь идёт о лежачем пациенте, у постели больного). Вас удобно усадят, наложат на среднюю часть плеча резиновый жгут и попросят несколько раз сжать и разжать кулак — это нужно для того, чтобы вены наполнились кровью. После этого кожу протрут спиртовым раствором и, с максимальной аккуратностью, возьмут образец венозной крови для исследования.

Расшифровка результатов. Нормы гаптоглобина

В норме уровень гаптоглобина колеблется от 0,3 до 2-х г/л. Если этот показатель повышен, могут иметь место:

• Злокачественные опухоли, сепсис, некрозы, инфекции
• Обструкция путей оттока желчи
• Системные болезни, поражающие соединительную ткань (ревматоидный артрит, ревматизм и т. д.)
• Сахарный диабет
• Голодание

Также уровень гаптоглобина может быть повышен после травмы или хирургического вмешательства. Понижение концентрации белка указывает на:

• Генетические заболевания
• Гемолитическую анемию
• Болезни печени
• Применение эстрогенов или беременность
• Нефротический синдром

Где сделать анализ на гаптоглобин?

В ближайшем к Вашему дому или работе филиале МЦ «Здоровье». Мы запишем вас на самое удобное время, аккуратно возьмём кровь и предоставим точные результаты анализа в самые короткие сроки.

К вопросу о контроле качества эритроцитсодержащих компонентов крови, обедненных лейкоцитами

А.И. Костин, О.А. Майорова, А.В. Ложкин, М.Е. Почтарь, М.И. Демичева, В.А. Кузмичев,С.А. Луговская, Е.В. Наумова, Д.Г. Кисиличина, Э.В. Андрейцева, В.В. Долгов

ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии, Минздравсоцразвития, г. Москва

ГУ ГКБ им. С.П. Боткина Департамента здравоохранения, г. Москва3 ГУ: «Станция переливания крови Департамента здравоохранения, г. Москва»

Кафедра клинической лабораторной диагностики РМАПО, г. Москва

 

 

Трансфузиология № 2, 2011

 

Проведено сравнение параметров контроля качества эритроцитной массы, обедненной лейкоцитами, после применения систем для лейкоредукции российского производства: «Лейкосеп» Интероко и ПК 02-01 «Виробан», основным элементом(фильтрующим узлом) которой является встроенный фильтр PALL зарубежного производства. Подсчет количества остаточных лейкоцитов в компонентах крови осуществляли методом проточной цитофлюориметрии. Использовали набор Kit Flow-Count Fluorospheres и моноклональные антитела против CD45. Применение системы«Виробан» при соблюдении температурного режима (охлаждение перед фильтрацией до +4°С) обеспечило адекватную лейкоредукцию эритроцитной массы, соответствующей стандарту качества ЕС в 90% наблюдений.

Ключевые слова: контроль качества компонентов крови, подсчет остаточных лейкоцитов, эритроцитная масса, лейкоредукция, проточная цитофлюориметрия.

Введение

Развитие высокотехнологичной медицины обусловило повышение требований к качеству компонентов крови. Значительный рост трансфузионной активности в течение последних 10 лет, восновном за счет увеличения трансфузий тромбоцитного концентрата, неизбежно привел к росту посттрансфузионных осложнений и удорожанию лечения. В России не существует достоверного учета нежелательных реакций, связанных с трансфузиями, не проводится многоцентровой фармакоэкономический анализ затрат на трансфузионное пособие и, возможно, в связи с этим не кажется такимактуальным изучение проблем качестваи эффективности переливаний компонентов крови. Несомненно, что детекция патогенов в компонентах крови и профилактика распространения социально-значимых инфекций — краеугольные проблемы трансфузионной медицины, однако качество трансфузионных сред является первостепенным в обеспечении эффективности трансфузий и профилактике подавляющего большинства тяжелых посттрансфузионных реакций. Лейкодеплеция является одним из самых доступных методов повышения качества трансфузионных сред.

Повышение безопасности компонентов крови, обедненных лейкоцитами, основанное на доказательствах

Применение компонентов крови,обедненных лейкоцитами, позволяет снизить частоту трансфузионно-опосредованной иммуномодуляции, аллоиммунизации к HLA антигенам класса 1,развитие фебрильных посттрансфузионных негемолитических реакций, а также уменьшить риск передачи таких клинически значимых инфекционных агентов, как цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр и HTLV. До 2001 г. было проведено11 исследований, посвященных влиянию лейкодеплеции на аллоиммунизацию ирефрактерность к трансфузиям тромбоцитных концентратов. По мнению ряда авторов, лейкодеплеция не предотвращает возникновение выше указанных осложнений. Из других источников следует,что лейкодеплеция позволяет предотвратить аллоиммунизацию и уменьшить долю пациентов с иммунной рефрактерностью к трансфузиям тромбоцитов. Наиболее достоверными являются данные многоцентрового исследования TRAP (The Trial to Reduce Alloimmunizationof Platelets). В связи с чем, общепринятым считается, что лейкоредукция уменьшает аллоиммунизацию и предотвращает возникновение рефрактерности к трансфузиям ТК. Такие же обнадеживающие данные получены при ретроспективном анализе 13 902 трансфузий тромбоцитовв Канаде у 617 пациентов c острым лейкозом, получившим программную химиотерапию с последующей трансплантацией СКК. Сравнивали 315 пациентов до введения универсального удаления лейкоцитов (УУЛ) и 302 после. Доля пациентов саллоиммунизацией снизилась с 19 до 7%, аллоиммунной рефрактерностью с 14 до 4%. У пациентов с острым лейкозом в канадском исследовании после введения УУЛ доля пациентов (не количество реакций от всех трансфузий) с фебрильными негемолитическими реакциями на транфузии тромбоцитов уменьшилась с 14 до 5%. В странах, узаконивших УУЛ, продемонстрировано снижение частоты развития фебрильных негемолитических реакций у пациентов с высокой трансфузионной зависимостью на 50% — после трансфузий эритроцитов и на 75-90% -14 после трансфузий тромбоцитов. Так, за 2007 г. в 88 госпиталях Японии в результате проведения около 1 млн трансфузий клеточных компонентов крови зарегистрировано 638 посттрансфузионных гипертермических негемолитических реакций, что составляет приблизительно 0,06% от всех трансфузий. Еще одна немало важная причина, по которой многие клиники предпочитают использовать лейкоредукцию, — это снижение риска после операционных инфекций и улучшение после операционной выживаемости пациентов в результате редукции механизма, обусловленной трансфузиями иммуномо-дуляции и повышения иммунологической безопасности трансфузий.Многие авторы сходятся во мнении, что применение компонентов крови, обедненных лейкоцитами, у хирургических больных на 50% снижает риск послеоперационных инфекций. По данным Blumberg (2010 г.), при ретроспективном исследовании впервые было показано также снижение частоты развития TRALI синдрома и ассоциированной с трансфузиями циркуляторной перегрузки соответственно на 83 и 49% у пациентов, получавших только лейкофильтрованные компоненты крови. В большинстве предшествующих публи-каций отрицалась возможность какой-либо профилактики этих тяжелых осложнений путем применения обеднённыхлейкоцитами трансфузионных сред.

Универсальная лейкодеплеция (отношение к технологии в мире)

С начала 90-х годов ведется научная дискуссия о целесообразности универсального удаления лейкоцитов — УУЛ, то есть удаления лейкоцитов из всех доз эритроцитной массы, концентратов тромбоцитов и плазмы. Особенно активно дискуссия велась после внедрения обязательного УУЛ в Великобритании, Кана-де, Новой Зеландии, Франции, Ирландии,Португалии и Люксембурге в период с1998-2000 гг. В дальнейшем к ним присоединились Германия (2001 г.), Япония(2007 г.). В США дискуссия переросла в конфронтацию. С одной стороны, Совет экспертов по безопасности и использованию крови (ACBSA), Совет экспертов по продуктам крови (BRAC), а также подавляющее большинство руководителей университетских клиник США считают, что имеющиеся научные данные являются достаточным основанием для введения УУЛ. С другой стороны, Де-партамент здравоохранения США, также опираясь на мнение ученых и FDA, считает, что для незамедлительного введения УУЛ нет достаточных данных. В настоящее время в США только 80% педиатрических клиник используют универсальную лейкодеплецию, повсеместного распространения УУЛ нет. По данным службы крови Американского Красного Креста, в 2006 г. из 30 044 000 перелитыхв США компонентов крови только 9,9% были лейкоредуцированными перед хранением, 52% подверглись лейкодеплециив конце хранения. Применение метода удаления лейкоцитов из компонентов крови с целью повышения безопасности гемотрансфузий в учреждениях здравоохранения России является обязательным и регламентировано приказами МЗРФ. В 2008 г. в 53 регионах России производилась лейкофильтрация эритроцитсодержащих сред, плазмы и тромбоконцентрата, использовались как отечественные, так и зарубежные лейкофильтры. Однако объем передаваемых в ЛПУ фильтрованных сред невелик и составляет, соответственно 17, 8, 10% от общего объема указанных сред, использованных в клинической практике.

Стандартизация и контроль качества клеточных компонентов крови, обедненных лейкоцитами Непосредственная цель лейкодеплеции — удаление лейкоцитов из компонентов крови с редукцией их содержания дозначения <1 x 106 на 1 трансфузию. Именно такая степень «очистки» трансфузионной среды позволит профилактировать развитие нежелательных реакций, связанных с наличием остаточных лейкоцитов. В Европейских и Российских стандартах качества понятие лейкоредукции соответствует указанному критерию, а в США достаточной является лейкоредукция гемокомпонента до значения 5 x 106 на трансфузию. Мониторинг качества позволяет четко контролировать соблюдение стандартов заготовки и хранения компонентов крови. Для оценки качества эритроцитсодержащих сред в исследовательских целях используются многочисленные характристики. По мнению экспертов Европейского Совета, наиболее актуальными для практической работы являются: объем эритроцитов, гематокри, содержание гемоглобина в дозе и % гемолиза в конце хранения (табл. 1). В настоящее время обязательным элементом практики производства и применения обедненных лейкоцитами компонентов крови является определение количества остаточных лейкоцитов. Контролю качества подвергается 1% компонентов крови, Европейские рекомендации подразумевают, что после валидации методов лейкодеплеции, по крайней мере, 90% трансфузионных сред должны соответствовать критерию качества контаминированности лейкоцитами менее 106 клеток на дозу. В ближайшем будущем аналогичные требования будут предъявляться к трансфузионным средам в России.

Таблица 1

Критерии качества ЕС для донорских эритроцитов

 

Параметр	Эритроцитная масса	Эритроцитная масса с удаленным ЛТС	Эритроцитная масса фильтрованная
Гематокрит	0,65-0,75	0,65-0,75	0,5-0,7
Остаточные лейкоциты в дозе	—	<1,2 x 109	<1 x 106
Гемоглобин	Минимум 45 г/доза	Минимум 43 г/доза	Минимум 40 г/доза
Гемолиз эритроцитов в конце хранения	< 0,8%	< 0,8%	< 0,8%

Как следует из приведенных в таблице 1 критериев качества ЕС, после фракционирования и удаления ЛТС количество лейкоцитов в дозе эритроцитов не должно превышать 1,2 x 109, после лейкоредукции должно быть менее 1 x 106. Содержание гемоглобина в дозе эритроцитов не должно быть ниже 45 г, количество гемолизированных в конце хранения эритроцитов должно быть менее 0,8%. В процессе фракционирования и удаления из эритроцитной массы ЛТС потери гемоглобина неизбежны, и допускается снижение гемоглобина до 43 г в дозе.В тех дозах эритроцитов, где применена лейкодеплеция, допускается потеря до 5 ггемоглобина и является приемлемым снижение содержания гемоглобина до 40 г в дозе. 

Методы определения остаточных лейкоцитов в компонентах крови

Внедрение в рутинную трансфузионную практику использования компонентов крови, обедненных лейкоцитами,стимулировало разработку технологийи валидацию методов контроля остаточных лейкоцитов в трансфузионных средах. При этом достаточно проблематично оказалось изыскать возможность точного определения остаточного количества лейкоцитов после фильтрации из-за низкого их содержания. Согласно требованиям стандарта качества, содержание остаточных лейкоцитов не должно превышать 106 клеток на дозу, что может быть подтверждено или опровергнуто лишь при использовании аппаратуры с высокой разрешающей способностью. Вначале 90-х гг. наиболее распространеным был ручной способ определения сиспользованием метода световой микроскопии и гемоцитометра большого объема (счетной камеры Nageotte). Способ характеризуется высокой вариабельностью получаемых результатов при межлабораторном сравнении данных и, кроме того, не позволяет провести экспертную оценку качества удаления лейкоцитов из крови и ее компонентов из-за недостаточной чувствительности гемоцитометра .В 1997 г. впервые была продемонстрирована возможность точного определения низкого уровня лейкоцитов в трансфузионной среде методом проточной цитофлюориметрии с использованием антител против общелейкоцитарного маркера CD 45. В настоящее время применяются автоматические методы, основанные на принципах полимеразной цепной реакции и различных вариантах проточной цитофлюориметрии. Последние являются приоритетными из-за высокой скорости выполнения измерений и большей чувствительности (за счет исследования большего объема образца). В предлагемых вариантах обязательным эта помпроведения исследований является соединение определенных структур лейкоцитов с флюоресцирующими красителями. Допустимо применение ДНК-красителей (пропидиум-йодид) или коньюгированных с флюорохромами моноклональных антител против CD-антигенов лейкоцитов. Недостатком автоматических методов анализа по сравнению с ручным способом подсчета остаточных лейкоцитов является их большая стоимость.

Актуальность

Сегодня никто не сомневается в том, что фильтрация компонентов крови крайне необходима, но, несмотря на активное использование в трансфузиологической практике различных методов удаления лейкоцитов из гемокомпонентов, сравни-тельная оценка качества лейкофильтрованных гемокомпонентов остается предметом многочисленных исследований. Выявленные зависимости качества фильтрованных донорских эритроцитов от этапа фракционирования, температуры и длительности предфильтрационного хранения, использования различных видов гемоконсервантов во многом являются дискуссионными и часто носят противоречивый характер. Малое количество опубликованных результатов по сравнительной оценке эффективности лейкоредукции различными фильтрующими системами затрудняет их выбор. В настоящее время в России производятся: система фильтрации лабораторного (банковского) типа «Лейкосеп» Интероко и система ПК 02-01 с 2-мя мешками «Виробан» и встроенным фильтром PALL. По данным российских авторов, использование фильтрующей системы «Лейкосеп» Интероко позволяет достичь в эритроцитсодержащих компонентах крови лейкодеплеции, соответствующей европейскому стандарту. Нет уточненных данных о влиянии температурного режимана результаты фильтрации системой «Виробан». Исследование остаточных лейкоцитов в лейкофильтрованных гемокомпонентах проводилось с использованием счетной камеры Nageotte. Сравнительный анализ качества лейкодеплеции эритроцитной массы российскими системами с использованием автоматических методов контроля остаточных лейкоцитов не проводился.

Цель исследования

Сравнение технических параметров и качества фильтрации системами «Лейкосеп» Интероко и ПК 02-01 с 2-мя мешками«Виробан» (основным элементом которой является встроенный фильтр PALL зарубежного производства) для лейкоредукции эритроцитной массы в первые сутки после заготовки. Оценка влияния температурного режима на качество фильтрации эритроцитной массы системой «Виробан».

Материалы и методы

Дизайн исследования

 

Исследуемый материал 20 доз эритромассы без ЛТС не охлажденной (t +22°С) 10 доз эритромассы без ЛТС охлажденной (t +4°С)

Фильтрация (при t +22°С) 10 доз системой «Виробан» и 10 доз системой «Лейкосеп» Фильтрация (при t +4°С) 10 доз системой «Виробан»

Время монтажа системы, скорость фильтрации, общее время получения фильтрованных компонентов; Изменения объема эритромассы (потери при фильтрации — изменение веса фильтра).

 

Группа исследуемых Параметров	1 этап Оценка исходных параметров эритромассы без ЛТС	2 этап Оценка параметров после фильтрации (1 сутки хранения)	3 этап Оценка параметров после фильтрации (7 сутки хранения)
1	2	3	4
Количественные характеристики Эритромассы	Гемоглобин Гематокрит Тромбоциты Лейкоциты Микроскопия мазков	Гемоглобин Гематокрит Тромбоциты Лейкоциты Микроскопия мазков	Гемоглобин Гематокрит Тромбоциты Лейкоциты Микроскопия мазков
Повреждение эритроцитов в процессе фильтрации и хранения	Свободный гемоглобин Осмотическая резистентность Эритроцитов	Свободный гемоглобин Осмотическая Резистентность эритроцитов	Свободный гемоглобин Осмотическая резистентность Эритроцитов
Лейкоредукция	Определение остаточных лейкоцитов методом проточной Цитофлюориметрии	Определение остаточных лейкоцитов методом проточной Цитофлюориметрии

 
 

Расчетные параметры для сравнительной оценки: содержание гемоглобина в дозе; потеря гемоглобина; процент гемолизированных эритроцитов; степень лейкоредукции.

 

Рис. 1.

Система «Лейкосеп» (устройство предназначено для удаления лейкоцитовиз компонентов консервированной крови (эритроцитной массы и плазмы).

1. Колпачок

2. Игла одноканальная

3. Коннектор для стерильного соединения

4. Защитная оболочка

5. Штуцер

6. Контейнер с плазмой

7. Контейнер с эритроцитной массой

8. Узел фильтрации

9. Роликовый зажим

10. Желтый зажим

11, 13, 18, 19, 21, 22. Трубка

12. Контейнер для безлейкоцитной плазмы

14. Зажим

15. Красный зажим

16. Контейнер для безлейкоцитной эритромассы

17, 20. Белый зажим

Система «Виробан» по своему предназначению может быть использована для лейкоредукции эритроцитов на том же этапе, что и система «Лейкосеп» — непосредственно после фракционирования консервированной крови на компоненты, в связи с чем их сравнение является корректным. Температурный режим фильтрации не указан в руководстве по эксплуатации системы «Лейкосеп», в связи с чем мы дополнительно не охлаждали донорские эритроциты до +4°С и не формировали данную группу наблюдений. При использовании лейкофильтров «Виробан» охлаждение трансфузионной среды до+4°С является обязательным условием, в то время как несоблюдение данного температурного режима может значительно ухудшить результаты фильтрации. На СПК ДЗ г. Москвы удаление лейкотромбоцитарного слоя из эритроцитсодержащих компонентов крови является обязательным этапом фракционирования дозы консервированной донорской кровис целью повышения безопасности трансфузионных сред. Одним из преимуществ лейкофильтрации на этапе после фракционирования дозы консервированной донорской крови на компоненты является возможность заготовки ЛТС как источника получения тромбоцитных концентратов. Для исследования было использовано 30 доз донорской эритроцитной массы (ЭМ) с удаленным лейкотромбоцитарным слоем (ЛТС), которые были распределенына 3 группы по 10 доз. В 1 и 3 группах ЭМс удаленным ЛТС фильтровали системой «Виробан» (рис. 2). Во 2 группе применяли фильтрующие системы «Лейкосеп» (рис.1). Процесс фильтрации в 1 и 2 группах осуществляли непосредственно после фракционирования при температуре +22°С (с нарушением рекомендаций по эксплуатации фильтров ПК 02-01 с 2-мямешками «Виробан»). ЭМ 3 группы перед фильтрацией была выдержана при температуре +4°С от 2-18 ч (согласно рекомендациям по эксплуатации фильтров ПК 02-01 с 2-мя мешками «Виробан»). Контрольную группу составили 10 доз цельной донорской крови, подвергшейся стандартной процедуре фракционирования до ЭМ с удалением ЛТС и дальнейшим хранением при температуре +4°С в течение 7 суток. Средний возраст донора был 30 лет. По полу и возрасту группы не различались.

Рис. 2.

Система «Виробан» (фильтрующим узлом которой является встроенныйфильтр PALL зарубежного производства) — устройство предназначено дляудаления лейкоцитов из эритроцитной массы, эритроцитной взвеси илицельной консервированной крови.

1. Колпачок защитный

2. Игла полимерная

3, 7, 8, 10, 13. Трубка соединительная

4. Y-коннектор

5. Клапан односторонний

6. Фильтр лейкоцитарный

9, 14. Зажим малый

11, 12. Контейнер крови

Исследовали технические параметры фильтрации, регистрировали скорость фильтрации и общее время получения компонента. Потери донорских эритроцитов определяли по изменению веса фильтра до и после фильтрации. Исследование проводили в 3 этапа: до фильтрации, непосредственно после фильтрации и на 7 сутки хранения эритроцитов при температуре +4°С. В случае с контрольной группой проводили оценку параметров до фракционирования (в цельнойкрови), после фракционирования и получения ЭМ без ЛТС и на 7 сутки храненияданной трансфузионной среды. Длительность хранения 7 дней была выбрана неслучайно, именно в таком «возрасте» поступают в клинику со станции переливания крови и проводится трансфузия большинства донорских эритроцитов, кроме того, ограничение конца срока хранения эритроцитов 7 сутками позволило провести исследование более компактно по времени. Сравнительную оценку качества полученных в процессе фильтрации компонентов крови определяли по 3 группам параметров.

1. Количественные характеристики трансфузионных сред:

определение гематокрита и концентрации Нв в эритроцитной массе выполняли на гематологическом анализаторе «ADVIA2120» (фирмы Siemens). В последующем рассчитывали содержание гемоглобина в дозе и потери гемоглобина в процессе фракционирования и фильтрации. По-скольку любой гематологический ана-лизатор позволяет измерить в пределахразрешающей способности количестволейкоцитов и тромбоцитов, мы также ис-пользовали эти данные для сравнениягрупп до фильтрации с контрольной группой.

2. Степень повреждения эритро-цитов в процессе фильтрации и хранения:

свободный гемоглобин определяли наанализаторе фирмы «НemoСue AB». В последующем рассчитывали процент гемолизированных эритроцитов, используя формулу: % гемолиза =Нв свободный г/л (1-Ht об/об) х 100Нв общий г/л

3. Степень лейкоредукции и количество остаточных лейкоцитов: в России подсчет остаточных лейкоцитовв трансфузионных средах был возможентолько в камере Нажотта. Предлагаемые методы автоматизированной оценки (проточной цитофлюориметрии) до 2010 г. не были зарегистрированы. Отсутствие валидированных современных методов подсчета остаточных лейкоцитов накладывает определенные трудности в проведении независимой экспертной оценки качества компонентов крови, способов ее фракционирования с применением фильтрующих систем, это особенно важно в случае появления на рынке новых фильтров от различных производителей. Способ с использованием антител против общелейкоцитарного маркера CD45 является быстрым в исполнении и минимально трудоемким методом оценки количества лейкоцитов в крови. В настоящее время для определения точного количества исследуемых клеток существуют технологии с применением наборов Kit Flow-Count Fluorospheres фирмы «BECKMANCОULTER» и Kit Tru-Count Fluorospheres фирмы «Becton Dickinson». Методики зарегистрированы и широко применяются в России. Мы использовали аппарат FC 500 (фирмы «BECKMAN CОULTER»). Для точного определения абсолютного количества лейкоцитов в пробе эритроцитной массы применяли набор Kit Flow-Count Fluorospheres и моноклональные антитела против общелейкоцитарного маркера CD45.

Статистическая обработка

Статистическая обработка данных производилась методами вариационной статистики с применением программного комплекса MEDCALC. Описательная статистика данных, выраженных в виде количественных показателей, приведена в виде среднего арифметического значения M и его стандартной ошибки m ввиде M±m и медианы. Перед проведением статистического анализа данных была произведена проверка количественных показателей на соответствие нормальному (гауссовому) распределению значений при помощи критериев согласия Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова. Во всех изученных группах нормальность распределения не была доказана, в связи с чем для статистической обработки применялись непараметрические критерии. Сравнение двух групп производилось непараметрическим критерием Манна-Уитни, сравнение нескольких групп-непараметрическим дисперсионным анализом по Крускалу-Уоллису с последующим применением post-hoc анализа по Данну. Различия считались статистически значимыми при уровне значимости p<0,05.

Результаты исследования

Согласно дизайну, на 1 этапе исследования изучены количественные характеристики эритроцитсодержащих сред. Как следует из результатов, представленных в таблице 2, все дозы эритроцитов соответствовали критерию качества биологической полноценности ЕС и содержали более 45 г Нв в дозе. В дозах эритроцитов 2 и 3 групп Нt составил соответственно 76и 79% и был выше чем в 1 и контрольнойгруппах. Содержание Нв в дозе эритроцитов составило по 63 г во 2 и 3 группах и было больше (р=0,014) чем в 1 группе (50г/л), что очевидно было связано с меньшим объемом и меньшей концентрацией Нв в трансфузионных средах 1 группы, что было учтено при последующем анализе. Исследуемые группы по содержанию Нв не отличались от контрольной группы.

Подсчет лейкоцитов в эритроцитсодержащих средах до фильтрации осуществили параллельно на проточном цитофлюориметре и гематологическом анализаторе, чувствительность которого позволяла определить их количество в диапазоне 108-109 /л. Как следует из результатов, представленных в таблице 2, исследуемые группы не отличались между собой и от контрольной группы по контаминированности лейкоцитами послеу даления ЛТС, хотя их количество быловыше рекомендованного экспертамиЕС. Мы наблюдали сходство в результатах подсчета лейкоцитов до фильтрацииобоими методами. Установлена высоко-достоверная сила связи между результатами подсчета лейкоцитов на гематологическом анализаторе и при проточной цитофлюориметрии в корреляции Спирмена (рис. 3). Выявленная связь между параметрами характеризует высокую точность подсчета лейкоцитов в данном диапазоне обоими методами, в связи счем при необходимости определения количества лейкоцитов в эритроцитарной трансфузионной среде без лейкоредукции возможно обойтись использованием обычного гематологического анализатора, прошедшего процедуру валидации.

Сравнительная оценка технических параметров фильтрации

Проведены сравнение и оценка технических характеристик фильтрации (время монтажа системы, скорость фильтрации,изменение веса фильтра и общее время получения компонента крови). Время монтажа системы в 1 группе составило 50 с, во 2 и 3 группах по 30 с (за счет меньшего числа зажимов). В связи с тем, что время монтажа фильтрующей системы занимало менее 1 минуты работы оператора, вобщем времени получения компонента его учитывать не стали. Как следует из таблицы 3, процесс фильтрации системой «Лейкосеп» был более длительным — 20мин (p< 0,05), чем в во 2 и 3 группах, где длительность фильтрации и общее время получения компонента составили по 14 мин. Время фильтрации регистрировалось с учетом обратной петли. Ни в одном случае не зарегистрировано удлинение фильтрации более заявленного времени для данных типов фильтров.

Таблица 2

Количественные характеристики компонентов крови до фильтрации

Параметр	1 Виробан +22°С	2 Лейкосеп +22°С	3 Виробан +4°С	р	Отличия Групп	Контроль эр масса без ЛТС
Ht, об/об	M=70,54 (95% ДИ: 67,7- 73,38) Me=70,5 (МКД: 67,15- 73,4)	M=77,04 (95% ДИ: 73,91- 80,17) Me=76,75 (МКД: 73,55- 78,1)	M=76,97 (95% ДИ: 71,18- 82,76) Me=79,5 (МКД: 70,67- 81,25)	0,017	1 и 2 1 и 3	M=68,1 (95% ДИ: 65,44- 70,76) Me=69,0 (МКД: 65,85- 70,35)
Нв, г/л	M=247 (95% ДИ: 237,12- 256,88) Me=244,5 (МКД: 237,5- 255,5)	M=266,4 (95% ДИ: 256,78- 276,02) Me=264,5 (МКД: 257- 272,25	M=251,7 (95% ДИ: 233,37- 270,03) Me=255,5 (МКД: 232,75- 262,25)	0,0 52	—	M=228 (95% ДИ: 220,87- 235,13) Me=231,5 (МКД: 221- 235,75)
Содержание Нв в дозе, г/доза	M=51,9 (95% ДИ: 46,94- 56,86) Me=50,5 (МКД: 47,5- 57,25)	M=62,4 (95% ДИ: 56,55- 68,25) Me=63,5 (МКД: 57,5- 67,5)	M=63,4 (95% ДИ: 56,53- 70,27) Me=63 (МКД: 54,75- 68)	0,014	1 и 2 1 и 3	M=57,02 (95% ДИ: 51,66-62,38) Me=54,6 (МКД: 51,05- 63,95)
Подсчет на ADVIA 2 120M (гематологический анализатор
Лейкоциты, х109/доза	M=1,39(95% ДИ:1,05-1,73) Me=1,23 (МКД: 1,1025- 1,506)	M=1,58 (95% ДИ: 1,26-1,9) Me=1,638 (МКД: 1,295375- 1,977375)	M=2,05 (95% ДИ: 1,53-2,57) Me=2,019 (МКД: 1,716- 2,57825)	0,18 5	—	M=2,04 (95% ДИ: 1,46- 2,62) Me=1,95 (МКД: 1,446- 2,2798)
Подсчет на FC 500 (проточная цитофлюориметрия)
Лейкоциты, х109/доза	M=1,38 (95% ДИ: 1,1-1,67) Me=1,248 (МКД: 1,181- 1,517)	M=1,96 (95% ДИ: 1,13-2,78) Me=1,654 (МКД: 1,394- 1,802)	M=2,1815 (95% ДИ: 1,54-2,81) Me=2,057 (МКД: 1,544- 3,011)	0,127	—	Нет анализа

 

В 1 и 3 группах («Виробан») трудозатраты были минимальными. Было достаточно двух подходов оператора к каждому фильтру для запуска фильтрации и использования обратной петли, в связи с чем время фильтрации соответствовало общему времени получения компонентакрови. Во 2 группе («Лейкосеп») процесс фильтрации разделялся на 4 этапа: фильтрация плазмы, перевод эритромассы без ЛТС в контейнер из-под плазмы, фильтрация эритромассы, применение обратной петли. Процесс фильтрации требовал значительных трудозатрат и общее время получения компонента крови было равным 28 мин, что гораздо более длительно (р=0,001), чем в 1 и 3 группах. Таким образом, длительность фильтрации была значительно больше во 2 группе. Трудозатраты были выше также во 2 группе. Данные различия обусловлены тем, что через «Лейкосеп» пропускается в 2 раза больший объем среды — плазма и ЭМ, однако при этом заготавливается 2 лейкоредуцированных компонента крови. Потери при фильтрации, определяемые по весу фильтра, в 1 и 3 группах были минимальными и составили соответственно 24 и 21 мл, во 2 группе были выше (р<0,001) и составили 38 мл.

Рис. 3.

Связь между результатами подсчета концентрации лейкоцитов в Эрмассе до лейкодеплеции на ADVIA2 120М и FC 500 («BECKMAN CОULTER»). Коэффициент корреляции (непараметрический коэффициент Спирмена ρ) =0,75 (Р<0,0001)

Таблица 3

Оценка технических параметров фильтрации

Параметр	1 Виробан +22°С	2 Лейкосеп +22°С	3 Виробан +4°С	р	Отличия Групп
Время фильтрации, мин	M=14 (95% ДИ: 11,62-16,38) Me=14 (МКД: 12,25- 15,5)	M=19,2 (95% ДИ: 15,56- 22,84) Me=20,5 (МКД: 15-23)	M=14,9 (95% ДИ: 11,15-18,65) Me=14,5 (МКД: 10,25- 17,25)	0,0 31	1 и 2
Скорость фильтрации, мл/мин	M=15,6 (95% ДИ: 13,57-17,63) Me=15 (МКД: 13,5- 17,75)	M=12,9 (95% ДИ: 9,88-15,92) Me=12 (МКД: 10-15,25)	M=18,6 (95% ДИ: 14,8-22,4) Me=19 (МКД: 15,25-22)	0,0 36	2 и 3
Общее время получения компонента, мин	M=14 (95% ДИ: 11,62-16,38) Me=14 (МКД: 12,25- 15,5)	M=25,9 (95% ДИ: 21,79-30,01) Me=28 (МКД: 20,25-30)	M=14,9 (95% ДИ: 11,15-18,65) Me=14,5 (МКД: 10,25- 17,25)	0,0 01	1 и 2 2 и 3
Потери эритроцитов (вес фильтра), г	M=24,5 (95% ДИ: 22,71-26,29) Me=24,5 (МКД: 23-25)	M=36,8 (95% ДИ: 34,02- 39,58) Me=38 (МКД: 37,25-38)	M=21,3 (95% ДИ: 17,42-25,18) Me=21 (МКД: 18,25- 25,75)	0	1 и 2 2 и 3

Сравнительная оценка количественных характеристик и повреждения эритроцитов после фильтрации эритромассы

При исследовании параметров, характеризующих донорские эритроциты после фильтрации, выявлены следующие изменения: показатель гематокрита и концентрация гемоглобина практически не изменились в 1 и 3 группах и значимо снизились во 2 группе. Содержание Нв в дозе эритроцитов после фильтрации также оказалось самым низким (р=0,001) во 2 группе — 43 г, в сравнении с 1 и 3 группами, где он составил соответственно 45 и 58 г на дозу (табл. 4). При расчете потерь гемоглобина выявлено (рис. 4), что содержание гемоглобина в дозе ЭМ снизилось в среднем на 13 г, тогда как во 2 и 3 группах утрата Нв в процессе фильтрации ЭМ была значительно ниже (Р<0,001) и составила соответственно 2,5 и 3,5 г на дозу. Для сравнения на диаграмме также приведена контрольная группа и потеря эритроцитов, неизбежно возникающая при удалении ЛТС. Из диаграммы следует, что в процессе фракционирования консервированной крови до ЭМ без ЛТС медиана потерь эритроцитов составляет 6 г на дозу, при очень значительных колебаниях от 1 до 11 г на дозу, что в принципе характеризует человеческий фактор при исключительно ручном удалении ЛТС. 

Сравнительная оценка повреждения эритроцитов в процессе фильтрации продемонстрировала почти в 2 раза более низкую, не отличающуюся от контрольной группы концентрацию свободного гемоглобина в конце хранения в ЭМ 2группы (1,25 г/л против 3 и 2,75 г/л в 1 и 3 группах) (р=0,01). Это свидетельствует о минимальном повреждении эритроцитов при использовании системы «Лейкосеп», однако группы не отличались (Р=0,368) по проценту гемолизированных эритроцитов в дозах, и ни в одном из наблюдений этот показатель не приближался к предельно допустимой величине — 0,8% (табл. 4).

Таблица 4

Количественные характеристики и повреждение эритроцитовв процессе фильтрации и хранения

Параметр	1 Виробан +22°С	2 Лейкосеп +22°С	3 Виробан +4°С	р	Отличия Групп	Контроль
Ht, об/об	M=71,91 (95% ДИ: 68,33-75,49) Me=72,3 (МКД: 69,45- 75,85)	M=63,06 (95% ДИ: 56,65-69,47) Me=66,2 (МКД: 57,25- 69,85)	M=78,23 (95% ДИ: 72,9-83,56) Me=79,05 (МКД: 72,9- 84,775)	0,0 02	1 и 2 2 и 3	M=68,1 (95% ДИ: 65,44-70,76) Me=69 (МКД: 65,85-70,35)
Нв, г/л	M=250,9 (95% ДИ: 240,75- 261,05) Me=247,5 (МКД: 241,25-263)	M=222,1 (95% ДИ: 201,35- 242,85) Me=235,5 (МКД: 203,75-241)	M=260,3 (95% ДИ: 243,48- 277,12) Me=258,0 (МКД: 245,25-282)	0, 0 10	1 и 2 2 и 3	M=228 (95% ДИ: 220,87- 235,13) Me=231,5 (МКД: 221- 235,75)
Нв, г/доза	M=46,7 (95% ДИ: 41,99- 51,41) Me=45,0 (МКД: 43-52)	M=43 (95% ДИ: 38,71- 47,29) Me=43,0 (МКД: 41- 45,5)	M=60 (95% ДИ: 53,95- 66,05) Me=58,5 (МКД: 53,5- 67,5)	0,0 01	1 и 3 2 и 3	M=57,02 (95% ДИ: 51,66-62,38) Me=54,5725 (МКД: 51,05375- 63,955)
% гемолиза 7 сут. Хранения	M=0,27 (95% ДИ: 0,15- 0,39) Me=0,21 (МКД: 0,135- 0,3975)	M=0,14 (95% ДИ: 0,09- 0,19) Me=0,135 (МКД: 0,09- 0,1825)	M=0,27 (95% ДИ: 0,14-0,4) Me=0,22 (МКД: 0,1825-0,32)	0,3 68	—	M=0,18 (95% ДИ: 0,08-0,28) Me=0,12 (МКД: 0,08- 0,26)

 

Рис. 4.

Потеря Нв (количество грамм на дозу) после фильтрации

Рис. 5.

Содержание свободного гемоглобина в эритромассе, обеднённой
лейкоцитами, на 7 сутки хранения

Сравнительная оценка качества лейкодеплеции (подсчёт количества остаточных лейкоцитов и определение коэффициента фильтрации) при использовании систем «Лейкосеп» и «Виробан»Большинство доз ЭМ фильтрованных системой «Лейкосеп» продемонстрировали низкую лейкоредукцию. В 8 дозах контаминация лейкоцитами колебалась от 1,5 до 7 х 106, в одной из доз ЭМ количество лейкоцитов составило 13,8 х 106. Удачным можно назвать лишь 1 наблюдение из 2 группы с редукцией лейкоцитов в ЭМ до 0,8 х 106. Медиана содержания остаточных лейкоцитов во 2 группе была 3,75 х 106 на дозу (табл. 5). В 1 группе после фильтрации системой «Виробан» при несоблюдении температурного режима +4°С эффективная лейкодеплеция достигнута при фильтрации 2 доз ЭМ (0,4 и 0,5 х 106), в остальных случаях количество остаточных лейкоцитов находилось в интервале от 1,05 до 6 х 106, в одном случае наблюдалась очень высокая контаминация 73 х 106 на дозу. Медиана подсчета остаточных лейкоцитов ЭМ 2 группы составила 3,85 х 106 и значимо от 1 г руппы не отличалась. В 3 группе 9 из 10 доз соответствовали эффективной лейкодеплеции с абсолютным числом остаточных лейкоцитов в дозе ЭМ менее 1 х 106, в одном наблюдении количество лейкоцитов оказалось равным 1,34 х 106. Контаминация ЭМ лейкоцитами после фильтрации системой «Виробан» при соблюдении температурного режима +4°С в 3 группе составила 0,25 х 106, что соответствовало в 10 раз более эффективной лейкодеплеции (р=0,001), чем после применения системы «Лейкосеп» (рис. 6).

Таблица 5

Параметры лейкоредукции эритромассы, массы обедненной лейкоцитами, после применения систем «Лейкосеп» и «Виробан»

Параметр	1 Виробан +22°С	2 Лейкосеп +22°С	3 Виробан +4°С	р	Отличия Групп
Концентра- ция лейкоци- тов, х 109/л после филь- трации (1 сут.)	M=0,05 (95% ДИ: -0,03-0,13) Me=0,0215 (МКД: 0,0055- 0,02975)	M=0,02 (95% ДИ: 0,01-0,03) Me=0,02 (МКД: 0,012- 0,0285)	M=0,00187 (95% ДИ: 0,0065- 0,0008) Me=0,00105 (МКД: 0,000925- 0,0019)	0,0 01	1 и 3 2 и 3
Остаточные лейкоциты после филь- трации, х106 (1 сут.)	M=10,08 (95% ДИ: -5,93-26,09) Me=3,85 (МКД: 1,1125- 5,175)	M=4,57 (95% ДИ: 1,9-7,24) Me=3,75 (МКД: 2,125-5,5)	M=0,42 (95% ДИ: 0,16-0,68) Me=0,255 (МКД: 0,205- 0,455)	0,0 01	1 и 2 2 и 3
Лейкоредук- ция (log)	M=2,3 (95% ДИ: 1,82-2,78) Me=2 (МКД: 2-3)	M=2,1 (95% ДИ: 1,69-2,51) Me=2 (МКД: 2-2)	M=3,3 (95% ДИ: 2,95-3,65) Me=3 (МКД: 3-3,75)	0,0 01	1 и 3 2 и 3
% удаления Лейкоцитов	M=99,37 (95% ДИ: 98,49-100,25) Me=99,72 (МКД: 99,565- 99,93)	M=99,12 (95% ДИ: 98,22-100,02) Me=99,71 (МКД: 98,925- 99,8775)	M=99,98 (95% ДИ: 99,96-100) Me=99,99 (МКД: 99,98- 99,99)

Рис. 6.

Содержание остаточных лейкоцитов в эритромассе, обедненной лейкоцитами (подсчет методом проточной цитофлюориметрии c антителами к CD45)

Обсуждение

Универсальная лейкодеплеция не является стандартом для многих стран. С одной стороны, такие доказанные эффекты применения обедненных лейкоцитами компонентов крови как профилактика фебрильных реакций, снижение риска аллоиммунизации и трансмиссии вирусов группы герпеса, повышение иммунологической безопасности трансфузии явлются бесспорными преимуществами технологии. Эффективность лейкодеплециипродемонстрирована у кардиохирургических больных, в онкогематологии, акушерстве и неонатологии. С другой стороны, это дополнительные финансовые и трудозатраты. Не полностью ясна роль лейкофильтрации в повреждении эритроцитов и влиянии на клиническую эффективность трансфузий, нет унифицированных методик и рандомизированных исследований, сравнивающих качество различных систем для лейкодеплеции компонентов крови. Возможно, поэтому исследования качества фильтрации остаются очень актуальными по сей день. Наиболее спорным является вопрос контроля контаминации компонентов крови остаточными лейкоцитами после фильтрации. Точность оценки предлагаемых технологий всё ещё не бесспорна. По данным литературы,имеются противоречивые данные и значительные колебания в результатах «очищения» трансфузионных сред от лейкоцитов и тромбоцитов. Мы применили автоматический способ оценки остаточных лейкоцитов методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител против общелей коцитарного маркера CD45. Других автоматических методов оценки количества лейкоцитов в очень низкой концентрации на момент проведения исследования в России не было зарегистрировано. Выявленная до-стоверная корреляция между результатами подсчета лейкоцитов в эритроцитной массе до фильтрации на аппаратах ADVIA2 120M и FC 500 позволяет предположить отсутствие необходимости применения значительно более дорогого метода проточной цитометрии в сравнении с гематологическим анализатором для контроля качества всех клеточных компонентов крови, не подвергшихся лейкодеплеции. Было бы интересно оценить эргономичность и возможность использования данной методики для независимой экспертной оценки качества трансфузионных сред, а также сравнить чувствительность этого метода и провести сравнительный фармакоэкономический анализ с другими технологиями — подсчетом в камере На-жотта и детекцией остаточных лейкоцитов в проточной цитофлюориметрии по выявлению ДНК с применением красителя пропидиум йодида. В нашем исследованиизарегистрирован более высокий уровеньсвободного гемоглобина в фильтрован-ных эритроцитах в сравнении с работамидругих авторов. Возможно, это связано с применением методики его определения в анализаторе фирмы «НemoСueAB», которая пока не валидирована для исследования качества трансфузионных сред. Температурный режим имеет значение для любой фильтрующей системы. В настоящее время мы не имели технической возможности провести оценку влияния температурного режима на качество фильтрации системой «Лейкосеп», однако это целесообразно сделать в ближайшем будущем, применив современные методы подсчета остаточных лейкоцитов.

Заключение

При эксплуатации системы «Лейкосеп» (температура трансфузионной среды составляла +22°С) было продемонстрировано минимальное повреждение эритроцитов, но большая их потеря в процессе фильтрации, при этом недостаточная лейкодеплеция имела место в 90% наблюдений. Успешность применения системы «Виробан» зависела от четкого соблюдения температурного режима (охлаждение ЭМ перед фильтрацией до +4°С), при этом эффективность лейкоредукции эритроцитной массы была на порядок выше и соответствовала стандарту качества в 90% наблюдений.

Исследование уровня гаптоглобина крови , цены в Нижнем Новгороде

Гаптоглобин – белок острой фазы, способный связывать гемоглобин и выполняющий ряд регуляторных функций. Гаптоглобин – это белок плазмы крови, относящийся к фракции альфа-2-глобулинов. Он синтезируется в печени и постоянно присутствует в плазме крови. Патологические состояния, меняющие уровень гаптоглобина в крови, – это реакция острой фазы, повреждения печени, почек, аутоиммунные заболевания, гемолиз. Функция гаптоглобина состоит в том, чтобы связывать гемоглобин и участвовать в реакции острой фазы. Гемоглобин содержится в эритроцитах, доставляет кислород к тканям и участвует в транспорте углекислого газа. Время жизни эритроцита – 120 дней. Большинство эритроцитов разрушается в селезенке и печени, однако некоторая часть – непосредственно в сосуде с выходом гемоглобина в кровоток (внутрисосудистый гемолиз). В норме доля внутрисосудистого гемолиза невелика. Небольшое количество гемоглобина связывается с гаптоглобином, затем этот комплекс поглощается клетками ретикулоэндотелиальной системы, например, селезенки. Железо из гемоглобина возвращается в образующиеся эритроциты, т. е. гаптоглобин участвует в обмене железа в организме. Если связывания свободного гемоглобина не происходит, то он попадает в почки и может привести к их повреждению. Усиленный распад эритроцитов в кровяном русле приводит к увеличению поступления гемоглобина в кровь и, соответственно, к снижению уровня гаптоглобина. Выработка гаптоглобина при гемолизе не усиливается. Таким образом, снижение уровня гаптоглобина является важным признаком гемолиза, причем именно внутрисосудистого – гемолиз вне кровяного русла понижением гаптоглобина не сопровождается. При воспалении, опухолевом росте, повреждениях химическими факторами уровень гаптоглобина в крови повышается на 4-6-й день после начала действия повреждающего фактора и прекращается через 14 дней после его исчезновения. При повреждениях печени нарушается ее способность к выработке белков, что приводит к уменьшению количества гаптоглобина (так как он синтезируется в печени). При повреждениях почек с мочой теряются белки, которые в норме остаются в кровотоке. В этих случаях содержание гаптоглобина в крови будет снижаться. При аутоиммунных заболеваниях повышается активность фермента, участвующего в синтезе гаптоглобина, что увеличивает его концентрацию в крови. Наиболее часто анализ на гаптоглобин применяют для диагностики гемолитических анемий и оценки их тяжести. Для чего используется исследование? — Для диагностики внутрисосудистого гемолиза и степени его тяжести. — Для выявления реакции острой фазы (инфекции, воспаления, опухоли, ожога, обморожения, аутоиммунных заболеваний). — Для оценки функции печени. Когда назначается исследование? — При симптомах гемолитической анемии (слабость, потемнение мочи, бледность, пожелтение кожных покровов). — При снижении гемоглобина, эритроцитов, появлении незрелых форм эритроцитов. — Когда есть вероятность развития гемолиза (из-за переливания крови, искусственных клапанов сердца, гемодиализа, действия веществ, разрушающих эритроциты, – свинца, красителей, сульфаниламидов, ядов змей). — При заболеваниях печени. — Реакции на переливание крови (анализ пре- и посттрансфузионных образцов крови реципиента). — Обследование пациентов с искусственными клапанами сердца. — Гипертония беременных. — Оценка острофазных показателей воспаления и нарушений в а2-фракции глобулинов на электрофореграмме.

Тест на свободный гемоглобин в сыворотке

Определение

Анализ на свободный гемоглобин в сыворотке крови, который измеряет уровень свободного гемоглобина в жидкой части крови (сыворотке). Свободный гемоглобин — это гемоглобин вне красных кровяных телец. Большая часть гемоглобина находится внутри красных кровяных телец, а не в сыворотке. Гемоглобин переносит кислород в кровь.

Альтернативные названия

Гемоглобин крови; Гемоглобин сыворотки; Гемолитическая анемия — свободный гемоглобин

Как проводится анализ

Требуется образец крови.

Как подготовиться к экзамену

Никакой подготовки не требуется.

Как будет выглядеть тест

Когда игла вводится для забора крови, некоторые люди чувствуют умеренную боль. Другие чувствуют только укол или покалывание. После этого может появиться небольшая пульсация или небольшой синяк. Это скоро уйдет.

Зачем проводится анализ

Гемоглобин (Hb) является основным компонентом красных кровяных телец. Это белок, переносящий кислород. Этот тест проводится для диагностики или отслеживания степени тяжести гемолитической анемии.Это заболевание, при котором низкое количество эритроцитов вызвано аномальным распадом эритроцитов.

Нормальные результаты

Плазма или сыворотка у людей, не страдающих гемолитической анемией, могут содержать до 5 миллиграммов на децилитр (мг / дл) или 0,05 граммов на литр (г / л) гемоглобина.

Нормальные диапазоны значений могут незначительно отличаться в разных лабораториях. Некоторые лаборатории используют разные измерения или могут тестировать разные образцы. Поговорите со своим врачом о значении ваших конкретных результатов теста.

Что означают аномальные результаты

Уровень выше нормы может указывать на:

• Гемолитическую анемию (вызванную любой причиной, включая аутоиммунные и неиммунные причины, такие как талассемия)
• Состояние, при котором разрушаются эритроциты вниз, когда организм подвергается воздействию определенных лекарств или стрессу инфекции (дефицит G6PD)
• Низкое количество эритроцитов из-за того, что красные кровяные тельца разрушаются раньше, чем обычно
• Заболевание крови, при котором красные кровяные тельца разрушаются, когда они выходят из от холода к теплу (пароксизмальная холодовая гемоглобинурия)
• Серповидно-клеточная анемия
• Реакция на переливание крови

Риски

Забор крови сопряжен с небольшим риском.Вены и артерии различаются по размеру от одного человека к другому и от одной стороны тела к другой. Получить образец крови у одних людей может быть сложнее, чем у других.

Другие риски, связанные с забором крови, незначительны, но могут включать:

• Обильное кровотечение
• Обморок или головокружение
• Множественные проколы для определения местоположения вен
• Гематома (скопление крови под кожей)
• Инфекция (незначительное рисковать, если кожа будет повреждена)

Ссылки

Bunn HF.Подход к анемии. В: Goldman L, Schafer AI, ред. Гольдман-Сесил Медицина . 25-е ​​изд. Филадельфия, Пенсильвания: Эльзевьер Сондерс; 2016: глава 158.

Chernecky CC, Berger BJ. Гемоглобин (свободный), плазма и качественный — моча. В: Chernecky CC, Berger BJ, ред. Лабораторные исследования и диагностические процедуры . 6-е изд. Сент-Луис, Миссури: Эльзевьер Сондерс; 2013: 625-626.

изучают гемоглобин и поглотители гемина как новый класс терапевтических белков.

Реферат

Гемолиз возникает при многих гематологических и негематологических заболеваниях.Было обнаружено, что внеклеточный гемоглобин (Hb) вызывает определенные патофизиологии, которые связаны с неблагоприятными клиническими исходами у пациентов с гемолизом, такими как острые и хронические сосудистые заболевания, воспаление, тромбоз и почечная недостаточность. Среди молекулярных характеристик внеклеточного гемоглобина наиболее критическими являются перемещение молекулы во внесосудистое пространство, окислительные реакции и реакции оксида азота, высвобождение гемина и молекулярные сигнальные эффекты гемина. Ограниченный клинический опыт с продуктом гаптоглобина (Hp), полученным из плазмы, в Японии и более недавние доклинические исследования на животных показывают, что природный Hb и белки-поглотители гемина Hp и гемопексин обладают сильным потенциалом для нейтрализации неблагоприятных физиологических эффектов Hb и гемина.Сюда входят такие разнообразные состояния, как переливание эритроцитов, серповидноклеточная анемия, сепсис и экстракорпоральное кровообращение. В этой перспективе рассматриваются основные механизмы токсичности гемоглобина и гемина при различных болезненных состояниях, обновляется информация о том, как природные поглотители эффективно контролируют эти токсические составляющие, и исследуются критические вопросы развития Hp и гемопексина, полученных из плазмы человека, в качестве терапевтических средств для пациентов с чрезмерным внутрисосудистым гемолизом. .

Введение

Когда гемоглобин (Hb) вырывается из эритроцитов из-за гемолиза, обнаженный гемоглобин, лишенный своих антиоксидантов, которые обычно присутствуют в эритроцитах, может нанести окислительный ущерб сосудистой сети и обнаженным тканям. ¹ Чтобы нейтрализовать гемоглобин и его реактивную группу протопорфирина-IX железа (гемина), специализированные белки-поглотители плазмы улавливают токсичные части и доставляют их в компартменты, где гемоксигеназы могут расщеплять гемин на менее токсичные метаболиты. Другие молекулы и восстанавливающие вещества вносят свой вклад в эту защитную физиологию. Однако, когда эти системы очистки и детоксикации нарушены внутрисосудистым гемолизом, например, при серповидно-клеточной анемии, переливании крови, малярии или сепсисе, гемоглобин и гемин вызывают дисфункцию сосудов и органов, что приводит к неблагоприятным клиническим эффектам ().В этой перспективе рассматриваются механизмы токсичности гемоглобина при различных болезненных состояниях, обновляется информация о том, как гаптоглобин (Hp) и гемопексин (Hpx) эффективно обрабатывают свободный гемоглобин и гемин, а также исследуется, почему пришло время рассматривать эти белки в качестве терапевтических средств у пациентов с чрезмерным внутрисосудистым гемолизом. .

Схематическое резюме компартментов клиренса Hb и основных острых и хронических патологий, которые могут быть связаны с внутрисосудистым гемолизом. Доступность Hb и белков-поглотителей гемина Hp и Hpx сдвигает физиологический баланс от повреждения тканей к защите.

Внеклеточный гемоглобин и гемин являются многокомпонентными триггерами болезненных процессов

Неблагоприятные клинические эффекты, связанные с избыточным свободным гемоглобином, могут быть отнесены к нескольким специфическим структурным и биохимическим свойствам молекулы гемоглобина и вызваны следующими 4 взаимно взаимодействующими механизмами: (1) внесосудистая транслокация гемоглобина, которая является основным требованием, чтобы гемоглобин и гемин могли проявить свою неблагоприятную реактивность в тканях; (2) оксид азота и окислительные реакции; (3) высвобождение свободного гемина; и (4) молекулярно-сигнальные эффекты гемина.Эти механизмы описаны в следующих разделах и кратко описаны в.

Краткое схематическое описание основных механизмов токсичности гемоглобина и защиты белков-скавенджеров плазмы Hp и Hpx.

Механизм 1: внесосудистая транслокация Hb

После гемолиза гемоглобин находится в динамическом равновесии тетрамера и гетеродимеров αβ-субъединицы с преобладающим димерным состоянием при низких концентрациях гемоглобина в плазме. αβ-Димеры имеют относительно небольшой размер молекулы (32 кДа), что обеспечивает транслокацию белков и доступ к уязвимым анатомическим участкам (например, почкам и стенке сосудов).Воздействие Hb на ткани наиболее очевидно в случаях явной гемоглобинурии после массивного внутрисосудистого гемолиза, но Hb также способен перемещаться через эндотелиальные барьеры, проникая в субэндотелиальное и периваскулярное пространства и лимфатическую жидкость. ^2,3

Механизм 2: NO и окислительные реакции

Второй механизм токсичности гемоглобина — прооксидантная реактивность гемоглобина в плазме или тканях после экстравазации. Наиболее широко изучены реакции Hb с оксидом азота (NO) и физиологическими окислителями (например, перекисью водорода и перекисями липидов).Потребление NO и последующее окисление гемоглобина происходит через 2 реакции: (1) диоксигенация оксигалогеном оксигенатом NO, что приводит к образованию нитрата (NO ₃ ^—) и Hb железа (Hb-Fe ³⁺ ) и (2) нитрозилирование железом дезокси-Hb, которое происходит путем прямого связывания NO железом с нелегированным железом Hb (Hb-Fe ²⁺ ).

Современное понимание биохимии и патофизиологии этих реакций во многом основано на изучении переносчиков кислорода на основе гемоглобина (HBOC) и их хорошо задокументированных побочных эффектов на гемодинамику. ⁴ Целевой мутагенез гемоглобина, направленный на ограничение взаимодействий с NO или химических модификаций для ограничения доступа к участкам биодоступности NO в сосудистой стенке (например, путем химического сшивания гемоглобина в крупные полимеры или конъюгаты с декорированной поверхностью), ослабляет вазоконстрикцию и гипертония. ^5,6 Таким образом, истощение NO внеклеточным Hb в настоящее время является широко принятой гипотезой, объясняющей острую гипертензивную реакцию, которая возникает во время массивного гемолиза (достижение умеренного или высокого уровня свободного Hb в плазме) или во время инфузии HBOC. ^6,7 В дополнение к истощению сосудов, другим результатом реакций Hb-NO может быть образование Hb-Fe ³⁺ в паренхиме ткани. Накопление Hb-Fe ³⁺ в тканях может способствовать высвобождению гемина и / или передаче гемина другим белкам / липидам со вторичной токсичностью, обусловленной свободным гемином.

Биохимия реакции гемоглобина с пероксидами изучалась в течение последних 40 лет, ⁸ , но значение этих реакций для патофизиологии, вызываемой гемоглобином и гемином, все еще недостаточно определено.Предположение, что окислительные побочные реакции гемоглобина могут быть важной детерминантой токсичности гемоглобина, было основано на наблюдениях, что пероксиды образуются и высвобождаются во внеклеточное пространство в относительно больших количествах во время воспаления и ишемии-реперфузии. В условиях in vitro реакция Hb с пероксидом приводит к образованию Hb-Fe ³⁺ , форм железа с более высоким окислением, таких как феррил Hb (Hb-Fe ⁴⁺ ), и связанных радикалов (механизм II). Было высказано предположение, что свободные радикалы в цепи глобина доступны для локализованного окисления аминокислот (например, внутри Hb) или переноса радикалов на молекулы, не являющиеся Hb (например, липопротеины). ^9,10 Предполагаемый конечный результат этих реакций — саморазрушение гемоглобина, потеря гемина и сшивание / осаждение цепи глобина, что в конечном итоге может привести к повреждению ткани. ¹¹ Следует отметить, что предполагаемое влияние этих реакций на болезненные состояния основано на ограниченных и косвенных экспериментальных данных, поэтому остается неясным, образуются ли значительные количества Hb-Fe ⁴⁺ и радикалов во время гемолиза in vivo и если они способствуют развитию болезни.Единственными окисленными видами гемоглобина, которые могут быть последовательно определены количественно in vivo, являются Hb-Fe ³⁺ и гемихром, структурно искаженная форма Hb-Fe ³⁺ . Несоответствие между биохимическими наблюдениями in vitro и результатами in vivo может быть связано с изменением баланса между реакциями окисления и восстановления в условиях in vivo. ¹² Доступность больших количеств низкомолекулярных и ферментативных восстановителей может снизить стабильность разновидностей гемоглобина с более высокой степенью окисления и радикалов, производных гемоглобина, до неопределяемых уровней.Внутримолекулярные поперечные связи Hb, ковалентные аддукты порфирин-глобин и окисление аминокислот глобиновой цепи были определены как суррогатные маркеры для образования Hb-Fe ⁴⁺ . Такие модификации были обнаружены в гемоглобине, выделенном из спинномозговой жидкости после субарахноидального кровоизлияния и из мочи, что позволяет предположить, что перекисные реакции могут способствовать токсичности гемоглобина in vivo. ^13,14

Механизм 3: высвобождение и перенос гемина

Третий механизм токсичности гемоглобина связан с высвобождением гемина из Hb-Fe ³⁺ , который является основным продуктом окислительных реакций, описанных в предыдущем разделе. .Высвобождение гемина позволяет переносить реактивный порфирин на клеточные мембраны или растворимые белки и липиды плазмы и обеспечивает свободный гемин в качестве лиганда для молекулярных сигнальных взаимодействий. Как гидрофобная молекула, маловероятно, что значительные количества свободного мономерного гемина могут присутствовать в плазме. Следовательно, перенесенный гемин в форме геминового белка с низким сродством (например, гемин-альбумин) или гемин-липидных комплексов является наиболее вероятными физиологическими конечными продуктами высвобождения гемина. В зависимости от белковой или липидной среды свободный протопорфирин железа может действовать как промежуточный продукт и превращать реципиентную молекулу в реактивный конечный продукт.Наиболее идентифицируемым токсичным конечным продуктом высвобождения гемина является окисленный липопротеин низкой плотности (oxLDL). ¹⁵ Окисление ЛПНП и связанная с ним воспалительная и цитотоксическая активность представляет собой важный пример способности Hb вызывать повреждение сосудов. ^16,17

Механизм 4: молекулярные сигнальные эффекты гемина

Гемин может избирательно связываться с несколькими рецепторами, факторами транскрипции и ферментами и тем самым изменять состояние активации клеток, транскрипцию генов и метаболизм.Наиболее четко определенным взаимодействием является связывание гемина с репрессором транскрипции Bach-1, который регулирует транскрипцию гемоксигеназы 1 (HO-1) и других антиоксидантных ферментов, необходимых для адаптивного ответа на повышенные уровни внутриклеточного гемина. ¹⁸ Гемин также является лигандом рецептора ядерного гормона REV-ERB, который регулирует циркадный ритм, метаболизм глюкозы и адипогенез. ¹⁹ Ингибирование протеасомы гемином и некоторыми сконструированными гидрофильными порфиринами до сих пор документировано только в биохимических анализах. ^20,21 Однако, если это подтверждено в биологических системах, эта активность может помочь объяснить аспекты токсичности гемина. Кроме того, в некоторых моделях активация TLR и нижестоящая воспалительная передача сигналов, особенно пути TLR-4, может быть запущена свободным гемином. ^22–24

Таким образом, окончательная патофизиология внеклеточного гемоглобина зависит от времени, количества и тканевой локализации воздействия гемоглобина / гемина в конкретном клиническом состоянии и может быть результатом кумулятивных эффектов, в значительной степени описываемых 4 механизмами, обсуждаемыми в разделы выше.Например, системная и, в некоторой степени, легочная гипертензия является наиболее очевидным и легко измеряемым эффектом свободного Hb после внутрисосудистого гемолиза. Механизмы, вызывающие резкое повышение артериального давления, — это транслокация гемоглобина в субэндотелиальные пространства, локальное истощение NO в стенке сосуда и последующее сужение сосудов. Сосудистые осложнения хронического и / или периодического воздействия гемоглобина, вероятно, будут более сложными, включая воспаление, локализованные окислительные реакции, тромбоз, ремоделирование сосудов и почечную недостаточность. ^25–28 Как указано в следующих разделах, все 4 механизма токсичности гемоглобина и гемина специфически ослабляются природными белками-мусорщиками Hp и Hpx, что объясняет исключительную защитную функцию этих молекул.

Биохимия и физиология Hb и белков-поглотителей гемина

Во время гемолиза от легкого до умеренного, сеть белков-поглотителей, рецепторов и ферментов выполняет клиренс и детоксикацию внеклеточного гемоглобина и гемина. Первичный путь клиренса включает транспорт в паренхиму печени или макрофаги, расщепление порфирина гемоксигеназами на билирубин, монооксид углерода и железо и восстановление железа для эритропоэза de novo.Белки-скавенджеры снижают токсичность гемоглобина и гемина, так что эти потенциально токсичные молекулы захватываются и транспортируются в инертной форме. Белки плазмы с наиболее многообещающим терапевтическим потенциалом — это Hp и Hpx. Эти белки более подробно обсуждаются в следующих разделах.

Hp

Hp коренным образом меняет биохимический и физиологический профиль свободного гемоглобина. ²⁹ При связывании с комплексом Hb: Hp большого размера (> 150 кДа), гемоглобин остается секвестрированным во внутрисосудистом пространстве, и его транслокация в почки и через эндотелиальный слой, по-видимому, предотвращается.Этот простой механизм удерживает потенциально неблагоприятные биохимические реакции свободного гемоглобина с NO и / или пероксидами вдали от наиболее уязвимых анатомических участков, таких как стенка сосудов. Внутрисосудистая секвестрация, по-видимому, является наиболее эффективным способом предотвращения Hb-индуцированной гипертензии и повреждения почек (). Кроме того, гемоглобин остается в восстанавливающей (т.е. богатой антиоксидантами) среде плазмы крови до тех пор, пока не завершится клиренс моноцитов и макрофагов.

Hp Секвестрация Hb. Морским свинкам вводили свободный от стромы Hb (пиковая концентрация гемоглобина в плазме, 150 мкМ гем), и через 10 минут группе животных вводили Hp, полученный из плазмы человека, для достижения эквимолярной концентрации Hb: Hp. (A) Средняя реакция артериального давления до и после лечения Hp. (B) Несвязанный гемоглобин в плазме (красный) до и после введения Hp. Левый сдвиг на хроматограмме указывает на большой молекулярный размер комплекса Hb: Hp с приблизительно 90% связанного Hp и 10% несвязанного Hb.(C) Гемоглобинурия после инфузии Hb (гем 150 мкм) без (-Hp, слева) и с Hp (+ Hp, справа). (D) Отложение железа (коричневое окрашивание) в нормальной почечной коре (слева), инфузия Hb (в центре) и инфузия Hb плюс Hp (справа). (E) Экспрессия HO-1 в почках через 24 часа после воздействия Hb с инфузией Hp и без нее (слева). Денситометрия показана справа от вестерн-блоттинга HO-1. Все данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего.

Недавние эксперименты in vitro показывают, что Hp может также изменять окислительные реакции Hb.Hp снижает окислительно-восстановительный потенциал связанного Hb-Fe ³⁺ , стабилизирует более высокую степень окисления Hb-Fe ⁴⁺ и предотвращает перенос радикалов на молекулы, не являющиеся Hb, в присутствии окислителей. ^30,31 Недавно определенная кристаллическая структура свиного Hb: Hp комплекса обеспечила некоторую структурную основу для защиты важных аминокислот, которые являются основными мишенями окисления глобина. ³² В результате этой защиты окисление глобина с последующей деградацией белка не происходит, когда Hb секвестрируется в комплекс Hb: Hp. ³³ Структурная стабильность комплекса может предотвратить накопление провоспалительных продуктов деградации Hb, которые могут уклоняться от выведения рецепторами скавенджеров. ^14,34 Кроме того, гемин прочно находится в комплексе Hb: Hp, он не может переноситься на акцепторы гемина, такие как Hpx, липопротеины и альбумин. ³⁵ Следовательно, предотвращение переноса гемина является еще одним важным механизмом, с помощью которого Hp защищает от Hb-управляемого окисления мембранных липидов и липопротеинов плазмы, предотвращая накопление свободного гемина.

Генетическая гетерогенность состава α-субъединицы Hp у человека допускает существование структурного полиморфизма с димерным Hp 1-1 (α ₂ β ₂ ) и гетерогенными мультимерными Hp 2-2 и Hp 2-1 (α _{> 2} β _{> 2} ) фенотипов. ³⁶ Каждая β-цепь Hp может связывать один димер Hb αβ, обеспечивая 2 сайта связывания в Hp 1-1 и множественные сайты связывания в Hp 2-2. Способность связывать белок и основные биохимические функции Hp 1-1 и Hp 2-2 равны, поскольку они связаны с клиренсом Hb и детоксикацией (D.J.S. и P.W.B., представленная рукопись). Молекулярная основа очевидной ассоциации генотипа Hp 2-2 с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний в некоторых популяциях пациентов с высоким риском остается невыясненной. ^36,37

Продукт Hp, полученный из плазмы человека, был разработан Японским Зеленым Крестом (ныне Benesis Corporation) и был одобрен в 1985 году для лечения гемолиза, вызванного экстракорпоральным кровообращением, ожоговых травм и травм при массивных переливаниях крови. ().Последующие результаты нескольких небольших исследований показали, что добавление Hp может предотвратить повреждение почечных канальцев во время операции на открытом сердце с искусственным кровообращением, синдрома HELLP (гемолиз повышенных ферментов печени с низким уровнем тромбоцитов) и после гемолиза, осложняющего эндоскопическую инъекционную склеротерапию варикозно расширенных вен пищевода этаноламином. олеат (). Отчеты о случаях и исследования ограниченного числа пациентов дополнительно подтверждают успешное использование Hp у пациентов с гемолитической анемией (т. Е. Талассемией и дефицитом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы), тяжелой ожоговой травмой, у пациентов с гемолизом в результате случайной АВО-несовместимости. Переливание эритроцитов, а также в качестве профилактики или лечения гемолиза после трансплантации костного мозга, несоответствующего АВО.Основными клиническими критериями введения и дозирования Hp в этих исследованиях были появление и устранение гемоглобинурии с целью ограничения почечного повреждения. Сообщенные дозы Hp, которые вводили для лечения острых гемолитических состояний, составляли примерно от 2 г до> 10 г на пациента, при схемах дозирования повторяющихся болюсов 2 г (дети) или 4 г (взрослые). Стоимость терапевтического препарата Hp в Японии в настоящее время составляет 540 долларов США за 2 г болюса. Насколько нам известно, до сих пор не сообщалось об использовании Hp при хронических гемолитических состояниях, при которых могло бы потребоваться повторное дозирование в течение более длительного периода лечения для эффективного подавления уровней свободного гемоглобина в плазме.

Таблица 1

Цитируемое в литературе клиническое использование гаптоглобина в Японии

шунтирование артерии у пациента с β-талассемией и тяжелым гемолизом 902 73 Гемолитическая трансфузионная реакция87 903 71> 20 г Один пациент с дефицитом фосфата История болезни (мальчик 24 мес.)

Клиническое состояние	Субъекты / контрольная группа	Доза гаптоглобина	Первичный результат (намерение лечения)	Ссылка	Кардио	шунтирование	16/21	6 г	Профилактика острой почечной недостаточности	Hashimoto et al 87
14/0	4 г	Tanaka et al 88
Отчет об одном случае		Horai et al 89
Трансплантация стволовых клеток периферической крови	Отчет об одном случае	3 г	острая почечная недостаточность	Tsuda et al 90
Отчет об отдельном случае	6 г	Профилактика острой почечной недостаточности	Homann et al 91
Массовое переливание крови	16/34	6 г	Неопределенная польза и др. 92
Экстракорпоральное кровообращение	10/10	6 г	Профилактика острой почечной недостаточности	Канамори и др. 93
Синдром HELLP	17/17	Профилактика острой почечной недостаточности	Yamamoto et al 94
ABO-несовместимая трансплантация BM	Два отчета о случаях болезни	11 г	Профилактика острой почечной недостаточности	Ito
Термическое повреждение	Отчет об отдельном случае (повторная терапия большими дозами)	Улучшение результата	Имаизуми и др. 96
		Профилактика гемоглобинурии и острой почечной недостаточности	Йошиока и др. 97
Дефицит глюкозы-6-фосфата	8.5 г	Профилактика гемоглобинурии	Ohga et al 98
Открытый артериальный проток у взрослых, спиральная эмболизация	Случай одного пациента	45 г	Предупреждение гемоглобинурии 99250

Hpx

Hpx представляет собой гемин-связывающий гликопротеин плазмы, который формирует вторую линию защиты от внутрисосудистого гемолиза, связанного с высвобождением гемина из Hb-Fe ³⁺ .Множественные белки связывают гемин, включая альбумин (Kd, приблизительно 10 ^-8 M) и липопротеиновые частицы LDL / HDL (Kd, от 10 ^-10 M до 10 ^-11 M). Однако Hpx (Kd <10 ^-13 M) является наиболее эффективным гемин-связывающим белком, который изолирует порфирин в окислительно инертной гексакоординированной конформации в комплексе со стехиометрией 1: 1. ^38–42 Наиболее важной функцией Hpx в плазме и тканях, вероятно, является защита чувствительных липопротеинов от окислительных модификаций и ограничение взаимодействия гемина с рецепторами клеточной поверхности, такими как TLR-4. ^24,38,43 В моделях воздействия гемина с использованием мышей с нокаутом Hpx белок-мусорщик продемонстрировал ослабление индуцированной гемином активации эндотелиальных клеток, вазоокклюзии в печени и повреждения почек. ^27,44 В той же модели данные показали, что Hpx сдвигает гемин в плазме к эндоцитозу и разложению в гепатоцитах.

Как и уровни Hp, уровни Hpx в плазме обычно истощаются в условиях внутрисосудистого гемолиза, что позволяет предположить, что добавление белка плазмы может принести некоторую пользу пациентам. ⁴⁵ Однако ни один продукт Hpx не доступен с качеством, которое позволило бы проводить более обширные исследования in vivo, помимо моделей на мышах. Следовательно, расширенные исследования лечения Hpx могут оказаться невозможными в ближайшем будущем для более крупных животных моделей соответствующих клинических состояний, таких как переливание крови или аортокоронарное шунтирование и экстракорпоральное кровообращение.

Hb и рецепторы скавенджеров гемина

Эндоцитарные рецепторы очищают биохимически инертные циркулирующие комплексы Hb: Hp и гемин: Hpx из кровотока.Эксперименты in vitro и ex vivo продемонстрировали, что макрофаги и моноциты периферической крови, соответственно, являются первичными типами клеток, которые очищают Hb и Hb: Hp комплексы посредством связывания и интернализации рецептора скавенджера CD163. ^46–49 Сильная индукция CD163 при лечении глюкокортикоидами у пациентов с аутоиммунными заболеваниями определила рецептор скавенджера Hb как потенциальную терапевтическую мишень. ⁵⁰ Удаление «эндогенного» Hb: Hp — быстрый процесс после легкого гемолиза; однако данные, полученные на животных моделях инфузии Hb: Hp или внутрисосудистого гемолиза с терапевтическим введением Hp, предполагают более медленный клиренс в зависимости от уровня накопления Hb: Hp и оцениваемых видов.Мы наблюдали длительный период полувыведения из кровообращения, составляющий примерно 12 часов, для комплексов Hb: Hp человека и собак у гончих собак с начальной концентрацией в плазме примерно 150 мкМ (гем). Период полувыведения человеческого комплекса Hb: Hp составлял приблизительно 16 часов при той же концентрации в плазме у морских свинок (D.J.S. и P.W.B., неопубликованные данные). Недавняя работа показывает, что специфичность связывания CD163 для Hb и комплекса Hb: Hp, соответственно, имеет значительную межвидовую изменчивость, поэтому порог насыщения механизмов клиренса у людей и некоторых лабораторных животных может значительно различаться. ⁵¹ Таким образом, для ранних испытаний на людях будет иметь решающее значение определить фармакокинетику комплекса Hb: Hp при различных внутрисосудистых концентрациях, которые соответствуют условиям однократного или многократного введения Hp во время острого, прерывистого и хронического гемолиза. Концепция клиренса, аналогичная концепции комплекса Hb: Hp, была предложена для клиренса комплекса гемин-Hpx, который связывается и интернализуется белком, связанным с рецептором ЛПНП (LRP) / CD91 на гепатоцитах, где гемин расщепляется HO. -1. ^52,53

Истощение комплексов Hp и Hpx через их родственные рецепторы во время острого и хронического внутрисосудистого гемолиза способствует патофизиологическим последствиям, изложенным в, которые, как мы предполагаем, могут быть прерваны добавками.

Роль Hb, гема и их белков-поглотителей в конкретных заболеваниях человека

Серповидно-клеточная анемия и другие гематологические заболевания.

Гемолиз и вазоокклюзия — отличительные признаки серповидно-клеточной анемии.На внутрисосудистый гемолиз приходится одна треть разрушения эритроцитов, что приводит к увеличению свободного гемоглобина и гемина в плазме. В 1960-х годах было признано, что уровни свободного гемоглобина в плазме могут достигать 25 мкм во время серповидно-клеточного кризиса, а базальные уровни гемоглобина в плазме составляют 5-10 мкм у пациентов с серповидно-клеточным синдромом. Было обнаружено, что уровни Hp и Hpx истощены. ⁴⁵ Низкий уровень Hp и повышенный уровень свободного гемоглобина в плазме были связаны с повышенным уровнем карбонила белка и нитротирозина при серповидно-клеточной анемии. ⁵⁴ Было обнаружено, что клинически неосложненные приступы боли связаны с повышением уровня гемоглобина в плазме, ^55,56 и низкие уровни Hp коррелировали с легочной гипертензией при серповидно-клеточной анемии. ⁵⁷ Хотя зарегистрированные уровни гемоглобина в плазме у пациентов с серповидноклеточными клетками намного ниже, чем уровни гемоглобина в плазме, которые были исследованы в гемодинамических исследованиях введения HBOC и некоторых моделях тяжелого гемолиза на животных, эти данные предполагают, что свободный гемоглобин может быть сильным патофизиологическим фактором. компонент сосудистых осложнений серповидноклеточной анемии.

Патофизиологические гипотезы сосредоточены на причинной связи между Hb-опосредованным потреблением NO, сосудистыми осложнениями и повышенным давлением в легочной артерии.В этих важных исследованиях повышенная регургитация струи трикуспидального клапана (TRV)> 2,5 м / с была определена как суррогатный маркер легочной гипертензии у пациентов с серповидно-клеточной анемией. Повышенный TRV был обнаружен у 30% пациентов с серповидно-клеточной анемией и хорошо коррелировал с маркерами гемолиза. ⁵⁸ Как правило, уровни гемоглобина в плазме у пациентов с серповидноклеточными клетками на несколько порядков ниже, чем уровни, которые изучались в классических экспериментальных моделях опосредованного гемоглобином или HBOC-опосредованным истощением и вазоконстрикции NO.Однако концентрации свободного гемоглобина 6 мкМ нарушали сосудорасширяющую реакцию на инфузию нитропруссида, что позволяет предположить, что низкие концентрации свободного гемоглобина в плазме у пациентов с серповидноклеточными клетками все еще могут критически ограничивать биодоступность NO и способствовать сужению сосудов, активации тромбоцитов и коагулопатии. ^59–61 В совокупности было выдвинуто предположение, что эти эффекты являются причиной легочной гипертензии и других сосудистых осложнений. Совсем недавно в двух независимых исследованиях из Франции ⁶² и Бразилии ⁶³ использовалась катетеризация правых отделов сердца (золотой стандарт диагностики легочной гипертензии) в дополнение к эхокардиографии для оценки пациентов с серповидно-клеточной анемией.Эти французские и бразильские исследования подтвердили, что у значительной части пациентов с серпом увеличилось TRV, но только у 6% и 10% пациентов соответственно была легочная гипертензия, подтвержденная катетеризацией правых отделов сердца. Еще меньше пациентов (2,75% и 3,75%) имели прекапиллярный паттерн легочной гипертензии, который можно было бы ожидать как типичный гемодинамический паттерн, если бы истощение NO и вазоконстрикция в малом круге кровообращения были первичным патофизиологическим механизмом. В обоих исследованиях уровни лактатдегидрогеназы были значительно выше у пациентов с подтвержденной легочной гипертензией.Таким образом, был сделан вывод, что легочная гипертензия у пациентов с серповидноклеточной анемией вызвана сложной многофакторной патофизиологией, которая может включать истощение NO, вазоконстрикцию, тромбоэмболическую окклюзию сосудов, поражение левого желудочка, хроническое ремоделирование сосудов и вторичные гемодинамические эффекты, вызванные гипердинамическим кровообращением. у многих пациентов с более тяжелой или хронической анемией. ^64,65 Количественный вклад этих индивидуальных факторов и особая роль свободного гемоглобина и гемина в патофизиологии сосудистых осложнений при серповидно-клеточной анемии остается важной областью для дальнейшей механистической оценки в клинических условиях.

Мышиные модели серповидно-клеточной анемии продолжают поддерживать критическую роль гемолиза и свободного Hb и гемина, соответственно, в вазоокклюзионных осложнениях. ⁶⁶ Серповидные мыши имеют внутрисосудистый гемолиз, о чем свидетельствует повышенный уровень Hb в плазме, снижение Hp и Hpx, а также повышение ретикулоцитов и билирубина в плазме. В исследованиях с использованием модели сосудистого стаза индукция или сверхэкспрессия HO-1 подавляла сосудистый застой, вызванный гипоксией. ^67–69 Более того, инфузия гемоглобина или гема серповидным мышам вызвала застой сосудов, который мог быть подавлен добавлением Hp или Hpx. ⁷⁰ В прооксидантной среде серповидноклеточной анемии Hb-Fe ²⁺ может реагировать с NO или другими окислителями с образованием Hb-Fe ³⁺ , из которого высвобождается гемин. ⁶⁹ В отсутствие Hp и Hpx гем плазмы может взаимодействовать с альбумином или другими белками плазмы и / или липопротеинами, но в конечном итоге гем распределяется по клеткам сосудистой сети, включая эндотелиальные клетки и лейкоциты. Гидрофобность гема позволяет ему проникать в клеточные мембраны и активировать сигнальные пути TLR-4, которые запускают провоспалительные и протромботические реакции, тем самым способствуя адгезии клеток крови и вазоокклюзии. ^24,70

Эпидемиологические и экспериментальные данные подтверждают концепцию, согласно которой замена Hp и / или Hpx может ослабить или предотвратить осложнения, связанные с ускоренным внутрисосудистым гемолизом при серповидно-клеточной анемии.

Существует множество других гематологических заболеваний, при которых гемолиз представляет собой первичный патологический процесс (например, талассемия, пароксизмальная ночная гемоглобинурия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) или вторичное явление (например, гемолитико-уремический синдром или тромботическая тромбоцитопеническая пурпура).Хотя вклад свободного гемоглобина и токсичности гемина в исход заболевания не исследовался в этой более широкой области гемолитических расстройств, более широкая доступность Hp и Hpx предоставит нам необходимые инструменты для систематического изучения терапевтического потенциала нейтрализации гемоглобина / гемина при эти многофакторные заболевания.

Переливание крови.

Ретроспективный анализ данных показывает, что переливание крови, хранящейся ранее (около 42 дней), приводит к увеличению заболеваемости и смертности по сравнению с кровью более новой крови. ⁷¹ Повышенная заболеваемость обычно связана с подавлением иммунитета, инфекциями, сердечно-сосудистыми осложнениями и острым / хроническим повреждением почек. Одно из наиболее важных последствий так называемого «повреждения накопления эритроцитов» связано с уменьшением деформируемости, повышенной хрупкостью in vivo и восприимчивостью эритроцитов к атаке со стороны компонентов иммунной системы. Эти изменения могут сопровождаться повышенным гемолизом старых накопленных эритроцитов.

Хотя клиническое влияние продолжительности хранения крови на клинический исход остается спорным, было разработано множество моделей для оценки эффектов гемолиза и токсичности гемоглобина. ^72–75 Морские свинки, подвергшиеся массивному переливанию (эквивалент> 10 единиц) максимально сохраненной крови морских свинок, продемонстрировали повышенные концентрации гемоглобина в плазме в течение 24-часового периода в результате посттрансфузионного гемолиза. ⁷⁶ Это было связано с повышенной гемоглобинурией, острой почечной недостаточностью, гипертонией и повреждением сосудов. Совместное слияние Hp со старой запасенной кровью привело к ослаблению неблагоприятных почечных и сосудистых эффектов, напоминая эффект переливания новой крови.Эти наблюдения подтверждаются несколькими исследованиями, предполагающими, что переливание крови мышам, крысам и овцам связано с повышенным кровяным давлением, истощением NO и повышением концентрации гемоглобина в плазме. ^74,75,77 Связанные с гемоглобином осложнения при переливании крови у людей также были связаны с несоответствием по ABO и массивным переливанием (> 10 единиц / 24 часа).

Клинически Hp использовался для лечения неблагоприятных исходов переливания крови в Японии, и основным сообщенным результатом терапевтического лечения Hp, по-видимому, является предотвращение повреждения почечных канальцев ().

Сепсис и малярия.

Гемолиз также может возникать при тяжелой бактериальной инфекции и сепсисе, а истощение Hpx связано с более тяжелым заболеванием и летальным исходом. ⁷⁸ В рамках этих сложных болезненных процессов гемин может действовать как активатор врожденного иммунитета через активацию рецептора распознавания образов (например, TLR-4), за счет синергетических эффектов с микробными продуктами или эндогенными провоспалительными лигандами (например, HMGB1) или через перекисное повреждение тканей. ^24,79,80 Исследования на мышах показали, что чистый эффект свободного гемина при полимикробном сепсисе может быть пагубным и что нейтрализация гемина введением Hpx улучшает этот эффект. ⁷⁸

Защитное действие Hpx при сепсисе может включать в себя контроль чрезмерной перекисной активности гемина, ингибирование взаимодействий рецепторов врожденного иммунитета и перенаправление свободного гемина от чувствительных тканей к его удалению в печени. Ограничение доступа гемина к железу гемоглобином и белками-поглотителями гемина может быть еще одним защитным механизмом против тяжелых инфекций, вызываемых некоторыми бактериальными штаммами. ^81,82 Активность Hpx in vivo может также включать активности Hpx, которые не зависят от его первичной функции поглотителя гемина. Результат такой активности был отмечен как противовоспалительный в некоторых случаях (например, Hpx ослабляет секрецию воспалительных цитокинов стимулированными липополисахаридом макрофагами ⁸³ ), тогда как нарушение бактериального клиренса было обнаружено как следствие подавления миграции нейтрофилов в других исследованиях на мышах. . ⁸⁴ На данный момент неизвестно, являются ли такие не связанные с гемином эффекты Hpx врожденной активностью самого белка или же они являются побочными эффектами, вызванными примесями или продуктами разложения в некоторых препаратах Hpx, полученных из плазмы. ⁸⁵

На мышиных моделях малярии окислительное повреждение, вызванное Hb / гемином, и истощение NO были связаны с развитием церебральной малярии. ⁸⁶ Однако, хотя мы подозреваем, что эта патофизиология может быть ослаблена лечением Hp и / или Hpx, эффективность белков-поглотителей еще не была протестирована для этого конкретного состояния.

Заключение: существует ли неудовлетворенная потребность в терапевтических средствах на основе белка-поглотителя?

Множественные гематологические и негематологические болезненные состояния связаны с лизисом эритроцитов, а побочные эффекты свободного гемоглобина и гемина потенциально осложняют клинический исход заболевания.В настоящее время не существует действенной терапии, предназначенной для ослабления побочных эффектов свободного гемоглобина и гемина. Заместительное или супрафизиологическое дозирование Hp и / или Hpx для соответствия острому или продолжающемуся гемолизу может иметь терапевтическую пользу за счет ослабления многих патофизиологий, которые мы обсуждаем в этой перспективе, и нескольких клинических ситуаций, в которых гемоглобин способствует острому (например, острое повреждение почек) или хронические (например, ремоделирование сосудов) последствия. Очищенный плазмой Hp продается в Японии с 1985 г. с основными показаниями к применению в сочетании с экстракорпоральным кровообращением, массивным переливанием крови и термической травмой.Основным терапевтическим эффектом при этих болезненных состояниях является защита почек от токсичности, вызванной гемоглобином. ⁸⁷ На данный момент не существует терапевтического опыта лечения Hpx в клинических условиях. Однако несколько фармацевтических компаний, базирующихся в США и Европе, приступили к разработке проектов по фракционированию Hp и Hpx из плазмы крови человека для использования в качестве терапевтических средств при гемолитических заболеваниях. В 2011 году Hp, полученный из плазмы человека, получил статус орфанного лекарства для лечения серповидно-клеточной анемии в Европейском союзе.Однако на сегодняшний день доклинические доказательства концепции Hp и Hpx изучались в общем контексте патофизиологии, связанной с Hb и гемолизом, а не с целью лечения конкретного заболевания. В большинстве стран лекарства / биопрепараты одобряются на основании улучшения исходов заболевания и приемлемой безопасности по показаниям. Следовательно, рациональный выбор потенциальных показаний, графиков доз и дизайна клинических испытаний для достижения измеримых результатов и приемлемых профилей безопасности будет иметь решающее значение для успешного продвижения представленных здесь концепций в направлении улучшения ухода за пациентами.Эти и другие вопросы создадут захватывающие фундаментальные научные, клинические и нормативные проблемы в процессе разработки терапевтических средств, поглощающих гемоглобин / гемин.

Авторство

Вклад: D.J.S., P.W.B., A.I.A., J.D.B. и G.M.V. участвовал в написании и редактировании этой статьи.

Раскрытие информации о конфликте интересов: J.D.B. и G.M.V. получают финансирование исследований от Sangart Inc. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Переписка: Доминик Я.Schaer, MD, Отделение внутренней медицины, Университетская больница, CH-8091 Цюрих, Швейцария; электронная почта: [email protected]; или Грегори М. Верчеллотти, MD, FACP, Отделение гематологии, онкологии и трансплантологии, Медицинская школа Университета Миннесоты, D495 Mayo Memorial Bldg, MMC 480, 420 Delaware St SE, Minneapolis, MN 55455; электронная почта: ude.nmu@100ecrev.

изучают гемоглобин и поглотители гемина как новый класс терапевтических белков.

Реферат

Гемолиз возникает при многих гематологических и негематологических заболеваниях.Было обнаружено, что внеклеточный гемоглобин (Hb) вызывает определенные патофизиологии, которые связаны с неблагоприятными клиническими исходами у пациентов с гемолизом, такими как острые и хронические сосудистые заболевания, воспаление, тромбоз и почечная недостаточность. Среди молекулярных характеристик внеклеточного гемоглобина наиболее критическими являются перемещение молекулы во внесосудистое пространство, окислительные реакции и реакции оксида азота, высвобождение гемина и молекулярные сигнальные эффекты гемина. Ограниченный клинический опыт с продуктом гаптоглобина (Hp), полученным из плазмы, в Японии и более недавние доклинические исследования на животных показывают, что природный Hb и белки-поглотители гемина Hp и гемопексин обладают сильным потенциалом для нейтрализации неблагоприятных физиологических эффектов Hb и гемина.Сюда входят такие разнообразные состояния, как переливание эритроцитов, серповидноклеточная анемия, сепсис и экстракорпоральное кровообращение. В этой перспективе рассматриваются основные механизмы токсичности гемоглобина и гемина при различных болезненных состояниях, обновляется информация о том, как природные поглотители эффективно контролируют эти токсические составляющие, и исследуются критические вопросы развития Hp и гемопексина, полученных из плазмы человека, в качестве терапевтических средств для пациентов с чрезмерным внутрисосудистым гемолизом. .

Введение

Когда гемоглобин (Hb) вырывается из эритроцитов из-за гемолиза, обнаженный гемоглобин, лишенный своих антиоксидантов, которые обычно присутствуют в эритроцитах, может нанести окислительный ущерб сосудистой сети и обнаженным тканям. ¹ Чтобы нейтрализовать гемоглобин и его реактивную группу протопорфирина-IX железа (гемина), специализированные белки-поглотители плазмы улавливают токсичные части и доставляют их в компартменты, где гемоксигеназы могут расщеплять гемин на менее токсичные метаболиты. Другие молекулы и восстанавливающие вещества вносят свой вклад в эту защитную физиологию. Однако, когда эти системы очистки и детоксикации нарушены внутрисосудистым гемолизом, например, при серповидно-клеточной анемии, переливании крови, малярии или сепсисе, гемоглобин и гемин вызывают дисфункцию сосудов и органов, что приводит к неблагоприятным клиническим эффектам ().В этой перспективе рассматриваются механизмы токсичности гемоглобина при различных болезненных состояниях, обновляется информация о том, как гаптоглобин (Hp) и гемопексин (Hpx) эффективно обрабатывают свободный гемоглобин и гемин, а также исследуется, почему пришло время рассматривать эти белки в качестве терапевтических средств у пациентов с чрезмерным внутрисосудистым гемолизом. .

Схематическое резюме компартментов клиренса Hb и основных острых и хронических патологий, которые могут быть связаны с внутрисосудистым гемолизом. Доступность Hb и белков-поглотителей гемина Hp и Hpx сдвигает физиологический баланс от повреждения тканей к защите.

Внеклеточный гемоглобин и гемин являются многокомпонентными триггерами болезненных процессов

Неблагоприятные клинические эффекты, связанные с избыточным свободным гемоглобином, могут быть отнесены к нескольким специфическим структурным и биохимическим свойствам молекулы гемоглобина и вызваны следующими 4 взаимно взаимодействующими механизмами: (1) внесосудистая транслокация гемоглобина, которая является основным требованием, чтобы гемоглобин и гемин могли проявить свою неблагоприятную реактивность в тканях; (2) оксид азота и окислительные реакции; (3) высвобождение свободного гемина; и (4) молекулярно-сигнальные эффекты гемина.Эти механизмы описаны в следующих разделах и кратко описаны в.

Краткое схематическое описание основных механизмов токсичности гемоглобина и защиты белков-скавенджеров плазмы Hp и Hpx.

Механизм 1: внесосудистая транслокация Hb

После гемолиза гемоглобин находится в динамическом равновесии тетрамера и гетеродимеров αβ-субъединицы с преобладающим димерным состоянием при низких концентрациях гемоглобина в плазме. αβ-Димеры имеют относительно небольшой размер молекулы (32 кДа), что обеспечивает транслокацию белков и доступ к уязвимым анатомическим участкам (например, почкам и стенке сосудов).Воздействие Hb на ткани наиболее очевидно в случаях явной гемоглобинурии после массивного внутрисосудистого гемолиза, но Hb также способен перемещаться через эндотелиальные барьеры, проникая в субэндотелиальное и периваскулярное пространства и лимфатическую жидкость. ^2,3

Механизм 2: NO и окислительные реакции

Второй механизм токсичности гемоглобина — прооксидантная реактивность гемоглобина в плазме или тканях после экстравазации. Наиболее широко изучены реакции Hb с оксидом азота (NO) и физиологическими окислителями (например, перекисью водорода и перекисями липидов).Потребление NO и последующее окисление гемоглобина происходит через 2 реакции: (1) диоксигенация оксигалогеном оксигенатом NO, что приводит к образованию нитрата (NO ₃ ^—) и Hb железа (Hb-Fe ³⁺ ) и (2) нитрозилирование железом дезокси-Hb, которое происходит путем прямого связывания NO железом с нелегированным железом Hb (Hb-Fe ²⁺ ).

Современное понимание биохимии и патофизиологии этих реакций во многом основано на изучении переносчиков кислорода на основе гемоглобина (HBOC) и их хорошо задокументированных побочных эффектов на гемодинамику. ⁴ Целевой мутагенез гемоглобина, направленный на ограничение взаимодействий с NO или химических модификаций для ограничения доступа к участкам биодоступности NO в сосудистой стенке (например, путем химического сшивания гемоглобина в крупные полимеры или конъюгаты с декорированной поверхностью), ослабляет вазоконстрикцию и гипертония. ^5,6 Таким образом, истощение NO внеклеточным Hb в настоящее время является широко принятой гипотезой, объясняющей острую гипертензивную реакцию, которая возникает во время массивного гемолиза (достижение умеренного или высокого уровня свободного Hb в плазме) или во время инфузии HBOC. ^6,7 В дополнение к истощению сосудов, другим результатом реакций Hb-NO может быть образование Hb-Fe ³⁺ в паренхиме ткани. Накопление Hb-Fe ³⁺ в тканях может способствовать высвобождению гемина и / или передаче гемина другим белкам / липидам со вторичной токсичностью, обусловленной свободным гемином.

Биохимия реакции гемоглобина с пероксидами изучалась в течение последних 40 лет, ⁸ , но значение этих реакций для патофизиологии, вызываемой гемоглобином и гемином, все еще недостаточно определено.Предположение, что окислительные побочные реакции гемоглобина могут быть важной детерминантой токсичности гемоглобина, было основано на наблюдениях, что пероксиды образуются и высвобождаются во внеклеточное пространство в относительно больших количествах во время воспаления и ишемии-реперфузии. В условиях in vitro реакция Hb с пероксидом приводит к образованию Hb-Fe ³⁺ , форм железа с более высоким окислением, таких как феррил Hb (Hb-Fe ⁴⁺ ), и связанных радикалов (механизм II). Было высказано предположение, что свободные радикалы в цепи глобина доступны для локализованного окисления аминокислот (например, внутри Hb) или переноса радикалов на молекулы, не являющиеся Hb (например, липопротеины). ^9,10 Предполагаемый конечный результат этих реакций — саморазрушение гемоглобина, потеря гемина и сшивание / осаждение цепи глобина, что в конечном итоге может привести к повреждению ткани. ¹¹ Следует отметить, что предполагаемое влияние этих реакций на болезненные состояния основано на ограниченных и косвенных экспериментальных данных, поэтому остается неясным, образуются ли значительные количества Hb-Fe ⁴⁺ и радикалов во время гемолиза in vivo и если они способствуют развитию болезни.Единственными окисленными видами гемоглобина, которые могут быть последовательно определены количественно in vivo, являются Hb-Fe ³⁺ и гемихром, структурно искаженная форма Hb-Fe ³⁺ . Несоответствие между биохимическими наблюдениями in vitro и результатами in vivo может быть связано с изменением баланса между реакциями окисления и восстановления в условиях in vivo. ¹² Доступность больших количеств низкомолекулярных и ферментативных восстановителей может снизить стабильность разновидностей гемоглобина с более высокой степенью окисления и радикалов, производных гемоглобина, до неопределяемых уровней.Внутримолекулярные поперечные связи Hb, ковалентные аддукты порфирин-глобин и окисление аминокислот глобиновой цепи были определены как суррогатные маркеры для образования Hb-Fe ⁴⁺ . Такие модификации были обнаружены в гемоглобине, выделенном из спинномозговой жидкости после субарахноидального кровоизлияния и из мочи, что позволяет предположить, что перекисные реакции могут способствовать токсичности гемоглобина in vivo. ^13,14

Механизм 3: высвобождение и перенос гемина

Третий механизм токсичности гемоглобина связан с высвобождением гемина из Hb-Fe ³⁺ , который является основным продуктом окислительных реакций, описанных в предыдущем разделе. .Высвобождение гемина позволяет переносить реактивный порфирин на клеточные мембраны или растворимые белки и липиды плазмы и обеспечивает свободный гемин в качестве лиганда для молекулярных сигнальных взаимодействий. Как гидрофобная молекула, маловероятно, что значительные количества свободного мономерного гемина могут присутствовать в плазме. Следовательно, перенесенный гемин в форме геминового белка с низким сродством (например, гемин-альбумин) или гемин-липидных комплексов является наиболее вероятными физиологическими конечными продуктами высвобождения гемина. В зависимости от белковой или липидной среды свободный протопорфирин железа может действовать как промежуточный продукт и превращать реципиентную молекулу в реактивный конечный продукт.Наиболее идентифицируемым токсичным конечным продуктом высвобождения гемина является окисленный липопротеин низкой плотности (oxLDL). ¹⁵ Окисление ЛПНП и связанная с ним воспалительная и цитотоксическая активность представляет собой важный пример способности Hb вызывать повреждение сосудов. ^16,17

Механизм 4: молекулярные сигнальные эффекты гемина

Гемин может избирательно связываться с несколькими рецепторами, факторами транскрипции и ферментами и тем самым изменять состояние активации клеток, транскрипцию генов и метаболизм.Наиболее четко определенным взаимодействием является связывание гемина с репрессором транскрипции Bach-1, который регулирует транскрипцию гемоксигеназы 1 (HO-1) и других антиоксидантных ферментов, необходимых для адаптивного ответа на повышенные уровни внутриклеточного гемина. ¹⁸ Гемин также является лигандом рецептора ядерного гормона REV-ERB, который регулирует циркадный ритм, метаболизм глюкозы и адипогенез. ¹⁹ Ингибирование протеасомы гемином и некоторыми сконструированными гидрофильными порфиринами до сих пор документировано только в биохимических анализах. ^20,21 Однако, если это подтверждено в биологических системах, эта активность может помочь объяснить аспекты токсичности гемина. Кроме того, в некоторых моделях активация TLR и нижестоящая воспалительная передача сигналов, особенно пути TLR-4, может быть запущена свободным гемином. ^22–24

Таким образом, окончательная патофизиология внеклеточного гемоглобина зависит от времени, количества и тканевой локализации воздействия гемоглобина / гемина в конкретном клиническом состоянии и может быть результатом кумулятивных эффектов, в значительной степени описываемых 4 механизмами, обсуждаемыми в разделы выше.Например, системная и, в некоторой степени, легочная гипертензия является наиболее очевидным и легко измеряемым эффектом свободного Hb после внутрисосудистого гемолиза. Механизмы, вызывающие резкое повышение артериального давления, — это транслокация гемоглобина в субэндотелиальные пространства, локальное истощение NO в стенке сосуда и последующее сужение сосудов. Сосудистые осложнения хронического и / или периодического воздействия гемоглобина, вероятно, будут более сложными, включая воспаление, локализованные окислительные реакции, тромбоз, ремоделирование сосудов и почечную недостаточность. ^25–28 Как указано в следующих разделах, все 4 механизма токсичности гемоглобина и гемина специфически ослабляются природными белками-мусорщиками Hp и Hpx, что объясняет исключительную защитную функцию этих молекул.

Биохимия и физиология Hb и белков-поглотителей гемина

Во время гемолиза от легкого до умеренного, сеть белков-поглотителей, рецепторов и ферментов выполняет клиренс и детоксикацию внеклеточного гемоглобина и гемина. Первичный путь клиренса включает транспорт в паренхиму печени или макрофаги, расщепление порфирина гемоксигеназами на билирубин, монооксид углерода и железо и восстановление железа для эритропоэза de novo.Белки-скавенджеры снижают токсичность гемоглобина и гемина, так что эти потенциально токсичные молекулы захватываются и транспортируются в инертной форме. Белки плазмы с наиболее многообещающим терапевтическим потенциалом — это Hp и Hpx. Эти белки более подробно обсуждаются в следующих разделах.

Hp

Hp коренным образом меняет биохимический и физиологический профиль свободного гемоглобина. ²⁹ При связывании с комплексом Hb: Hp большого размера (> 150 кДа), гемоглобин остается секвестрированным во внутрисосудистом пространстве, и его транслокация в почки и через эндотелиальный слой, по-видимому, предотвращается.Этот простой механизм удерживает потенциально неблагоприятные биохимические реакции свободного гемоглобина с NO и / или пероксидами вдали от наиболее уязвимых анатомических участков, таких как стенка сосудов. Внутрисосудистая секвестрация, по-видимому, является наиболее эффективным способом предотвращения Hb-индуцированной гипертензии и повреждения почек (). Кроме того, гемоглобин остается в восстанавливающей (т.е. богатой антиоксидантами) среде плазмы крови до тех пор, пока не завершится клиренс моноцитов и макрофагов.

Hp Секвестрация Hb. Морским свинкам вводили свободный от стромы Hb (пиковая концентрация гемоглобина в плазме, 150 мкМ гем), и через 10 минут группе животных вводили Hp, полученный из плазмы человека, для достижения эквимолярной концентрации Hb: Hp. (A) Средняя реакция артериального давления до и после лечения Hp. (B) Несвязанный гемоглобин в плазме (красный) до и после введения Hp. Левый сдвиг на хроматограмме указывает на большой молекулярный размер комплекса Hb: Hp с приблизительно 90% связанного Hp и 10% несвязанного Hb.(C) Гемоглобинурия после инфузии Hb (гем 150 мкм) без (-Hp, слева) и с Hp (+ Hp, справа). (D) Отложение железа (коричневое окрашивание) в нормальной почечной коре (слева), инфузия Hb (в центре) и инфузия Hb плюс Hp (справа). (E) Экспрессия HO-1 в почках через 24 часа после воздействия Hb с инфузией Hp и без нее (слева). Денситометрия показана справа от вестерн-блоттинга HO-1. Все данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего.

Недавние эксперименты in vitro показывают, что Hp может также изменять окислительные реакции Hb.Hp снижает окислительно-восстановительный потенциал связанного Hb-Fe ³⁺ , стабилизирует более высокую степень окисления Hb-Fe ⁴⁺ и предотвращает перенос радикалов на молекулы, не являющиеся Hb, в присутствии окислителей. ^30,31 Недавно определенная кристаллическая структура свиного Hb: Hp комплекса обеспечила некоторую структурную основу для защиты важных аминокислот, которые являются основными мишенями окисления глобина. ³² В результате этой защиты окисление глобина с последующей деградацией белка не происходит, когда Hb секвестрируется в комплекс Hb: Hp. ³³ Структурная стабильность комплекса может предотвратить накопление провоспалительных продуктов деградации Hb, которые могут уклоняться от выведения рецепторами скавенджеров. ^14,34 Кроме того, гемин прочно находится в комплексе Hb: Hp, он не может переноситься на акцепторы гемина, такие как Hpx, липопротеины и альбумин. ³⁵ Следовательно, предотвращение переноса гемина является еще одним важным механизмом, с помощью которого Hp защищает от Hb-управляемого окисления мембранных липидов и липопротеинов плазмы, предотвращая накопление свободного гемина.

Генетическая гетерогенность состава α-субъединицы Hp у человека допускает существование структурного полиморфизма с димерным Hp 1-1 (α ₂ β ₂ ) и гетерогенными мультимерными Hp 2-2 и Hp 2-1 (α _{> 2} β _{> 2} ) фенотипов. ³⁶ Каждая β-цепь Hp может связывать один димер Hb αβ, обеспечивая 2 сайта связывания в Hp 1-1 и множественные сайты связывания в Hp 2-2. Способность связывать белок и основные биохимические функции Hp 1-1 и Hp 2-2 равны, поскольку они связаны с клиренсом Hb и детоксикацией (D.J.S. и P.W.B., представленная рукопись). Молекулярная основа очевидной ассоциации генотипа Hp 2-2 с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний в некоторых популяциях пациентов с высоким риском остается невыясненной. ^36,37

Продукт Hp, полученный из плазмы человека, был разработан Японским Зеленым Крестом (ныне Benesis Corporation) и был одобрен в 1985 году для лечения гемолиза, вызванного экстракорпоральным кровообращением, ожоговых травм и травм при массивных переливаниях крови. ().Последующие результаты нескольких небольших исследований показали, что добавление Hp может предотвратить повреждение почечных канальцев во время операции на открытом сердце с искусственным кровообращением, синдрома HELLP (гемолиз повышенных ферментов печени с низким уровнем тромбоцитов) и после гемолиза, осложняющего эндоскопическую инъекционную склеротерапию варикозно расширенных вен пищевода этаноламином. олеат (). Отчеты о случаях и исследования ограниченного числа пациентов дополнительно подтверждают успешное использование Hp у пациентов с гемолитической анемией (т. Е. Талассемией и дефицитом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы), тяжелой ожоговой травмой, у пациентов с гемолизом в результате случайной АВО-несовместимости. Переливание эритроцитов, а также в качестве профилактики или лечения гемолиза после трансплантации костного мозга, несоответствующего АВО.Основными клиническими критериями введения и дозирования Hp в этих исследованиях были появление и устранение гемоглобинурии с целью ограничения почечного повреждения. Сообщенные дозы Hp, которые вводили для лечения острых гемолитических состояний, составляли примерно от 2 г до> 10 г на пациента, при схемах дозирования повторяющихся болюсов 2 г (дети) или 4 г (взрослые). Стоимость терапевтического препарата Hp в Японии в настоящее время составляет 540 долларов США за 2 г болюса. Насколько нам известно, до сих пор не сообщалось об использовании Hp при хронических гемолитических состояниях, при которых могло бы потребоваться повторное дозирование в течение более длительного периода лечения для эффективного подавления уровней свободного гемоглобина в плазме.

Таблица 1

Цитируемое в литературе клиническое использование гаптоглобина в Японии

шунтирование артерии у пациента с β-талассемией и тяжелым гемолизом 902 73 Гемолитическая трансфузионная реакция87 903 71> 20 г Один пациент с дефицитом фосфата История болезни (мальчик 24 мес.)

Клиническое состояние	Субъекты / контрольная группа	Доза гаптоглобина	Первичный результат (намерение лечения)	Ссылка	Кардио	шунтирование	16/21	6 г	Профилактика острой почечной недостаточности	Hashimoto et al 87
14/0	4 г	Tanaka et al 88
Отчет об одном случае		Horai et al 89
Трансплантация стволовых клеток периферической крови	Отчет об одном случае	3 г	острая почечная недостаточность	Tsuda et al 90
Отчет об отдельном случае	6 г	Профилактика острой почечной недостаточности	Homann et al 91
Массовое переливание крови	16/34	6 г	Неопределенная польза и др. 92
Экстракорпоральное кровообращение	10/10	6 г	Профилактика острой почечной недостаточности	Канамори и др. 93
Синдром HELLP	17/17	Профилактика острой почечной недостаточности	Yamamoto et al 94
ABO-несовместимая трансплантация BM	Два отчета о случаях болезни	11 г	Профилактика острой почечной недостаточности	Ito
Термическое повреждение	Отчет об отдельном случае (повторная терапия большими дозами)	Улучшение результата	Имаизуми и др. 96
		Профилактика гемоглобинурии и острой почечной недостаточности	Йошиока и др. 97
Дефицит глюкозы-6-фосфата	8.5 г	Профилактика гемоглобинурии	Ohga et al 98
Открытый артериальный проток у взрослых, спиральная эмболизация	Случай одного пациента	45 г	Предупреждение гемоглобинурии 99250

Hpx

Hpx представляет собой гемин-связывающий гликопротеин плазмы, который формирует вторую линию защиты от внутрисосудистого гемолиза, связанного с высвобождением гемина из Hb-Fe ³⁺ .Множественные белки связывают гемин, включая альбумин (Kd, приблизительно 10 ^-8 M) и липопротеиновые частицы LDL / HDL (Kd, от 10 ^-10 M до 10 ^-11 M). Однако Hpx (Kd <10 ^-13 M) является наиболее эффективным гемин-связывающим белком, который изолирует порфирин в окислительно инертной гексакоординированной конформации в комплексе со стехиометрией 1: 1. ^38–42 Наиболее важной функцией Hpx в плазме и тканях, вероятно, является защита чувствительных липопротеинов от окислительных модификаций и ограничение взаимодействия гемина с рецепторами клеточной поверхности, такими как TLR-4. ^24,38,43 В моделях воздействия гемина с использованием мышей с нокаутом Hpx белок-мусорщик продемонстрировал ослабление индуцированной гемином активации эндотелиальных клеток, вазоокклюзии в печени и повреждения почек. ^27,44 В той же модели данные показали, что Hpx сдвигает гемин в плазме к эндоцитозу и разложению в гепатоцитах.

Как и уровни Hp, уровни Hpx в плазме обычно истощаются в условиях внутрисосудистого гемолиза, что позволяет предположить, что добавление белка плазмы может принести некоторую пользу пациентам. ⁴⁵ Однако ни один продукт Hpx не доступен с качеством, которое позволило бы проводить более обширные исследования in vivo, помимо моделей на мышах. Следовательно, расширенные исследования лечения Hpx могут оказаться невозможными в ближайшем будущем для более крупных животных моделей соответствующих клинических состояний, таких как переливание крови или аортокоронарное шунтирование и экстракорпоральное кровообращение.

Hb и рецепторы скавенджеров гемина

Эндоцитарные рецепторы очищают биохимически инертные циркулирующие комплексы Hb: Hp и гемин: Hpx из кровотока.Эксперименты in vitro и ex vivo продемонстрировали, что макрофаги и моноциты периферической крови, соответственно, являются первичными типами клеток, которые очищают Hb и Hb: Hp комплексы посредством связывания и интернализации рецептора скавенджера CD163. ^46–49 Сильная индукция CD163 при лечении глюкокортикоидами у пациентов с аутоиммунными заболеваниями определила рецептор скавенджера Hb как потенциальную терапевтическую мишень. ⁵⁰ Удаление «эндогенного» Hb: Hp — быстрый процесс после легкого гемолиза; однако данные, полученные на животных моделях инфузии Hb: Hp или внутрисосудистого гемолиза с терапевтическим введением Hp, предполагают более медленный клиренс в зависимости от уровня накопления Hb: Hp и оцениваемых видов.Мы наблюдали длительный период полувыведения из кровообращения, составляющий примерно 12 часов, для комплексов Hb: Hp человека и собак у гончих собак с начальной концентрацией в плазме примерно 150 мкМ (гем). Период полувыведения человеческого комплекса Hb: Hp составлял приблизительно 16 часов при той же концентрации в плазме у морских свинок (D.J.S. и P.W.B., неопубликованные данные). Недавняя работа показывает, что специфичность связывания CD163 для Hb и комплекса Hb: Hp, соответственно, имеет значительную межвидовую изменчивость, поэтому порог насыщения механизмов клиренса у людей и некоторых лабораторных животных может значительно различаться. ⁵¹ Таким образом, для ранних испытаний на людях будет иметь решающее значение определить фармакокинетику комплекса Hb: Hp при различных внутрисосудистых концентрациях, которые соответствуют условиям однократного или многократного введения Hp во время острого, прерывистого и хронического гемолиза. Концепция клиренса, аналогичная концепции комплекса Hb: Hp, была предложена для клиренса комплекса гемин-Hpx, который связывается и интернализуется белком, связанным с рецептором ЛПНП (LRP) / CD91 на гепатоцитах, где гемин расщепляется HO. -1. ^52,53

Истощение комплексов Hp и Hpx через их родственные рецепторы во время острого и хронического внутрисосудистого гемолиза способствует патофизиологическим последствиям, изложенным в, которые, как мы предполагаем, могут быть прерваны добавками.

Роль Hb, гема и их белков-поглотителей в конкретных заболеваниях человека

Серповидно-клеточная анемия и другие гематологические заболевания.

Гемолиз и вазоокклюзия — отличительные признаки серповидно-клеточной анемии.На внутрисосудистый гемолиз приходится одна треть разрушения эритроцитов, что приводит к увеличению свободного гемоглобина и гемина в плазме. В 1960-х годах было признано, что уровни свободного гемоглобина в плазме могут достигать 25 мкм во время серповидно-клеточного кризиса, а базальные уровни гемоглобина в плазме составляют 5-10 мкм у пациентов с серповидно-клеточным синдромом. Было обнаружено, что уровни Hp и Hpx истощены. ⁴⁵ Низкий уровень Hp и повышенный уровень свободного гемоглобина в плазме были связаны с повышенным уровнем карбонила белка и нитротирозина при серповидно-клеточной анемии. ⁵⁴ Было обнаружено, что клинически неосложненные приступы боли связаны с повышением уровня гемоглобина в плазме, ^55,56 и низкие уровни Hp коррелировали с легочной гипертензией при серповидно-клеточной анемии. ⁵⁷ Хотя зарегистрированные уровни гемоглобина в плазме у пациентов с серповидноклеточными клетками намного ниже, чем уровни гемоглобина в плазме, которые были исследованы в гемодинамических исследованиях введения HBOC и некоторых моделях тяжелого гемолиза на животных, эти данные предполагают, что свободный гемоглобин может быть сильным патофизиологическим фактором. компонент сосудистых осложнений серповидноклеточной анемии.

Патофизиологические гипотезы сосредоточены на причинной связи между Hb-опосредованным потреблением NO, сосудистыми осложнениями и повышенным давлением в легочной артерии.В этих важных исследованиях повышенная регургитация струи трикуспидального клапана (TRV)> 2,5 м / с была определена как суррогатный маркер легочной гипертензии у пациентов с серповидно-клеточной анемией. Повышенный TRV был обнаружен у 30% пациентов с серповидно-клеточной анемией и хорошо коррелировал с маркерами гемолиза. ⁵⁸ Как правило, уровни гемоглобина в плазме у пациентов с серповидноклеточными клетками на несколько порядков ниже, чем уровни, которые изучались в классических экспериментальных моделях опосредованного гемоглобином или HBOC-опосредованным истощением и вазоконстрикции NO.Однако концентрации свободного гемоглобина 6 мкМ нарушали сосудорасширяющую реакцию на инфузию нитропруссида, что позволяет предположить, что низкие концентрации свободного гемоглобина в плазме у пациентов с серповидноклеточными клетками все еще могут критически ограничивать биодоступность NO и способствовать сужению сосудов, активации тромбоцитов и коагулопатии. ^59–61 В совокупности было выдвинуто предположение, что эти эффекты являются причиной легочной гипертензии и других сосудистых осложнений. Совсем недавно в двух независимых исследованиях из Франции ⁶² и Бразилии ⁶³ использовалась катетеризация правых отделов сердца (золотой стандарт диагностики легочной гипертензии) в дополнение к эхокардиографии для оценки пациентов с серповидно-клеточной анемией.Эти французские и бразильские исследования подтвердили, что у значительной части пациентов с серпом увеличилось TRV, но только у 6% и 10% пациентов соответственно была легочная гипертензия, подтвержденная катетеризацией правых отделов сердца. Еще меньше пациентов (2,75% и 3,75%) имели прекапиллярный паттерн легочной гипертензии, который можно было бы ожидать как типичный гемодинамический паттерн, если бы истощение NO и вазоконстрикция в малом круге кровообращения были первичным патофизиологическим механизмом. В обоих исследованиях уровни лактатдегидрогеназы были значительно выше у пациентов с подтвержденной легочной гипертензией.Таким образом, был сделан вывод, что легочная гипертензия у пациентов с серповидноклеточной анемией вызвана сложной многофакторной патофизиологией, которая может включать истощение NO, вазоконстрикцию, тромбоэмболическую окклюзию сосудов, поражение левого желудочка, хроническое ремоделирование сосудов и вторичные гемодинамические эффекты, вызванные гипердинамическим кровообращением. у многих пациентов с более тяжелой или хронической анемией. ^64,65 Количественный вклад этих индивидуальных факторов и особая роль свободного гемоглобина и гемина в патофизиологии сосудистых осложнений при серповидно-клеточной анемии остается важной областью для дальнейшей механистической оценки в клинических условиях.

Мышиные модели серповидно-клеточной анемии продолжают поддерживать критическую роль гемолиза и свободного Hb и гемина, соответственно, в вазоокклюзионных осложнениях. ⁶⁶ Серповидные мыши имеют внутрисосудистый гемолиз, о чем свидетельствует повышенный уровень Hb в плазме, снижение Hp и Hpx, а также повышение ретикулоцитов и билирубина в плазме. В исследованиях с использованием модели сосудистого стаза индукция или сверхэкспрессия HO-1 подавляла сосудистый застой, вызванный гипоксией. ^67–69 Более того, инфузия гемоглобина или гема серповидным мышам вызвала застой сосудов, который мог быть подавлен добавлением Hp или Hpx. ⁷⁰ В прооксидантной среде серповидноклеточной анемии Hb-Fe ²⁺ может реагировать с NO или другими окислителями с образованием Hb-Fe ³⁺ , из которого высвобождается гемин. ⁶⁹ В отсутствие Hp и Hpx гем плазмы может взаимодействовать с альбумином или другими белками плазмы и / или липопротеинами, но в конечном итоге гем распределяется по клеткам сосудистой сети, включая эндотелиальные клетки и лейкоциты. Гидрофобность гема позволяет ему проникать в клеточные мембраны и активировать сигнальные пути TLR-4, которые запускают провоспалительные и протромботические реакции, тем самым способствуя адгезии клеток крови и вазоокклюзии. ^24,70

Эпидемиологические и экспериментальные данные подтверждают концепцию, согласно которой замена Hp и / или Hpx может ослабить или предотвратить осложнения, связанные с ускоренным внутрисосудистым гемолизом при серповидно-клеточной анемии.

Существует множество других гематологических заболеваний, при которых гемолиз представляет собой первичный патологический процесс (например, талассемия, пароксизмальная ночная гемоглобинурия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) или вторичное явление (например, гемолитико-уремический синдром или тромботическая тромбоцитопеническая пурпура).Хотя вклад свободного гемоглобина и токсичности гемина в исход заболевания не исследовался в этой более широкой области гемолитических расстройств, более широкая доступность Hp и Hpx предоставит нам необходимые инструменты для систематического изучения терапевтического потенциала нейтрализации гемоглобина / гемина при эти многофакторные заболевания.

Переливание крови.

Ретроспективный анализ данных показывает, что переливание крови, хранящейся ранее (около 42 дней), приводит к увеличению заболеваемости и смертности по сравнению с кровью более новой крови. ⁷¹ Повышенная заболеваемость обычно связана с подавлением иммунитета, инфекциями, сердечно-сосудистыми осложнениями и острым / хроническим повреждением почек. Одно из наиболее важных последствий так называемого «повреждения накопления эритроцитов» связано с уменьшением деформируемости, повышенной хрупкостью in vivo и восприимчивостью эритроцитов к атаке со стороны компонентов иммунной системы. Эти изменения могут сопровождаться повышенным гемолизом старых накопленных эритроцитов.

Хотя клиническое влияние продолжительности хранения крови на клинический исход остается спорным, было разработано множество моделей для оценки эффектов гемолиза и токсичности гемоглобина. ^72–75 Морские свинки, подвергшиеся массивному переливанию (эквивалент> 10 единиц) максимально сохраненной крови морских свинок, продемонстрировали повышенные концентрации гемоглобина в плазме в течение 24-часового периода в результате посттрансфузионного гемолиза. ⁷⁶ Это было связано с повышенной гемоглобинурией, острой почечной недостаточностью, гипертонией и повреждением сосудов. Совместное слияние Hp со старой запасенной кровью привело к ослаблению неблагоприятных почечных и сосудистых эффектов, напоминая эффект переливания новой крови.Эти наблюдения подтверждаются несколькими исследованиями, предполагающими, что переливание крови мышам, крысам и овцам связано с повышенным кровяным давлением, истощением NO и повышением концентрации гемоглобина в плазме. ^74,75,77 Связанные с гемоглобином осложнения при переливании крови у людей также были связаны с несоответствием по ABO и массивным переливанием (> 10 единиц / 24 часа).

Клинически Hp использовался для лечения неблагоприятных исходов переливания крови в Японии, и основным сообщенным результатом терапевтического лечения Hp, по-видимому, является предотвращение повреждения почечных канальцев ().

Сепсис и малярия.

Гемолиз также может возникать при тяжелой бактериальной инфекции и сепсисе, а истощение Hpx связано с более тяжелым заболеванием и летальным исходом. ⁷⁸ В рамках этих сложных болезненных процессов гемин может действовать как активатор врожденного иммунитета через активацию рецептора распознавания образов (например, TLR-4), за счет синергетических эффектов с микробными продуктами или эндогенными провоспалительными лигандами (например, HMGB1) или через перекисное повреждение тканей. ^24,79,80 Исследования на мышах показали, что чистый эффект свободного гемина при полимикробном сепсисе может быть пагубным и что нейтрализация гемина введением Hpx улучшает этот эффект. ⁷⁸

Защитное действие Hpx при сепсисе может включать в себя контроль чрезмерной перекисной активности гемина, ингибирование взаимодействий рецепторов врожденного иммунитета и перенаправление свободного гемина от чувствительных тканей к его удалению в печени. Ограничение доступа гемина к железу гемоглобином и белками-поглотителями гемина может быть еще одним защитным механизмом против тяжелых инфекций, вызываемых некоторыми бактериальными штаммами. ^81,82 Активность Hpx in vivo может также включать активности Hpx, которые не зависят от его первичной функции поглотителя гемина. Результат такой активности был отмечен как противовоспалительный в некоторых случаях (например, Hpx ослабляет секрецию воспалительных цитокинов стимулированными липополисахаридом макрофагами ⁸³ ), тогда как нарушение бактериального клиренса было обнаружено как следствие подавления миграции нейтрофилов в других исследованиях на мышах. . ⁸⁴ На данный момент неизвестно, являются ли такие не связанные с гемином эффекты Hpx врожденной активностью самого белка или же они являются побочными эффектами, вызванными примесями или продуктами разложения в некоторых препаратах Hpx, полученных из плазмы. ⁸⁵

На мышиных моделях малярии окислительное повреждение, вызванное Hb / гемином, и истощение NO были связаны с развитием церебральной малярии. ⁸⁶ Однако, хотя мы подозреваем, что эта патофизиология может быть ослаблена лечением Hp и / или Hpx, эффективность белков-поглотителей еще не была протестирована для этого конкретного состояния.

Заключение: существует ли неудовлетворенная потребность в терапевтических средствах на основе белка-поглотителя?

Множественные гематологические и негематологические болезненные состояния связаны с лизисом эритроцитов, а побочные эффекты свободного гемоглобина и гемина потенциально осложняют клинический исход заболевания.В настоящее время не существует действенной терапии, предназначенной для ослабления побочных эффектов свободного гемоглобина и гемина. Заместительное или супрафизиологическое дозирование Hp и / или Hpx для соответствия острому или продолжающемуся гемолизу может иметь терапевтическую пользу за счет ослабления многих патофизиологий, которые мы обсуждаем в этой перспективе, и нескольких клинических ситуаций, в которых гемоглобин способствует острому (например, острое повреждение почек) или хронические (например, ремоделирование сосудов) последствия. Очищенный плазмой Hp продается в Японии с 1985 г. с основными показаниями к применению в сочетании с экстракорпоральным кровообращением, массивным переливанием крови и термической травмой.Основным терапевтическим эффектом при этих болезненных состояниях является защита почек от токсичности, вызванной гемоглобином. ⁸⁷ На данный момент не существует терапевтического опыта лечения Hpx в клинических условиях. Однако несколько фармацевтических компаний, базирующихся в США и Европе, приступили к разработке проектов по фракционированию Hp и Hpx из плазмы крови человека для использования в качестве терапевтических средств при гемолитических заболеваниях. В 2011 году Hp, полученный из плазмы человека, получил статус орфанного лекарства для лечения серповидно-клеточной анемии в Европейском союзе.Однако на сегодняшний день доклинические доказательства концепции Hp и Hpx изучались в общем контексте патофизиологии, связанной с Hb и гемолизом, а не с целью лечения конкретного заболевания. В большинстве стран лекарства / биопрепараты одобряются на основании улучшения исходов заболевания и приемлемой безопасности по показаниям. Следовательно, рациональный выбор потенциальных показаний, графиков доз и дизайна клинических испытаний для достижения измеримых результатов и приемлемых профилей безопасности будет иметь решающее значение для успешного продвижения представленных здесь концепций в направлении улучшения ухода за пациентами.Эти и другие вопросы создадут захватывающие фундаментальные научные, клинические и нормативные проблемы в процессе разработки терапевтических средств, поглощающих гемоглобин / гемин.

Авторство

Вклад: D.J.S., P.W.B., A.I.A., J.D.B. и G.M.V. участвовал в написании и редактировании этой статьи.

Раскрытие информации о конфликте интересов: J.D.B. и G.M.V. получают финансирование исследований от Sangart Inc. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Переписка: Доминик Я.Schaer, MD, Отделение внутренней медицины, Университетская больница, CH-8091 Цюрих, Швейцария; электронная почта: [email protected]; или Грегори М. Верчеллотти, MD, FACP, Отделение гематологии, онкологии и трансплантологии, Медицинская школа Университета Миннесоты, D495 Mayo Memorial Bldg, MMC 480, 420 Delaware St SE, Minneapolis, MN 55455; электронная почта: ude.nmu@100ecrev.

изучают гемоглобин и поглотители гемина как новый класс терапевтических белков.

Реферат

Гемолиз возникает при многих гематологических и негематологических заболеваниях.Было обнаружено, что внеклеточный гемоглобин (Hb) вызывает определенные патофизиологии, которые связаны с неблагоприятными клиническими исходами у пациентов с гемолизом, такими как острые и хронические сосудистые заболевания, воспаление, тромбоз и почечная недостаточность. Среди молекулярных характеристик внеклеточного гемоглобина наиболее критическими являются перемещение молекулы во внесосудистое пространство, окислительные реакции и реакции оксида азота, высвобождение гемина и молекулярные сигнальные эффекты гемина. Ограниченный клинический опыт с продуктом гаптоглобина (Hp), полученным из плазмы, в Японии и более недавние доклинические исследования на животных показывают, что природный Hb и белки-поглотители гемина Hp и гемопексин обладают сильным потенциалом для нейтрализации неблагоприятных физиологических эффектов Hb и гемина.Сюда входят такие разнообразные состояния, как переливание эритроцитов, серповидноклеточная анемия, сепсис и экстракорпоральное кровообращение. В этой перспективе рассматриваются основные механизмы токсичности гемоглобина и гемина при различных болезненных состояниях, обновляется информация о том, как природные поглотители эффективно контролируют эти токсические составляющие, и исследуются критические вопросы развития Hp и гемопексина, полученных из плазмы человека, в качестве терапевтических средств для пациентов с чрезмерным внутрисосудистым гемолизом. .

Введение

Когда гемоглобин (Hb) вырывается из эритроцитов из-за гемолиза, обнаженный гемоглобин, лишенный своих антиоксидантов, которые обычно присутствуют в эритроцитах, может нанести окислительный ущерб сосудистой сети и обнаженным тканям. ¹ Чтобы нейтрализовать гемоглобин и его реактивную группу протопорфирина-IX железа (гемина), специализированные белки-поглотители плазмы улавливают токсичные части и доставляют их в компартменты, где гемоксигеназы могут расщеплять гемин на менее токсичные метаболиты. Другие молекулы и восстанавливающие вещества вносят свой вклад в эту защитную физиологию. Однако, когда эти системы очистки и детоксикации нарушены внутрисосудистым гемолизом, например, при серповидно-клеточной анемии, переливании крови, малярии или сепсисе, гемоглобин и гемин вызывают дисфункцию сосудов и органов, что приводит к неблагоприятным клиническим эффектам ().В этой перспективе рассматриваются механизмы токсичности гемоглобина при различных болезненных состояниях, обновляется информация о том, как гаптоглобин (Hp) и гемопексин (Hpx) эффективно обрабатывают свободный гемоглобин и гемин, а также исследуется, почему пришло время рассматривать эти белки в качестве терапевтических средств у пациентов с чрезмерным внутрисосудистым гемолизом. .

Схематическое резюме компартментов клиренса Hb и основных острых и хронических патологий, которые могут быть связаны с внутрисосудистым гемолизом. Доступность Hb и белков-поглотителей гемина Hp и Hpx сдвигает физиологический баланс от повреждения тканей к защите.

Внеклеточный гемоглобин и гемин являются многокомпонентными триггерами болезненных процессов

Неблагоприятные клинические эффекты, связанные с избыточным свободным гемоглобином, могут быть отнесены к нескольким специфическим структурным и биохимическим свойствам молекулы гемоглобина и вызваны следующими 4 взаимно взаимодействующими механизмами: (1) внесосудистая транслокация гемоглобина, которая является основным требованием, чтобы гемоглобин и гемин могли проявить свою неблагоприятную реактивность в тканях; (2) оксид азота и окислительные реакции; (3) высвобождение свободного гемина; и (4) молекулярно-сигнальные эффекты гемина.Эти механизмы описаны в следующих разделах и кратко описаны в.

Краткое схематическое описание основных механизмов токсичности гемоглобина и защиты белков-скавенджеров плазмы Hp и Hpx.

Механизм 1: внесосудистая транслокация Hb

После гемолиза гемоглобин находится в динамическом равновесии тетрамера и гетеродимеров αβ-субъединицы с преобладающим димерным состоянием при низких концентрациях гемоглобина в плазме. αβ-Димеры имеют относительно небольшой размер молекулы (32 кДа), что обеспечивает транслокацию белков и доступ к уязвимым анатомическим участкам (например, почкам и стенке сосудов).Воздействие Hb на ткани наиболее очевидно в случаях явной гемоглобинурии после массивного внутрисосудистого гемолиза, но Hb также способен перемещаться через эндотелиальные барьеры, проникая в субэндотелиальное и периваскулярное пространства и лимфатическую жидкость. ^2,3

Механизм 2: NO и окислительные реакции

Второй механизм токсичности гемоглобина — прооксидантная реактивность гемоглобина в плазме или тканях после экстравазации. Наиболее широко изучены реакции Hb с оксидом азота (NO) и физиологическими окислителями (например, перекисью водорода и перекисями липидов).Потребление NO и последующее окисление гемоглобина происходит через 2 реакции: (1) диоксигенация оксигалогеном оксигенатом NO, что приводит к образованию нитрата (NO ₃ ^—) и Hb железа (Hb-Fe ³⁺ ) и (2) нитрозилирование железом дезокси-Hb, которое происходит путем прямого связывания NO железом с нелегированным железом Hb (Hb-Fe ²⁺ ).

Современное понимание биохимии и патофизиологии этих реакций во многом основано на изучении переносчиков кислорода на основе гемоглобина (HBOC) и их хорошо задокументированных побочных эффектов на гемодинамику. ⁴ Целевой мутагенез гемоглобина, направленный на ограничение взаимодействий с NO или химических модификаций для ограничения доступа к участкам биодоступности NO в сосудистой стенке (например, путем химического сшивания гемоглобина в крупные полимеры или конъюгаты с декорированной поверхностью), ослабляет вазоконстрикцию и гипертония. ^5,6 Таким образом, истощение NO внеклеточным Hb в настоящее время является широко принятой гипотезой, объясняющей острую гипертензивную реакцию, которая возникает во время массивного гемолиза (достижение умеренного или высокого уровня свободного Hb в плазме) или во время инфузии HBOC. ^6,7 В дополнение к истощению сосудов, другим результатом реакций Hb-NO может быть образование Hb-Fe ³⁺ в паренхиме ткани. Накопление Hb-Fe ³⁺ в тканях может способствовать высвобождению гемина и / или передаче гемина другим белкам / липидам со вторичной токсичностью, обусловленной свободным гемином.

Биохимия реакции гемоглобина с пероксидами изучалась в течение последних 40 лет, ⁸ , но значение этих реакций для патофизиологии, вызываемой гемоглобином и гемином, все еще недостаточно определено.Предположение, что окислительные побочные реакции гемоглобина могут быть важной детерминантой токсичности гемоглобина, было основано на наблюдениях, что пероксиды образуются и высвобождаются во внеклеточное пространство в относительно больших количествах во время воспаления и ишемии-реперфузии. В условиях in vitro реакция Hb с пероксидом приводит к образованию Hb-Fe ³⁺ , форм железа с более высоким окислением, таких как феррил Hb (Hb-Fe ⁴⁺ ), и связанных радикалов (механизм II). Было высказано предположение, что свободные радикалы в цепи глобина доступны для локализованного окисления аминокислот (например, внутри Hb) или переноса радикалов на молекулы, не являющиеся Hb (например, липопротеины). ^9,10 Предполагаемый конечный результат этих реакций — саморазрушение гемоглобина, потеря гемина и сшивание / осаждение цепи глобина, что в конечном итоге может привести к повреждению ткани. ¹¹ Следует отметить, что предполагаемое влияние этих реакций на болезненные состояния основано на ограниченных и косвенных экспериментальных данных, поэтому остается неясным, образуются ли значительные количества Hb-Fe ⁴⁺ и радикалов во время гемолиза in vivo и если они способствуют развитию болезни.Единственными окисленными видами гемоглобина, которые могут быть последовательно определены количественно in vivo, являются Hb-Fe ³⁺ и гемихром, структурно искаженная форма Hb-Fe ³⁺ . Несоответствие между биохимическими наблюдениями in vitro и результатами in vivo может быть связано с изменением баланса между реакциями окисления и восстановления в условиях in vivo. ¹² Доступность больших количеств низкомолекулярных и ферментативных восстановителей может снизить стабильность разновидностей гемоглобина с более высокой степенью окисления и радикалов, производных гемоглобина, до неопределяемых уровней.Внутримолекулярные поперечные связи Hb, ковалентные аддукты порфирин-глобин и окисление аминокислот глобиновой цепи были определены как суррогатные маркеры для образования Hb-Fe ⁴⁺ . Такие модификации были обнаружены в гемоглобине, выделенном из спинномозговой жидкости после субарахноидального кровоизлияния и из мочи, что позволяет предположить, что перекисные реакции могут способствовать токсичности гемоглобина in vivo. ^13,14

Механизм 3: высвобождение и перенос гемина

Третий механизм токсичности гемоглобина связан с высвобождением гемина из Hb-Fe ³⁺ , который является основным продуктом окислительных реакций, описанных в предыдущем разделе. .Высвобождение гемина позволяет переносить реактивный порфирин на клеточные мембраны или растворимые белки и липиды плазмы и обеспечивает свободный гемин в качестве лиганда для молекулярных сигнальных взаимодействий. Как гидрофобная молекула, маловероятно, что значительные количества свободного мономерного гемина могут присутствовать в плазме. Следовательно, перенесенный гемин в форме геминового белка с низким сродством (например, гемин-альбумин) или гемин-липидных комплексов является наиболее вероятными физиологическими конечными продуктами высвобождения гемина. В зависимости от белковой или липидной среды свободный протопорфирин железа может действовать как промежуточный продукт и превращать реципиентную молекулу в реактивный конечный продукт.Наиболее идентифицируемым токсичным конечным продуктом высвобождения гемина является окисленный липопротеин низкой плотности (oxLDL). ¹⁵ Окисление ЛПНП и связанная с ним воспалительная и цитотоксическая активность представляет собой важный пример способности Hb вызывать повреждение сосудов. ^16,17

Механизм 4: молекулярные сигнальные эффекты гемина

Гемин может избирательно связываться с несколькими рецепторами, факторами транскрипции и ферментами и тем самым изменять состояние активации клеток, транскрипцию генов и метаболизм.Наиболее четко определенным взаимодействием является связывание гемина с репрессором транскрипции Bach-1, который регулирует транскрипцию гемоксигеназы 1 (HO-1) и других антиоксидантных ферментов, необходимых для адаптивного ответа на повышенные уровни внутриклеточного гемина. ¹⁸ Гемин также является лигандом рецептора ядерного гормона REV-ERB, который регулирует циркадный ритм, метаболизм глюкозы и адипогенез. ¹⁹ Ингибирование протеасомы гемином и некоторыми сконструированными гидрофильными порфиринами до сих пор документировано только в биохимических анализах. ^20,21 Однако, если это подтверждено в биологических системах, эта активность может помочь объяснить аспекты токсичности гемина. Кроме того, в некоторых моделях активация TLR и нижестоящая воспалительная передача сигналов, особенно пути TLR-4, может быть запущена свободным гемином. ^22–24

Таким образом, окончательная патофизиология внеклеточного гемоглобина зависит от времени, количества и тканевой локализации воздействия гемоглобина / гемина в конкретном клиническом состоянии и может быть результатом кумулятивных эффектов, в значительной степени описываемых 4 механизмами, обсуждаемыми в разделы выше.Например, системная и, в некоторой степени, легочная гипертензия является наиболее очевидным и легко измеряемым эффектом свободного Hb после внутрисосудистого гемолиза. Механизмы, вызывающие резкое повышение артериального давления, — это транслокация гемоглобина в субэндотелиальные пространства, локальное истощение NO в стенке сосуда и последующее сужение сосудов. Сосудистые осложнения хронического и / или периодического воздействия гемоглобина, вероятно, будут более сложными, включая воспаление, локализованные окислительные реакции, тромбоз, ремоделирование сосудов и почечную недостаточность. ^25–28 Как указано в следующих разделах, все 4 механизма токсичности гемоглобина и гемина специфически ослабляются природными белками-мусорщиками Hp и Hpx, что объясняет исключительную защитную функцию этих молекул.

Биохимия и физиология Hb и белков-поглотителей гемина

Во время гемолиза от легкого до умеренного, сеть белков-поглотителей, рецепторов и ферментов выполняет клиренс и детоксикацию внеклеточного гемоглобина и гемина. Первичный путь клиренса включает транспорт в паренхиму печени или макрофаги, расщепление порфирина гемоксигеназами на билирубин, монооксид углерода и железо и восстановление железа для эритропоэза de novo.Белки-скавенджеры снижают токсичность гемоглобина и гемина, так что эти потенциально токсичные молекулы захватываются и транспортируются в инертной форме. Белки плазмы с наиболее многообещающим терапевтическим потенциалом — это Hp и Hpx. Эти белки более подробно обсуждаются в следующих разделах.

Hp

Hp коренным образом меняет биохимический и физиологический профиль свободного гемоглобина. ²⁹ При связывании с комплексом Hb: Hp большого размера (> 150 кДа), гемоглобин остается секвестрированным во внутрисосудистом пространстве, и его транслокация в почки и через эндотелиальный слой, по-видимому, предотвращается.Этот простой механизм удерживает потенциально неблагоприятные биохимические реакции свободного гемоглобина с NO и / или пероксидами вдали от наиболее уязвимых анатомических участков, таких как стенка сосудов. Внутрисосудистая секвестрация, по-видимому, является наиболее эффективным способом предотвращения Hb-индуцированной гипертензии и повреждения почек (). Кроме того, гемоглобин остается в восстанавливающей (т.е. богатой антиоксидантами) среде плазмы крови до тех пор, пока не завершится клиренс моноцитов и макрофагов.

Hp Секвестрация Hb. Морским свинкам вводили свободный от стромы Hb (пиковая концентрация гемоглобина в плазме, 150 мкМ гем), и через 10 минут группе животных вводили Hp, полученный из плазмы человека, для достижения эквимолярной концентрации Hb: Hp. (A) Средняя реакция артериального давления до и после лечения Hp. (B) Несвязанный гемоглобин в плазме (красный) до и после введения Hp. Левый сдвиг на хроматограмме указывает на большой молекулярный размер комплекса Hb: Hp с приблизительно 90% связанного Hp и 10% несвязанного Hb.(C) Гемоглобинурия после инфузии Hb (гем 150 мкм) без (-Hp, слева) и с Hp (+ Hp, справа). (D) Отложение железа (коричневое окрашивание) в нормальной почечной коре (слева), инфузия Hb (в центре) и инфузия Hb плюс Hp (справа). (E) Экспрессия HO-1 в почках через 24 часа после воздействия Hb с инфузией Hp и без нее (слева). Денситометрия показана справа от вестерн-блоттинга HO-1. Все данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего.

Недавние эксперименты in vitro показывают, что Hp может также изменять окислительные реакции Hb.Hp снижает окислительно-восстановительный потенциал связанного Hb-Fe ³⁺ , стабилизирует более высокую степень окисления Hb-Fe ⁴⁺ и предотвращает перенос радикалов на молекулы, не являющиеся Hb, в присутствии окислителей. ^30,31 Недавно определенная кристаллическая структура свиного Hb: Hp комплекса обеспечила некоторую структурную основу для защиты важных аминокислот, которые являются основными мишенями окисления глобина. ³² В результате этой защиты окисление глобина с последующей деградацией белка не происходит, когда Hb секвестрируется в комплекс Hb: Hp. ³³ Структурная стабильность комплекса может предотвратить накопление провоспалительных продуктов деградации Hb, которые могут уклоняться от выведения рецепторами скавенджеров. ^14,34 Кроме того, гемин прочно находится в комплексе Hb: Hp, он не может переноситься на акцепторы гемина, такие как Hpx, липопротеины и альбумин. ³⁵ Следовательно, предотвращение переноса гемина является еще одним важным механизмом, с помощью которого Hp защищает от Hb-управляемого окисления мембранных липидов и липопротеинов плазмы, предотвращая накопление свободного гемина.

Генетическая гетерогенность состава α-субъединицы Hp у человека допускает существование структурного полиморфизма с димерным Hp 1-1 (α ₂ β ₂ ) и гетерогенными мультимерными Hp 2-2 и Hp 2-1 (α _{> 2} β _{> 2} ) фенотипов. ³⁶ Каждая β-цепь Hp может связывать один димер Hb αβ, обеспечивая 2 сайта связывания в Hp 1-1 и множественные сайты связывания в Hp 2-2. Способность связывать белок и основные биохимические функции Hp 1-1 и Hp 2-2 равны, поскольку они связаны с клиренсом Hb и детоксикацией (D.J.S. и P.W.B., представленная рукопись). Молекулярная основа очевидной ассоциации генотипа Hp 2-2 с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний в некоторых популяциях пациентов с высоким риском остается невыясненной. ^36,37

Продукт Hp, полученный из плазмы человека, был разработан Японским Зеленым Крестом (ныне Benesis Corporation) и был одобрен в 1985 году для лечения гемолиза, вызванного экстракорпоральным кровообращением, ожоговых травм и травм при массивных переливаниях крови. ().Последующие результаты нескольких небольших исследований показали, что добавление Hp может предотвратить повреждение почечных канальцев во время операции на открытом сердце с искусственным кровообращением, синдрома HELLP (гемолиз повышенных ферментов печени с низким уровнем тромбоцитов) и после гемолиза, осложняющего эндоскопическую инъекционную склеротерапию варикозно расширенных вен пищевода этаноламином. олеат (). Отчеты о случаях и исследования ограниченного числа пациентов дополнительно подтверждают успешное использование Hp у пациентов с гемолитической анемией (т. Е. Талассемией и дефицитом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы), тяжелой ожоговой травмой, у пациентов с гемолизом в результате случайной АВО-несовместимости. Переливание эритроцитов, а также в качестве профилактики или лечения гемолиза после трансплантации костного мозга, несоответствующего АВО.Основными клиническими критериями введения и дозирования Hp в этих исследованиях были появление и устранение гемоглобинурии с целью ограничения почечного повреждения. Сообщенные дозы Hp, которые вводили для лечения острых гемолитических состояний, составляли примерно от 2 г до> 10 г на пациента, при схемах дозирования повторяющихся болюсов 2 г (дети) или 4 г (взрослые). Стоимость терапевтического препарата Hp в Японии в настоящее время составляет 540 долларов США за 2 г болюса. Насколько нам известно, до сих пор не сообщалось об использовании Hp при хронических гемолитических состояниях, при которых могло бы потребоваться повторное дозирование в течение более длительного периода лечения для эффективного подавления уровней свободного гемоглобина в плазме.

Таблица 1

Цитируемое в литературе клиническое использование гаптоглобина в Японии

шунтирование артерии у пациента с β-талассемией и тяжелым гемолизом 902 73 Гемолитическая трансфузионная реакция87 903 71> 20 г Один пациент с дефицитом фосфата История болезни (мальчик 24 мес.)

Клиническое состояние	Субъекты / контрольная группа	Доза гаптоглобина	Первичный результат (намерение лечения)	Ссылка	Кардио	шунтирование	16/21	6 г	Профилактика острой почечной недостаточности	Hashimoto et al 87
14/0	4 г	Tanaka et al 88
Отчет об одном случае		Horai et al 89
Трансплантация стволовых клеток периферической крови	Отчет об одном случае	3 г	острая почечная недостаточность	Tsuda et al 90
Отчет об отдельном случае	6 г	Профилактика острой почечной недостаточности	Homann et al 91
Массовое переливание крови	16/34	6 г	Неопределенная польза и др. 92
Экстракорпоральное кровообращение	10/10	6 г	Профилактика острой почечной недостаточности	Канамори и др. 93
Синдром HELLP	17/17	Профилактика острой почечной недостаточности	Yamamoto et al 94
ABO-несовместимая трансплантация BM	Два отчета о случаях болезни	11 г	Профилактика острой почечной недостаточности	Ito
Термическое повреждение	Отчет об отдельном случае (повторная терапия большими дозами)	Улучшение результата	Имаизуми и др. 96
		Профилактика гемоглобинурии и острой почечной недостаточности	Йошиока и др. 97
Дефицит глюкозы-6-фосфата	8.5 г	Профилактика гемоглобинурии	Ohga et al 98
Открытый артериальный проток у взрослых, спиральная эмболизация	Случай одного пациента	45 г	Предупреждение гемоглобинурии 99250

Hpx

Hpx представляет собой гемин-связывающий гликопротеин плазмы, который формирует вторую линию защиты от внутрисосудистого гемолиза, связанного с высвобождением гемина из Hb-Fe ³⁺ .Множественные белки связывают гемин, включая альбумин (Kd, приблизительно 10 ^-8 M) и липопротеиновые частицы LDL / HDL (Kd, от 10 ^-10 M до 10 ^-11 M). Однако Hpx (Kd <10 ^-13 M) является наиболее эффективным гемин-связывающим белком, который изолирует порфирин в окислительно инертной гексакоординированной конформации в комплексе со стехиометрией 1: 1. ^38–42 Наиболее важной функцией Hpx в плазме и тканях, вероятно, является защита чувствительных липопротеинов от окислительных модификаций и ограничение взаимодействия гемина с рецепторами клеточной поверхности, такими как TLR-4. ^24,38,43 В моделях воздействия гемина с использованием мышей с нокаутом Hpx белок-мусорщик продемонстрировал ослабление индуцированной гемином активации эндотелиальных клеток, вазоокклюзии в печени и повреждения почек. ^27,44 В той же модели данные показали, что Hpx сдвигает гемин в плазме к эндоцитозу и разложению в гепатоцитах.

Как и уровни Hp, уровни Hpx в плазме обычно истощаются в условиях внутрисосудистого гемолиза, что позволяет предположить, что добавление белка плазмы может принести некоторую пользу пациентам. ⁴⁵ Однако ни один продукт Hpx не доступен с качеством, которое позволило бы проводить более обширные исследования in vivo, помимо моделей на мышах. Следовательно, расширенные исследования лечения Hpx могут оказаться невозможными в ближайшем будущем для более крупных животных моделей соответствующих клинических состояний, таких как переливание крови или аортокоронарное шунтирование и экстракорпоральное кровообращение.

Hb и рецепторы скавенджеров гемина

Эндоцитарные рецепторы очищают биохимически инертные циркулирующие комплексы Hb: Hp и гемин: Hpx из кровотока.Эксперименты in vitro и ex vivo продемонстрировали, что макрофаги и моноциты периферической крови, соответственно, являются первичными типами клеток, которые очищают Hb и Hb: Hp комплексы посредством связывания и интернализации рецептора скавенджера CD163. ^46–49 Сильная индукция CD163 при лечении глюкокортикоидами у пациентов с аутоиммунными заболеваниями определила рецептор скавенджера Hb как потенциальную терапевтическую мишень. ⁵⁰ Удаление «эндогенного» Hb: Hp — быстрый процесс после легкого гемолиза; однако данные, полученные на животных моделях инфузии Hb: Hp или внутрисосудистого гемолиза с терапевтическим введением Hp, предполагают более медленный клиренс в зависимости от уровня накопления Hb: Hp и оцениваемых видов.Мы наблюдали длительный период полувыведения из кровообращения, составляющий примерно 12 часов, для комплексов Hb: Hp человека и собак у гончих собак с начальной концентрацией в плазме примерно 150 мкМ (гем). Период полувыведения человеческого комплекса Hb: Hp составлял приблизительно 16 часов при той же концентрации в плазме у морских свинок (D.J.S. и P.W.B., неопубликованные данные). Недавняя работа показывает, что специфичность связывания CD163 для Hb и комплекса Hb: Hp, соответственно, имеет значительную межвидовую изменчивость, поэтому порог насыщения механизмов клиренса у людей и некоторых лабораторных животных может значительно различаться. ⁵¹ Таким образом, для ранних испытаний на людях будет иметь решающее значение определить фармакокинетику комплекса Hb: Hp при различных внутрисосудистых концентрациях, которые соответствуют условиям однократного или многократного введения Hp во время острого, прерывистого и хронического гемолиза. Концепция клиренса, аналогичная концепции комплекса Hb: Hp, была предложена для клиренса комплекса гемин-Hpx, который связывается и интернализуется белком, связанным с рецептором ЛПНП (LRP) / CD91 на гепатоцитах, где гемин расщепляется HO. -1. ^52,53

Истощение комплексов Hp и Hpx через их родственные рецепторы во время острого и хронического внутрисосудистого гемолиза способствует патофизиологическим последствиям, изложенным в, которые, как мы предполагаем, могут быть прерваны добавками.

Роль Hb, гема и их белков-поглотителей в конкретных заболеваниях человека

Серповидно-клеточная анемия и другие гематологические заболевания.

Гемолиз и вазоокклюзия — отличительные признаки серповидно-клеточной анемии.На внутрисосудистый гемолиз приходится одна треть разрушения эритроцитов, что приводит к увеличению свободного гемоглобина и гемина в плазме. В 1960-х годах было признано, что уровни свободного гемоглобина в плазме могут достигать 25 мкм во время серповидно-клеточного кризиса, а базальные уровни гемоглобина в плазме составляют 5-10 мкм у пациентов с серповидно-клеточным синдромом. Было обнаружено, что уровни Hp и Hpx истощены. ⁴⁵ Низкий уровень Hp и повышенный уровень свободного гемоглобина в плазме были связаны с повышенным уровнем карбонила белка и нитротирозина при серповидно-клеточной анемии. ⁵⁴ Было обнаружено, что клинически неосложненные приступы боли связаны с повышением уровня гемоглобина в плазме, ^55,56 и низкие уровни Hp коррелировали с легочной гипертензией при серповидно-клеточной анемии. ⁵⁷ Хотя зарегистрированные уровни гемоглобина в плазме у пациентов с серповидноклеточными клетками намного ниже, чем уровни гемоглобина в плазме, которые были исследованы в гемодинамических исследованиях введения HBOC и некоторых моделях тяжелого гемолиза на животных, эти данные предполагают, что свободный гемоглобин может быть сильным патофизиологическим фактором. компонент сосудистых осложнений серповидноклеточной анемии.

Патофизиологические гипотезы сосредоточены на причинной связи между Hb-опосредованным потреблением NO, сосудистыми осложнениями и повышенным давлением в легочной артерии.В этих важных исследованиях повышенная регургитация струи трикуспидального клапана (TRV)> 2,5 м / с была определена как суррогатный маркер легочной гипертензии у пациентов с серповидно-клеточной анемией. Повышенный TRV был обнаружен у 30% пациентов с серповидно-клеточной анемией и хорошо коррелировал с маркерами гемолиза. ⁵⁸ Как правило, уровни гемоглобина в плазме у пациентов с серповидноклеточными клетками на несколько порядков ниже, чем уровни, которые изучались в классических экспериментальных моделях опосредованного гемоглобином или HBOC-опосредованным истощением и вазоконстрикции NO.Однако концентрации свободного гемоглобина 6 мкМ нарушали сосудорасширяющую реакцию на инфузию нитропруссида, что позволяет предположить, что низкие концентрации свободного гемоглобина в плазме у пациентов с серповидноклеточными клетками все еще могут критически ограничивать биодоступность NO и способствовать сужению сосудов, активации тромбоцитов и коагулопатии. ^59–61 В совокупности было выдвинуто предположение, что эти эффекты являются причиной легочной гипертензии и других сосудистых осложнений. Совсем недавно в двух независимых исследованиях из Франции ⁶² и Бразилии ⁶³ использовалась катетеризация правых отделов сердца (золотой стандарт диагностики легочной гипертензии) в дополнение к эхокардиографии для оценки пациентов с серповидно-клеточной анемией.Эти французские и бразильские исследования подтвердили, что у значительной части пациентов с серпом увеличилось TRV, но только у 6% и 10% пациентов соответственно была легочная гипертензия, подтвержденная катетеризацией правых отделов сердца. Еще меньше пациентов (2,75% и 3,75%) имели прекапиллярный паттерн легочной гипертензии, который можно было бы ожидать как типичный гемодинамический паттерн, если бы истощение NO и вазоконстрикция в малом круге кровообращения были первичным патофизиологическим механизмом. В обоих исследованиях уровни лактатдегидрогеназы были значительно выше у пациентов с подтвержденной легочной гипертензией.Таким образом, был сделан вывод, что легочная гипертензия у пациентов с серповидноклеточной анемией вызвана сложной многофакторной патофизиологией, которая может включать истощение NO, вазоконстрикцию, тромбоэмболическую окклюзию сосудов, поражение левого желудочка, хроническое ремоделирование сосудов и вторичные гемодинамические эффекты, вызванные гипердинамическим кровообращением. у многих пациентов с более тяжелой или хронической анемией. ^64,65 Количественный вклад этих индивидуальных факторов и особая роль свободного гемоглобина и гемина в патофизиологии сосудистых осложнений при серповидно-клеточной анемии остается важной областью для дальнейшей механистической оценки в клинических условиях.

Мышиные модели серповидно-клеточной анемии продолжают поддерживать критическую роль гемолиза и свободного Hb и гемина, соответственно, в вазоокклюзионных осложнениях. ⁶⁶ Серповидные мыши имеют внутрисосудистый гемолиз, о чем свидетельствует повышенный уровень Hb в плазме, снижение Hp и Hpx, а также повышение ретикулоцитов и билирубина в плазме. В исследованиях с использованием модели сосудистого стаза индукция или сверхэкспрессия HO-1 подавляла сосудистый застой, вызванный гипоксией. ^67–69 Более того, инфузия гемоглобина или гема серповидным мышам вызвала застой сосудов, который мог быть подавлен добавлением Hp или Hpx. ⁷⁰ В прооксидантной среде серповидноклеточной анемии Hb-Fe ²⁺ может реагировать с NO или другими окислителями с образованием Hb-Fe ³⁺ , из которого высвобождается гемин. ⁶⁹ В отсутствие Hp и Hpx гем плазмы может взаимодействовать с альбумином или другими белками плазмы и / или липопротеинами, но в конечном итоге гем распределяется по клеткам сосудистой сети, включая эндотелиальные клетки и лейкоциты. Гидрофобность гема позволяет ему проникать в клеточные мембраны и активировать сигнальные пути TLR-4, которые запускают провоспалительные и протромботические реакции, тем самым способствуя адгезии клеток крови и вазоокклюзии. ^24,70

Эпидемиологические и экспериментальные данные подтверждают концепцию, согласно которой замена Hp и / или Hpx может ослабить или предотвратить осложнения, связанные с ускоренным внутрисосудистым гемолизом при серповидно-клеточной анемии.

Существует множество других гематологических заболеваний, при которых гемолиз представляет собой первичный патологический процесс (например, талассемия, пароксизмальная ночная гемоглобинурия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) или вторичное явление (например, гемолитико-уремический синдром или тромботическая тромбоцитопеническая пурпура).Хотя вклад свободного гемоглобина и токсичности гемина в исход заболевания не исследовался в этой более широкой области гемолитических расстройств, более широкая доступность Hp и Hpx предоставит нам необходимые инструменты для систематического изучения терапевтического потенциала нейтрализации гемоглобина / гемина при эти многофакторные заболевания.

Переливание крови.

Ретроспективный анализ данных показывает, что переливание крови, хранящейся ранее (около 42 дней), приводит к увеличению заболеваемости и смертности по сравнению с кровью более новой крови. ⁷¹ Повышенная заболеваемость обычно связана с подавлением иммунитета, инфекциями, сердечно-сосудистыми осложнениями и острым / хроническим повреждением почек. Одно из наиболее важных последствий так называемого «повреждения накопления эритроцитов» связано с уменьшением деформируемости, повышенной хрупкостью in vivo и восприимчивостью эритроцитов к атаке со стороны компонентов иммунной системы. Эти изменения могут сопровождаться повышенным гемолизом старых накопленных эритроцитов.

Хотя клиническое влияние продолжительности хранения крови на клинический исход остается спорным, было разработано множество моделей для оценки эффектов гемолиза и токсичности гемоглобина. ^72–75 Морские свинки, подвергшиеся массивному переливанию (эквивалент> 10 единиц) максимально сохраненной крови морских свинок, продемонстрировали повышенные концентрации гемоглобина в плазме в течение 24-часового периода в результате посттрансфузионного гемолиза. ⁷⁶ Это было связано с повышенной гемоглобинурией, острой почечной недостаточностью, гипертонией и повреждением сосудов. Совместное слияние Hp со старой запасенной кровью привело к ослаблению неблагоприятных почечных и сосудистых эффектов, напоминая эффект переливания новой крови.Эти наблюдения подтверждаются несколькими исследованиями, предполагающими, что переливание крови мышам, крысам и овцам связано с повышенным кровяным давлением, истощением NO и повышением концентрации гемоглобина в плазме. ^74,75,77 Связанные с гемоглобином осложнения при переливании крови у людей также были связаны с несоответствием по ABO и массивным переливанием (> 10 единиц / 24 часа).

Клинически Hp использовался для лечения неблагоприятных исходов переливания крови в Японии, и основным сообщенным результатом терапевтического лечения Hp, по-видимому, является предотвращение повреждения почечных канальцев ().

Сепсис и малярия.

Гемолиз также может возникать при тяжелой бактериальной инфекции и сепсисе, а истощение Hpx связано с более тяжелым заболеванием и летальным исходом. ⁷⁸ В рамках этих сложных болезненных процессов гемин может действовать как активатор врожденного иммунитета через активацию рецептора распознавания образов (например, TLR-4), за счет синергетических эффектов с микробными продуктами или эндогенными провоспалительными лигандами (например, HMGB1) или через перекисное повреждение тканей. ^24,79,80 Исследования на мышах показали, что чистый эффект свободного гемина при полимикробном сепсисе может быть пагубным и что нейтрализация гемина введением Hpx улучшает этот эффект. ⁷⁸

Защитное действие Hpx при сепсисе может включать в себя контроль чрезмерной перекисной активности гемина, ингибирование взаимодействий рецепторов врожденного иммунитета и перенаправление свободного гемина от чувствительных тканей к его удалению в печени. Ограничение доступа гемина к железу гемоглобином и белками-поглотителями гемина может быть еще одним защитным механизмом против тяжелых инфекций, вызываемых некоторыми бактериальными штаммами. ^81,82 Активность Hpx in vivo может также включать активности Hpx, которые не зависят от его первичной функции поглотителя гемина. Результат такой активности был отмечен как противовоспалительный в некоторых случаях (например, Hpx ослабляет секрецию воспалительных цитокинов стимулированными липополисахаридом макрофагами ⁸³ ), тогда как нарушение бактериального клиренса было обнаружено как следствие подавления миграции нейтрофилов в других исследованиях на мышах. . ⁸⁴ На данный момент неизвестно, являются ли такие не связанные с гемином эффекты Hpx врожденной активностью самого белка или же они являются побочными эффектами, вызванными примесями или продуктами разложения в некоторых препаратах Hpx, полученных из плазмы. ⁸⁵

На мышиных моделях малярии окислительное повреждение, вызванное Hb / гемином, и истощение NO были связаны с развитием церебральной малярии. ⁸⁶ Однако, хотя мы подозреваем, что эта патофизиология может быть ослаблена лечением Hp и / или Hpx, эффективность белков-поглотителей еще не была протестирована для этого конкретного состояния.

Заключение: существует ли неудовлетворенная потребность в терапевтических средствах на основе белка-поглотителя?

Множественные гематологические и негематологические болезненные состояния связаны с лизисом эритроцитов, а побочные эффекты свободного гемоглобина и гемина потенциально осложняют клинический исход заболевания.В настоящее время не существует действенной терапии, предназначенной для ослабления побочных эффектов свободного гемоглобина и гемина. Заместительное или супрафизиологическое дозирование Hp и / или Hpx для соответствия острому или продолжающемуся гемолизу может иметь терапевтическую пользу за счет ослабления многих патофизиологий, которые мы обсуждаем в этой перспективе, и нескольких клинических ситуаций, в которых гемоглобин способствует острому (например, острое повреждение почек) или хронические (например, ремоделирование сосудов) последствия. Очищенный плазмой Hp продается в Японии с 1985 г. с основными показаниями к применению в сочетании с экстракорпоральным кровообращением, массивным переливанием крови и термической травмой.Основным терапевтическим эффектом при этих болезненных состояниях является защита почек от токсичности, вызванной гемоглобином. ⁸⁷ На данный момент не существует терапевтического опыта лечения Hpx в клинических условиях. Однако несколько фармацевтических компаний, базирующихся в США и Европе, приступили к разработке проектов по фракционированию Hp и Hpx из плазмы крови человека для использования в качестве терапевтических средств при гемолитических заболеваниях. В 2011 году Hp, полученный из плазмы человека, получил статус орфанного лекарства для лечения серповидно-клеточной анемии в Европейском союзе.Однако на сегодняшний день доклинические доказательства концепции Hp и Hpx изучались в общем контексте патофизиологии, связанной с Hb и гемолизом, а не с целью лечения конкретного заболевания. В большинстве стран лекарства / биопрепараты одобряются на основании улучшения исходов заболевания и приемлемой безопасности по показаниям. Следовательно, рациональный выбор потенциальных показаний, графиков доз и дизайна клинических испытаний для достижения измеримых результатов и приемлемых профилей безопасности будет иметь решающее значение для успешного продвижения представленных здесь концепций в направлении улучшения ухода за пациентами.Эти и другие вопросы создадут захватывающие фундаментальные научные, клинические и нормативные проблемы в процессе разработки терапевтических средств, поглощающих гемоглобин / гемин.

Авторство

Вклад: D.J.S., P.W.B., A.I.A., J.D.B. и G.M.V. участвовал в написании и редактировании этой статьи.

Раскрытие информации о конфликте интересов: J.D.B. и G.M.V. получают финансирование исследований от Sangart Inc. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Переписка: Доминик Я.Schaer, MD, Отделение внутренней медицины, Университетская больница, CH-8091 Цюрих, Швейцария; электронная почта: [email protected]; или Грегори М. Верчеллотти, MD, FACP, Отделение гематологии, онкологии и трансплантологии, Медицинская школа Университета Миннесоты, D495 Mayo Memorial Bldg, MMC 480, 420 Delaware St SE, Minneapolis, MN 55455; электронная почта: ude.nmu@100ecrev.

Тестирование свободного гемоглобина в плазме крови и гематокрита для механической поддержки кровообращения в месте оказания медицинской помощи

Устройство для измерения в месте оказания медицинской помощи

Для разработки портативного и автономного устройства для использования в средах MCS мы разработали устройство, которое объединяет центрифугу и основную часть управления (рис.1а и дополнительный рисунок S1). Часть центрифуги состоит из: (1) двигателя BLDC, который является основной частью системы центрифуги; (2) держатель для фиксации настроенного картриджа с каналом и для облегчения получения изображений микроканалов; (3) источник света, обеспечивающий постоянную интенсивность света внутри устройства; и (4) модуль камеры (камера Pi версии 2.1), совместимый с Raspberry Pi 3. Основная часть управления устройством состоит из (1) удобного сенсорного экрана для управления устройством и (2) Raspberry Pi3 для управления двигателем, модулем камеры и обработкой изображений ²⁴ .Габаритные размеры устройства составляют 290 мм (Д) × 115 мм (Ш) × 130 мм (В), а вес — 1,1 кг, а весь корпус изготовлен на 3D-принтере (Stratasys F123 Series, Stratasys, Израиль). (Рис. 1б, в). Канальный картридж предназначен для центрифугирования и визуализации небольшого количества крови (рис. 1d). Чтобы управлять устройством, сначала чип устанавливается на держателе, и пользователь нажимает кнопку запуска на сенсорном экране, после чего центрифугирование, получение изображения и обработка изображения с камеры последовательно выполняются заказным программным обеспечением.Программное обеспечение включает алгоритм управления двигателем для центрифугирования и алгоритм обработки изображений для анализа. Эта интегрированная система позволяет проводить анализ в короткие сроки без сложных процедур.

Рисунок 1

Устройство для проведения гематологического анализа. ( a ) Схема устройства, разделенного на две части (основная система управления и система центрифуги). ( б ) Прототип устройства. ( c ) Вид на устройство сверху.Слева показан сенсорный экран основной системы управления. Система центрифуги находится с правой стороны, а модуль камеры размещен на крышке над системой центрифуги для получения изображения канала картриджа. ( d ) Система центрифуги состоит из двигателя, держателя двигателя, ротора и держателя картриджа. Картридж с индивидуальным каналом устанавливается на держателе картриджа.

Алгоритм обработки изображений для анализа крови

На рисунке 2 показана блок-схема работы всей системы.Процесс анализа изображения начинается с сегментации интересующей области (ROI) на полученном изображении после центрифугирования. После этого процесс измерения PFHb и процесс измерения Hct выполняются в программе одновременно.

Рисунок 2

Блок-схема работы. После установки картриджа специальная программа запускает центрифугирование. В конце центрифугирования держатель картриджа останавливается магнитной связью с корпусом в указанном месте для захвата изображения.Анализ изображения выполняется одновременно с анализом цветового пространства PFHb, Hct и Hb. Анализируемый результат печатается на сенсорном экране, и весь этот процесс выполняется всего за 4 минуты.

Область интереса на начальном этапе обработки изображения сегментируется, чтобы покрыть весь канал картриджа. Значения красного, зеленого и синего (RGB) извлекаются для каждого пикселя, а канал делится на область красных кровяных телец (RBC) и плазмы на основе определенного порогового значения красного цвета.Для измерения уровня PFHb вторая область интереса (2nd ROI) размером (20 × 100) пикселей сегментируется из ранее выделенной области плазмы. Значения RGB извлекаются из этой второй области интереса, а затем преобразуются в значения CIELab. CIELab — это цветовое пространство, определенное Международной комиссией по освещению, которое позволяет точно сопоставить цветовую разницу, которую может обнаружить человеческий глаз, и цветовую разницу, выраженную в числовых значениях в цветовом пространстве ²⁵ .Компоненты цвета представлены L *, a *, b *, где L * — яркость, a * — степень красного и зеленого, а b * — степень желтого и синего. L.a.b. значения были извлечены из области черного маркера и плазмы во 2-й области интереса соответственно ^18,26 . Разница цветности (C) была рассчитана с использованием значений a * и b * 2 ^nd ROI и преобразована в уровни PFHb с помощью калибровочной кривой (уравнение 1):

$$ \ Delta \ mathrm { C} = \ sqrt {{({a} _ {m} — {a} _ {s})} ^ {2} + {({b} _ {m} — {b} _ {s})} ^ {2}} $$

(1)

где \ ({a} _ {m} \) и \ ({b} _ {m} \) — компоненты CIELab области черных маркеров, а \ ({a} _ {s} \) и \ ({b} _ {s} \) — компоненты CIELab области плазмы во 2-й области интереса.Чтобы исключить изменение цветовых компонентов, вызванное яркостью, разница между средним значением яркости (L) черного маркера, полученным из калибровочных изображений, и значением яркости черного маркера, полученным из каждого образца изображения, была добавлена ​​как смещение. значение разницы цветности.

Для измерения Hct получаются значения координат самой низкой и самой высокой строки в пикселях области RBC, а расстояние между строками (L1) представляет собой объем RBC.Расстояние между верхним рядом области плазмы и нижним рядом области эритроцитов выражается длиной (L2), которая представляет собой общий объем крови в канале картриджа. Уровень Hct рассчитывается как отношение L1 и L2, как в формуле. (2):

$$ \ mathrm {Hct} \ left (\ mathrm {\%} \ right) = \ left (\ frac {{L} _ {1}} {{L} _ {2}} \ справа) * 100 $$

(2)

где Hct — это процент от объема эритроцитов в объеме цельной крови, который обычно равен трехкратному уровню гемоглобина.Поэтому мы использовали метод Hct для расчета уровня гемоглобина (уравнение 3): ²⁷

$$ \ mathrm {Hct} \ left (\ mathrm {\%} \ right) = 3 * Hb $$

(3)

Стандартная кривая для количественного определения цвета плазмы

Метод измерения уровня PFHb основан на том явлении, что по мере того, как гемолиз становится более серьезным, краснота цвета плазмы увеличивается. Чтобы получить изменение интенсивности окраски в зависимости от степени гемолиза, мы индуцировали сильный гемолиз в образце крови свиней.Кровь, подвергшуюся стрессу, центрифугировали, чтобы собрать только плазму, и мы отрегулировали различные уровни PFHb, разбавляя собранную плазму, чтобы получить требуемый диапазон в клинических условиях. Изображения каждого разбавленного образца плазмы были получены с использованием нашего устройства, и зависимость была получена путем сравнения интенсивности цвета плазмы, извлеченной из изображения, с уровнем PFHb, измеренным в реальных лабораторных испытаниях. На рис. 3а показано изменение интенсивностей в каналах RGB в зависимости от уровней PFHb.Это показывает, что интенсивность красного канала выше, чем интенсивность зеленого и синего. Кроме того, на рис. 3b показано изменение интенсивностей в цветовом пространстве L, a, b в соответствии с уровнями PFHb. Интенсивность света аналогична интенсивности света канала RGB, но пробелы a * и b * показывают другой график изменения по сравнению с каналом RGB. Следовательно, поскольку интенсивность света может быть интерпретирована как имеющая значительное влияние на канал RGB, разница цветности, которая отражает только изменения в пространствах a * и b *, принимается как стандартная кривая, чтобы исключить изменение света.Как показано в результатах, поскольку изменение градиента цветового канала не имеет линейности и варьируется в зависимости от конкретного уровня PHFb (20 мг / дл), на основе этого были получены различные калибровочные кривые. На рис. 3c, d показаны результаты уровней PFHb в соответствии с различиями цветности, рассчитанными в разработанном устройстве, показаны две разные калибровочные кривые, основанные на значении разницы цветности — 3, и обе имеют значения R-квадрата, превышающие 0,98.

Рисунок 3

Стандартные кривые уровней PFHb . ( a ) Интенсивность цветовых каналов RGB в соответствии с уровнями PFHb. ( b ) Интенсивность L.a.b. цветовые пространства, преобразованные из RGB. ( c , d ) Стандартные кривые, измеренные с помощью предлагаемого устройства. ( c ) Калибровочная кривая в области, где разница насыщения (∆C) больше, чем — 3, и калибровочная кривая ( d ) в области, где ∆C меньше, чем — 3.

Проверка Значения PFHb, Hct и Hb

Чтобы проверить работоспособность устройства в среде MCS, мы провели оценку устройства во время экспериментов на животных ЭКМО с моделью свиньи.Образцы крови объемом около 10 мл были получены через артериальную линию, и из образца было извлечено количество 35 мкл, необходимое для разработанного устройства, а остальная часть крови была использована для получения уровня золотого стандарта CBC, PFHb и т. Д. Рис. 4a представляет собой изображение канального картриджа, полученное после центрифугирования и алгоритма анализа, запущенного с использованием этого изображения в соответствии с процедурой, показанной на рис. 2.

Рис. 4

Проверка гематологического анализа in vitro во время исследования венозных сосудов in vivo. -Артериальная экстракорпоральная мембранная оксигенация (VA-ECMO) на модели свиньи.( a ) Изображение, полученное с модуля камеры после центрифугирования. ( b — e ) Результаты сравнения нашего устройства с результатами лабораторных испытаний. ( b ) Линейный регрессионный анализ уровней PFHb с наклоном 0,958, пересечением 0,366 и R 0,999. ( c ) Анализ Бланда – Альтмана уровней PFHb, показывающий среднюю систематическую ошибку — 0,38 мг / дл и 95% доверительный интервал (от — 2,44 до 1,12) мг / дл. ( d ) Линейный регрессионный анализ уровней Hct с наклоном 0.669, точка пересечения 9,812 и R 0,739. ( e ) Анализ Бланда – Альтмана уровней Hct, показывающий среднюю систематическую ошибку — 0,38% и 95% доверительный интервал (от — 4,35 до 3,60)%.

Образцы крови были получены с интервалом в один час во время экспериментов ЭКМО, и собранные образцы крови (n = 12) сравнивались с разработанным устройством и результатами лабораторных тестов. Нашему устройству потребовалось около 5 минут, чтобы получить результаты анализа. Кроме того, мы обнаружили, что результаты, измеренные нашим устройством, очень похожи на результаты лабораторных испытаний.Регрессионный анализ и анализ Бланда – Альтмана были выполнены на PFHb и Hct, чтобы проверить надежность нашего устройства ²⁸ . Результаты измерения PFHb с помощью нашего устройства и лабораторных испытаний хорошо коррелировали (значение R 0,999, n = 12) (рис. 4b). Кроме того, анализ Bland-Altman для PFHb (рис. 4c) показал, что среднее смещение составляет -0,66, 95% доверительный интервал (от 2,44 до 1,12)%. Коэффициент корреляции для Hct составляет 0,739 (рис. 4d), и результат также показан в 95% доверительном интервале всех данных анализа Бланда – Альтмана (рис.4д). Эти результаты показывают, что более 95% разницы между результатами устройства и лабораторных испытаний находится в пределах этого критерия производительности. В таблице 1 также показаны результаты сравнения уровней гемоглобина в нашем устройстве с результатами лабораторных тестов. Кроме того, предел обнаружения (LOD) разработанного устройства был получен из кривой регрессии, и LOD составляли 0,75 мг / дл для PFHb, 2,14% для Hct.

Таблица 1 Результаты сравнения уровней гемоглобина между лабораторным тестом и предлагаемым устройством.

Прецизионность была определена количественно путем измерения каждого трехкратного повторения образца крови, и каждый образец крови соответствовал значению PFHb (14.5 мг / дл, 53 мг / дл) и Hct (30%) измеряли отдельно нашим устройством и эталонными методами. В таблице 2 показаны результаты прецизионности, наше устройство измеряло 15,13 мг / дл (для значения PFHb 14,5 мг / дл), а стандартное отклонение (SD) и коэффициент вариации (CV) составили 1,44 мг / дл и 9,49%, соответственно. . При значении PFHb 53 мг / дл прибор измерял 53,08 мг / дл, а SD и CV были 1,36 и 2,56 соответственно. Кроме того, для Hct 30% было измерено в среднем 29,13%, а SD и CV составили 1,24% и 4.26% соответственно. Таким образом, на основе этих результатов предложенное устройство показало, что можно с высокой точностью измерять различные параметры крови в среде MCS.

Таблица 2 Результаты прецизионности предлагаемого устройства POCT.

Гемоглобин, свободный от плазмы, является независимым предиктором смертности среди пациентов с экстракорпоральной мембранной оксигенацией

Аннотация

Фон

Гемолиз является обычным явлением во всех экстракорпоральных контурах, о чем свидетельствует повышенный уровень свободного гемоглобина в плазме (PFHb).Мы исследовали, является ли повышенный гемолиз во время экстракорпоральной мембранной оксигенации (ЭКМО) независимым предиктором смертности.

Методы

Мы провели ретроспективное обсервационное исследование последовательных субъектов, которые получали ЭКМО в учреждении третичной медицинской помощи с 2007 по 2013 год, чтобы изучить независимые предикторы внутрибольничной смертности. Мы исследовали переменные, связанные с демографическими характеристиками пациентов, сопутствующими заболеваниями, маркерами гемолиза, характеристиками ЭКМО, потребностями в переливании крови и осложнениями.24-часовой PFHb> 50 мг / дл использовался как маркер тяжелого гемолиза.

Результаты

154 пациента получили ЭКМО по сердечным (n = 115) или легочным (n = 39) показаниям. Средний возраст пациентов составлял 51 год, 75,3% составляли мужчины. По сравнению с не выжившими, выжившие имели более низкий уровень молочной кислоты до ЭКМО (p = 0,026), более низкий 24-часовой уровень молочной кислоты (p = 0,023), более короткую продолжительность ЭКМО (P = 0,01), меньшее количество переливаний эритроцитов на ЭКМО (p = 0,008) и более низкий уровень PFHb через 24 часа после имплантации ЭКМО (p = 0,029). 24-часовой PFHb> 50 мг / дл произошло у 3.9% против 15,5% выживших и не выживших, соответственно, p = 0,002. Анализ пропорциональных рисков Кокса выявил PFHb> 50 мг / дл через 24 часа после ЭКМО в качестве независимого предиктора смертности (OR = 3,4, 95% доверительный интервал: 1,3–8,8, p = 0,011).

Заключение

PFHb> 50 мг / дл проверено через 24 часа после имплантации ЭКМО — полезный инструмент для прогнозирования смертности. Мы предлагаем рутинную проверку PFHb через 24 часа после начала ЭКМО для раннего выявления и лечения причины гемолиза.

Образец цитирования: Омар Х.Р., Мирсаэиди М., Социас С., Спренкер С., Калдейра С., Кампореси Е.М. и др. (2015) Гемоглобин без плазмы является независимым предиктором смертности среди пациентов, получающих поддержку оксигенации через экстракорпоральную мембрану. PLoS ONE 10 (4): e0124034. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0124034

Академический редактор: Джакомо Фрати, Римский университет Ла Сапиенца, ИТАЛИЯ

Поступила: 9 декабря 2014 г .; Одобрена: 2 марта 2015 г .; Опубликован: 22 апреля 2015 г.

Авторские права: © 2015 Omar et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах бумага.

Финансирование: Мехди Мирсаейди был поддержан грантом NIH 5 T32 HL 82547-7. Компания Florida Gulf-to-Bay Anesthesiology Associates предоставила поддержку в виде заработной платы авторам Коллину Спренкеру, Энрико М.Camporesi, но не играл никакой дополнительной роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Конкретные роли этих авторов сформулированы в разделе «Авторский вклад».

Конкурирующие интересы: Авторы хотели бы заявить, что авторы Энрико М. Кампорези и Коллин Спренкер связаны с компанией Bay Anesthesiology Associates (FGTBA) Флоридского залива. Однако это учреждение не сыграло никакой роли в дизайне или финансировании рукописи.Это не меняет приверженности авторов политике PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Экстракорпоральная мембранная оксигенация (ЭКМО) показала многообещающие результаты для тяжелобольных пациентов, которым требуется сердечно-легочная поддержка, от которых в противном случае ожидается смерть [1,2]. У пациентов, получающих поддержку ЭКМО, уровень внутрибольничной смертности составляет примерно 60–75% [3–6] из-за серьезности основной патологии и высокой частоты полиорганной недостаточности, несмотря на улучшение управления интенсивной терапией и достижения в области аппаратных технологий ЭКМО.Доступность новых методов лечения рефрактерной недостаточности кровообращения, включая вспомогательное устройство для желудочков и трансплантацию сердца, расширяет роль ЭКМО как моста к этим процедурам. Высокая стоимость и низкие показатели выживаемости у пациентов с ЭКМО требуют осведомленности о детерминантах неблагоприятных исходов для идеального отбора пациентов, чтобы избежать бесполезной помощи.

Хотя смертность от ЭКМО в основном определяется факторами, не связанными с ЭКМО (например, тяжестью основной основной патологии, количеством пораженных органов), на нее также влияют связанные с ЭКМО осложнения, такие как геморрагические события [7], необходимость заместительной почечной терапии. [8] во время поддержки ЭКМО, веноартериального режима ЭКМО [9] и количества крови, перелитого во время поддержки ЭКМО [9].Гемолиз является обычным явлением в экстракорпоральных контурах, о чем свидетельствует повышенный уровень свободного гемоглобина в плазме (PFHb) [10,11]. Гемолиз в контурах ЭКМО происходит из-за множества причин, включая отрицательное давление, создаваемое насосом в гиповолемических состояниях, развитие сгустка внутри контура или около отверстий канюли или чрезмерная скорость центробежного насоса> 3000 оборотов в минуту (об / мин) [ 12].

Неблагоприятные исходы, связанные с высоким уровнем PFHb, могут быть объяснены его склонностью вызывать прямое повреждение почек из-за обструкции почечных канальцев, потребностью в большем количестве переливаний крови с риском связанных с переливанием осложнений и даже смерти у детей, которым требуется ЭКМО после кардиохирургического вмешательства. [13].Есть также опасения по поводу возможной связи между высоким уровнем PFHb и полиорганной недостаточностью [14,15]. Ни одно исследование не изучало взаимосвязь между PFHb и выживаемостью у взрослых, получающих поддержку ЭКМО. Основная цель этого исследования — определить предикторы смертности у субъектов, получающих ЭКМО по различным сердечным или легочным показаниям, и определить, является ли повышенный гемолиз в контурах ЭКМО (измеряемый повышенным PFHb) независимым предиктором смертности.

Материалы и методы

Информация для пациентов и сбор данных

Это обсервационное исследование последовательных пациентов, которые получали поддержку ЭКМО в больнице общего профиля Тампы с 2007 по 2013 год.Совет по институциональному обзору (IRB) Университета Южной Флориды одобрил исследование и отказался от согласия пациента (номер IRB Pro0000580).

Всего за время исследования 154 пациента получили поддержку ЭКМО. Был проведен ретроспективный обзор карт со сбором клинических и лабораторных данных. Сюда входили переменные, включающие демографические данные пациентов, сопутствующие заболевания, показания для поддержки ЭКМО, характеристики ЭКМО, лабораторные показатели во время ЭКМО, требования к переливанию крови, исходы и осложнения.Через 24 часа после ЭКМО PFHb и лактатдегидрогеназа (ЛДГ) были собраны и использованы в качестве маркеров гемолиза. PFHb анализировали производной спектрометрией (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), как более подробно описано в другом месте [16]. Мы использовали пороговое значение PFHb> 50 мг / дл, установленное организацией экстракорпорального жизнеобеспечения (ELSO), как маркер тяжелого гемолиза [17].

Конечные точки исследования

Первичным результатом исследования было определение независимых предикторов внутрибольничной смертности.Вторичные результаты включали успешное отлучение от ЭКМО, переход на другую терапию и долгосрочное выживание. Успешное отлучение от ЭКМО определялось как выживаемость в течение> 48 часов после отмены ЭКМО [18]. Те, кого отлучили от поддержки ЭКМО, но умерли в течение 48 часов, были определены как безуспешно отлученные. После выписки за пациентами наблюдали, чтобы определить дни их выживания после эксплантации ЭКМО. Данные о днях выживания для тех, кто был выписан живыми из больницы, были получены в ходе поиска в системе социального обеспечения и подтверждены в ходе телефонного интервью.

Клиническое ведение

Насосы ЭКМО, используемые в период исследования, в основном представляли собой помпы Bio-Medicus BP80 (Medtronic, Inc. MN) или, реже, помпы Thoratec Centrimag (Thoratec, Плезантон, Калифорния). Антикоагуляция достигалась внутривенной инфузией гепарина со скоростью 30–60 единиц / кг / час для поддержания активированного частичного тромбопластинового времени (ЧТВ) в пределах 50–60 секунд. Гемоглобин без плазмы и другие параметры свертывания часто проверялись. Инотропная поддержка продолжалась в случаях недостаточности кровообращения для облегчения опорожнения левого желудочка и предотвращения чрезмерного растяжения левого желудочка.Диуретики использовались для поддержания отрицательного жидкостного баланса у субъектов, получавших ЭКМО по кардиологическим показаниям, с целью уменьшения заложенности легочных сосудов. Если пациент становился гемодинамически стабильным с улучшением сократительной способности левого желудочка на эхокардиографии (у пациентов с дисфункцией левого желудочка), инотропы постепенно прекращали. Насыщение кислородом непрерывно контролировалось до тех пор, пока сатурация смешанной венозной крови кислородом не превысила 70%, и поток насоса постепенно уменьшался до 500 мл / мин.Поддержка ЭКМО была прекращена либо при сохранении стабильности гемодинамического профиля пациента [19], либо в том случае, если ее продолжение было сочтено бесполезным. Мы сочли лечение бесполезным в случае серьезного повреждения головного мозга или отсутствия восстановления сердца или легких у тех, кто не пользуется вспомогательным устройством для желудочков или кандидатом на трансплантацию.

Статистический анализ

Первичный анализ сравнивал выживших и не выживших. Непрерывные переменные выражались как среднее ± стандартное отклонение и сравнивались с использованием t-критерия Стьюдента для нормально распределенных переменных и критерия суммы рангов Вилкоксона для ненормально распределенных переменных.Категориальные переменные описывались как числа и проценты и сравнивались с использованием критерия хи-квадрат или точного критерия Фишера, когда ожидаемая частота была меньше 5. Для сравнения различий в различных переменных между выжившими и не выжившими использовался одномерный анализ. Чтобы изучить независимые факторы риска смертности после поддержки ЭКМО и избежать искажающего эффекта, мы использовали метод пропорциональных рисков Кокса. Переменные, использованные в модели, были либо теми, которые достигли статистической значимости при p <0.01 при однофакторном анализе или переменных, которые считаются клинически значимыми. Для переменных, которые оставались значимыми после анализа пропорциональных рисков Кокса, кумулятивные кривые выживаемости были построены с помощью подхода Каплана-Мейера для выживших и не выживших и сравнивались с использованием лог-рангового теста. Значение p менее 0,05 считалось статистически значимым. Данные анализировали с использованием статистического программного обеспечения IBM SPSS 21.0 (IBM SPSS Version 21.0. Армонк, Нью-Йорк).

Результаты

Характеристики пациента

Всего 154 пациента получили ЭКМО по сердечным (n = 115) или легочным (n = 39) показаниям.Средний возраст пациентов составлял 51 год, 75,3% составляли мужчины. 82% пациентов получали вено-артериальную ЭКМО и 18% — вено-венозную ЭКМО. 48,7% пациентов были успешно отлучены от ЭКМО. Внутрибольничная летальность составила 33% (51/154). Демографические, клинические характеристики и характеристики ЭКМО как выживших, так и не выживших перечислены в таблице 1. В таблице 2 сравниваются госпитальные выжившие и не выжившие в соответствии с показаниями ЭКМО. Однофакторный анализ не обнаружил статистически значимых различий между выжившими и не выжившими в зависимости от заболевания пациентов, требовавших поддержки ЭКМО.Переход к вспомогательному устройству левого желудочка (LVAD), двухжелудочковому вспомогательному устройству (BIVAD), LVAD, затем сердечная трансплантация и переход к трансплантату происходили с большей частотой среди выживших по сравнению с теми, кто не выжил (таблица 3).

Одномерный и многомерный анализ факторов риска госпитальной летальности

Результаты одномерного сравнения исходных демографических данных, характеристик ЭКМО, показаний ЭКМО и осложнений между не выжившими (умершими в больнице) и выжившими (отлученными от груди и выписанными) представлены в таблицах 1, 2 и 4.По сравнению с не выжившими, у выживших был более низкий уровень молочной кислоты до ЭКМО (p = 0,026), более низкий 24-часовой уровень молочной кислоты (p = 0,023), более короткая продолжительность ЭКМО (p = 0,01), меньшее количество переливаний эритроцитов на ЭКМО (p = 0,008) и более низкое значение PFHb через 24 часа после имплантации ЭКМО (p = 0,029). 24-часовой PFHb> 50 мг / дл наблюдался у 3,9% по сравнению с 15,5% выживших и не выживших, соответственно, p = 0,002. Уровень свободного гемоглобина в плазме> 50 мг / дл наблюдался у 16,7% по сравнению с 55% выживших и не выживших, получавших веноартериальную поддержку ЭКМО, соответственно, p = 0.032. Что касается вено-венозной ЭКМО, PFHb> 50 мг / дл встречался у 0% против 80% выживших и не выживших, соответственно, p = 0,04).

Анализ пропорциональных рисков Кокса

идентифицировал PFHb> 50 мг / дл через 24 часа после начала ЭКМО в качестве независимого предиктора смертности (OR = 3,4, 95% доверительный интервал [CI]: 1,3–8,8, p = 0,011). На рис. 1 показаны результаты анализа пропорциональных рисков Кокса предикторов внутрибольничной смертности для пациентов, получающих поддержку ЭКМО. На рис. 2 и 3 показаны кривые Каплана-Мейера, сравнивающие выживаемость пациентов с уровнями PFHb через 24 часа после ЭКМО> 50 мг / дл или <50 мг / дл в зависимости от периода наблюдения.

Осложнения

В таблице 4 приводится сравнение различных осложнений, возникающих во время поддержки ЭКМО у выживших и не выживших. Наиболее частыми осложнениями у пациентов, получавших поддержку ЭКМО, были острая почечная недостаточность (80/154, 51,9%) с последующим нарушением функции печени (64/154, 41,6%) с последующим кровотечением (61/154, 39,6%). У тех, кто не выжил, чаще наблюдалась острая почечная недостаточность (p = 0,026) и дисфункция печени (p = 0,004). Наблюдалась тенденция к более высокому риску геморрагического инсульта у не выживших (3.9% против 11,7% у выживших и не выживших соответственно, p = 0,145). Гемоглобин без плазмы не прогнозировал возникновение нефатальных осложнений ЭКМО, и уровни были сопоставимы между случаями, осложненными острой почечной недостаточностью (p = 0,136), кровотечением (p = 0,554), аритмией (p = 0,663), дисфункцией печени (p = 0,885), сепсис (p = 0,891), выпот в перикард (p = 0,496), гемоторакс (p = 0,677) и ишемический инсульт (p = 0,892).

Обсуждение

Текущее исследование показало, что PFHb> 50 мг / дл в течение первых 24 часов после начала ЭКМО является независимым предиктором смертности.На основе этого открытия мы внедрили рутинную проверку PFHb с учетом того, что уровни PFHb> 50 мг / дл является признаком тяжелого гемолиза (приемлемые значения PFHb составляют 5–10 мг / дл), требующего исследования основной этиологии и его исправление, в том числе возможность изменения напора насоса.

После разрушения эритроцитов PFHb удаляется поглотителями гемоглобина (Hb). Когда тяжесть гемолиза превышает возможности внутрисосудистых механизмов поглощения Hb, возникают гемоглобинемия и гемоглобинурия в дополнение к Hb-опосредованному удалению оксида азота (NO), когда Hb связывает NO из эндотелия [20].Последующее истощение NO (сильнодействующего вазодилататора) может привести к увеличению системного и легочного сосудистого сопротивления, увеличению образования тромбина, отложению фибрина, агрегации тромбоцитов, дисфункции органов и увеличению смертности [14]. Было обнаружено, что свободный от плазмы гемоглобин> 10 мг / дл ингибирует NO-индуцированную вазодилатацию in vivo [21]. Более того, высвобождаемое при гемолизе железо (Fe) может привести к перегрузке железом в 20% случаев [22], что может привести к почечной недостаточности и повышенной проницаемости легких [23].Кроме того, гипербилирубинемия, возникшая после операции по шунтированию сердца, была связана с увеличением смертности [24]. Повреждение сублетальных эритроцитов, приводящее к снижению деформируемости и повышенной агрегации, приведет к их удалению селезенкой, снижению содержания кислорода и снижению способности проникать в мелкие капилляры, тем самым нарушая оксигенацию тканей [25] и приводя к дисфункции конечных органов [20]. Принимая все это во внимание, следует больше беспокоиться о побочном эффекте гемолиза, а не о развитии анемии, вызванной гемолизом.

Помповая технология — главный фактор, определяющий гемолиз у пациентов, получающих поддержку ЭКМО. Было обнаружено, что центробежные насосы (CF) по сравнению с системами на основе роликовых насосов демонстрируют превосходные возможности для работы с кровью [26] и поэтому более приемлемы. Однако центробежные насосы могут вызывать микрокавитацию и гемолиз. Существует также различная степень гемолиза в зависимости от типа используемого насоса CF. Насосы CF первого поколения больше по размеру, образуют зоны застоя и точки трения, которые отрицательно влияют на компоненты крови [27].Недавнее исследование Bottrell и его коллег оценило изменения PFHb с помощью трех разных насосов и обнаружило, что Levitronix PediVAS был связан со значительно меньшим гемолизом, чем Rotaflow (p <0,05) и DP3 (p <0,05) [27]. Лоусон и его коллеги сравнили три насоса CF с роликовым насосом в отношении частоты гемолиза путем измерения PFHb и обнаружили, что 2 центробежных насоса (Cobe Revolution и Jostra Rotaflow) выгодно отличаются от роликового насоса Cobe Century для окклюзионной крови в отношении количества гемолиза. произведено [28].BioMedicus BP80 (Medtronic, Inc. MN) был основным насосом, который использовался в период нашего исследования. Насос Thoratec Centrimag (Thoratec, Плезантон, Калифорния) использовался нечасто из-за значительно более высокой стоимости. Для более позднего насоса характерно более низкое число оборотов в минуту по сравнению с первым. Ожидается, что с постоянным развитием технологии насосов CF новые конструкции насосов снизят тяжесть гемолиза.

Предикторы смертности до ЭКМО, очевидно, более эффективны и полезны, чем предикторы во время поддержки ЭКМО, поскольку они помогают решить, какие пациенты должны, а какие не должны получать ЭКМО.Однако определение предикторов смертности во время поддержки ЭКМО также полезно, поскольку они помогают в прогнозировании и руководстве. Среди этих факторов, которые мы подозревали на основании своего опыта, — гемолиз, который обычно связан с неисправностью помпы. Это было более изучено с помощью вспомогательного устройства для желудочков, где было обнаружено, что гемолиз является независимым предиктором смертности (поскольку он обычно отражает тромбоз помпы), что требует замены помпы или трансплантации сердца, чтобы избежать смерти пациента.Осведомленность о PFHb> 50 в качестве независимого предиктора смертности во время ЭКМО побудит к его плановой проверке, а также к немедленному обследованию контура.

Настоящее исследование имеет все ограничения, присущие нерандомизированным исследованиям. Дизайн ретроспективный, количество случаев умеренное. Здесь мы стремимся подчеркнуть значение PFHb, маркера гемолиза, как независимого предиктора смертности у пациентов, получающих поддержку ЭКМО, поскольку он является показателем неоптимальной механики ЭКМО.Мы рекомендуем врачам проверять уровень PFHb через 24 часа после начала ЭКМО, чтобы оценить их краткосрочный прогноз. Мы предполагаем, что ежедневная проверка PFHb (после первых 24 часов) может быть полезной, и это необходимо проверить в будущих исследованиях. Необходим дальнейший технический прогресс для разработки менее травматичных устройств ЭКМО с меньшим риском гемолиза. Наше исследование также показало благоприятную частоту госпитальной смертности по сравнению с другими исследованиями и относительно хороший долгосрочный исход выживших.Основным предиктором исхода остается тяжесть первичной патологии. Инициирование поддержки ЭКМО следует рассматривать на основе оценки глобального профиля риска каждого пациента, принимая во внимание преоперационные шансы на успех, а не оценку индивидуальных факторов риска.

Благодарности

Обозначение предыдущей презентации тезисов: Отдельные результаты были представлены на ежегодном собрании Американского общества анестезиологов в 2014 году.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: HRO MM EMC DM CC.Проведены эксперименты: HRO MM EMC DM CC CS. Проанализированы данные: ММ УЧР ЕМС. Написал статью: СПЧ ММ. Критический пересмотр рукописи для важного интеллектуального содержания: MM SS CC DM EMC.

Ссылки

1. 1. Peek GJ, Mugford M, Tiruvoipati R, Wilson A, Allen E, Thalanany MM, et al. Эффективность и экономическая оценка традиционной искусственной вентиляции легких по сравнению с экстракорпоральной мембранной оксигенацией при тяжелой дыхательной недостаточности у взрослых (CESAR): многоцентровое рандомизированное контролируемое исследование.Ланцет. 17 октября 2009 г., 374 (9698): 1351–63. pmid: 19762075
2. 2. Конрад С.А., Райкус П.Т., Далтон Х. Отчет о регистре экстракорпоральной жизнеобеспечения за 2004 г. ASAIO J.2005; 51: 4–10. pmid: 15745126
3. 3. Lin CY, Tsai FC, Tian YC, Jenq CC, Chen YC, Fang JT и др. Оценка систем оценки результатов для пациентов с экстракорпоральной мембранной оксигенацией. Ann Thorac Surg. 2007 Октябрь; 84 (4): 1256–62. pmid: 17888979
4. 4. Lin CY, Chen YC, Tsai FC, Tian YC, Jenq CC и др.Классификация RIFLE позволяет прогнозировать краткосрочный прогноз у тяжелобольных пациентов с острой почечной недостаточностью, поддерживаемой экстракорпоральной мембранной оксигенацией. Трансплантат Nephrol Dial. 2006; 21: 2867–2873. pmid: 16799171
5. 5. Chen YC, Tsai FC, Chang CH, Lin CY, Jenq CC, Juan KC и др. Прогноз пациентов при экстракорпоральной мембранной оксигенации: влияние острого повреждения почек на смертность. Ann Thorac Surg. 2011 Янв; 91 (1): 137–42. pmid: 21172502
6. 6. Растан А.Дж., Деге А., Мор М., Долл Н., Фальк В., Вальтер Т. и др.Ранние и поздние исходы 517 последовательных взрослых пациентов, получавших экстракорпоральную мембранную оксигенацию по поводу рефрактерного кардиогенного шока после кардиотомии. J Thorac Cardiovasc Surg. 2010. 139 (2): 302–11. pmid: 20106393
7. 7. Оброн С., Ченг А.С., Пилчер Д., Леонг Т., Магрин Дж., Купер Д.Д. и др. Факторы, связанные с исходами пациентов, получавших поддержку экстракорпоральной мембранной оксигенации: 5-летнее когортное исследование. Crit Care. 2013; 17 (2): R73. pmid: 23594433
8. 8. Kielstein JT, Heiden AM, Beutel G, Gottlieb J, Wiesner O, Hafer C и др.Функция почек и выживаемость у 200 пациентов, получающих терапию ЭКМО. Пересадка нефрола Dial. 2013. 28 (1): 86–90. pmid: 23136216
9. 9. Смит А., Хардисон Д., Бриджес Б., Пич Дж. Объем переливания эритроцитов среди пациентов, получающих экстракорпоральную мембранную оксигенацию. Перфузия. 2013. 28 (1): 54–60. pmid: 22892295
10. 10. Кавахито С., Маеда Т., Мотомура Т., Иситоя Х., Такано Т., Нонака К. и др. Гемолитические характеристики оксигенаторов при клинической экстракорпоральной мембранной оксигенации.ASAIO J. Ноябрь-декабрь 2002 г.; 48 (6): 636–9. pmid: 12455774
11. 11. Meyer AD, Wiles AA, Rivera O, Wong EC, Freishtat RJ, Rais-Bahrami K и др. Гемолитические и тромбоцитопатические характеристики систем экстракорпоральной мембранной оксигенации при моделированной скорости потока для новорожденных. Pediatr Crit Care Med. 2012; 13 (4): e255–61. pmid: 22596067
12. 12. Тоомасиан Дж. М., Бартлетт Р. Х. Насосы гемолиза и ЭКМО в 21 веке. Перфузия. 2011; 26 (1): 5–6. pmid: 21177726
13. 13.Gbadegesin R, Zhao S, Charpie J, Brophy PD, Smoyer WE, Lin JJ. Значение гемолиза для экстракорпорального жизнеобеспечения после кардиохирургических вмешательств у детей. Педиатр Нефрол. 2009 Март; 24 (3): 589–95. pmid: 122
14. 14. Ротер Р.П., Белл Л., Хиллмен П., Гладвин М.Т. Клинические последствия внутрисосудистого гемолиза и внеклеточного плазменного гемоглобина: новый механизм заболевания человека. J Am Med Assoc. 2005; 293: 1653–62.
15. 15. Vermeulen Windsant IC, Hanssen SJ, Buurman WA, Jacobs MJ.Сердечно-сосудистая хирургия и повреждение органов: время пересмотреть роль гемолиза. J Thorac Cardiovasc Surg. 2011; 142: 1–11. pmid: 21570697
16. 16. Круз-Ландейра А., Бал М.Дж., Лопес-Ривадулла М. Определение метгемоглобина и общего гемоглобина в токсикологических исследованиях с помощью производной спектрофотометрии. J Anal Toxicol, 2002; 26: 67–72. pmid: 117
17. 17. http://www.elso.med.umich.edu/WordForms/ELSO Общие правила Все ECLS Version1.1.pdf. По состоянию на 05.11.2014 г.
18. 18.Чен Ю.С., Чао А., Ю Х.Й., Ко В.Дж., Ву И.Х., Чен Р.Дж. Анализ и результаты длительной реанимации у пациентов с остановкой сердца, спасенных экстракорпоральной мембранной оксигенацией. J Am Coll Cardiol. 15 января 2003 г.; 41 (2): 197–203. pmid: 12535808
19. 19. Wu MY, Lin PJ, Tsai FC, Haung YK, Liu KS, Tsai FC. Влияние существовавшей ранее органной дисфункции на экстракорпоральное жизнеобеспечение при сердечно-легочной недостаточности после кардиотомии. Реанимация. Октябрь 2008 г., 79 (1): 54–60. pmid: 18617313
20. 20.Vercaemst L. Гемолиз у кардиохирургических пациентов, перенесших искусственное кровообращение: обзор в поисках алгоритма лечения. J Extra Corpor Technol. 2008. 40 (4): 257–67. pmid: 155
21. 21. Джефферс А., Гладвин М.Т., Ким-Шапиро Д.Б. Расчет поглощения оксида азота гемоглобином плазмы при гемолитической анемии // Free Radic Biol Med. 2006; 41: 1557–65. pmid: 17045924
22. 22. Мамби С., Ко Т.В., Пеппер Дж. Р., Гаттеридж Дж. М.. Риск перегрузки железом снижается при операции на коронарной артерии сокращающегося сердца по сравнению с обычным шунтированием.Biochim Biophys Acta. 2001 29 ноября; 1537 (3): 204–10. pmid: 11731222
23. 23. Дэвис С., Каус А., Загер Р., Хараш Э., Кокран Р. Острая почечная недостаточность после КПБ связана со снижением уровня ферритина в сыворотке. J Am Soc Nephrol. 1999; 10: 2396–402. pmid: 10541300
24. 24. Ань Ю, Сяо Ю.Б., Чжун QJ. Гипербилирубинемия после операции по экстракорпоральному кровообращению: недавнее и перспективное исследование. Мир Дж. Гастроэнтерол. 2006, 7 ноября; 12 (41): 6722–6. pmid: 17075992
25. 25. Ватанабэ Н., Сакота Д., Очучи К., Такатани С.Деформируемость эритроцитов и ее связь с травмой крови в ротационных насосах крови. Artif Organs. 2007; 31: 352–8. pmid: 17470204
26. 26. Беннетт М., Хортон С., Туис С., Огюстен С., Розенберг М., Бризард С. Гемолиз, вызванный помпой: сравнение устройств для краткосрочной помощи желудочкам. Перфузия. 2004; 19: 107–111. pmid: 15162925
27. 27. Боттрелл С., Беннетт М., Огюстен С., Туис С., Шульц Б., Хортон А. и др. сравнительное исследование производства гемолиза в трех современных центробежных насосах.Перфузия. 2014. 29 (5): 411–6. pmid: 24406272
28. 28. Лоусон Д.С., Инг Р., Чейфец И.М., Вальчак Р., Крейг Д., Шульман С. и др. Гемолитические характеристики трех имеющихся в продаже центробежных насосов для крови. Pediatr Crit Care Med. 2005. 6 (5): 573–7. pmid: 16148820

Как диагностируется гемолитическая анемия?

Ваш врач диагностирует гемолитическую анемию на основании вашего медицинского и семейного анамнеза, медицинского осмотра и результатов анализов.

Привлеченные специалисты

Врачи первичного звена, например семейный врач или педиатр, могут помочь диагностировать и лечить гемолитическую анемию.Ваш лечащий врач также может направить вас к гематологу. Это врач, специализирующийся на диагностике и лечении заболеваний и расстройств крови.

Также могут быть задействованы врачи и клиники, специализирующиеся на лечении наследственных заболеваний крови, таких как серповидноклеточная анемия и талассемия.

Если ваша гемолитическая анемия передается по наследству, вы можете проконсультироваться с генетическим консультантом. Консультант может помочь вам понять ваш риск рождения ребенка с этим заболеванием. Он или она также может объяснить доступные вам варианты.

Медицинские и семейные истории

Чтобы выяснить причину и степень тяжести гемолитической анемии, ваш врач может задать подробные вопросы о ваших симптомах, личной истории болезни и вашей семейной истории болезни.

Он или она может спросить:

• У вас или у кого-либо из членов вашей семьи были проблемы с анемией
• Вы недавно перенесли какое-либо заболевание или заболевание
• Какие лекарства Вы принимаете, а какие
• Вы подверглись воздействию определенных химикатов или веществ
• У вас есть искусственный сердечный клапан или другое медицинское устройство, которое может повредить ваши эритроциты

Физический осмотр

Ваш врач проведет медицинский осмотр, чтобы проверить наличие признаков гемолитической анемии.Он или она попытается выяснить, насколько серьезно это состояние и что его вызывает.

Экзамен может включать:

• Проверка на желтуху (желтоватый цвет кожи или белков глаз)
• Прислушиваться к своему сердцу на предмет учащенного или нерегулярного сердцебиения
• Прослушивание учащенного или неравномерного дыхания
• Пощупывание живота, чтобы проверить размер селезенки
• Проведение тазового и ректального обследования для выявления внутреннего кровотечения

Диагностические тесты и процедуры

Многие тесты используются для диагностики гемолитической анемии.Эти тесты могут помочь подтвердить диагноз, найти причину и выяснить, насколько серьезным является состояние.

Общий анализ крови

Часто первым тестом, используемым для диагностики анемии, является общий анализ крови (CBC). Общий анализ крови измеряет многие части вашей крови.

Этот тест проверяет уровень гемоглобина и гематокрита (hee-MAT-oh-crit). Гемоглобин — это богатый железом белок в красных кровяных тельцах, который переносит кислород в организм. Гематокрит — это показатель того, сколько красных кровяных телец занимают в вашей крови.Низкий уровень гемоглобина или гематокрита — признак анемии.

Нормальный диапазон этих уровней может варьироваться в зависимости от расовых и этнических групп населения. Ваш врач может объяснить вам результаты ваших анализов.

Общий анализ крови также проверяет количество эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в вашей крови. Аномальные результаты могут быть признаком гемолитической анемии, другого заболевания крови, инфекции или другого состояния.

Наконец, общий анализ крови смотрит на средний корпускулярный (кор-ПУС-кюляр) объем (MCV).MCV — это мера среднего размера ваших эритроцитов. Результаты могут указывать на причину вашей анемии.

Другие анализы крови

Если результаты клинического анализа крови подтверждают, что у вас анемия, вам могут потребоваться другие анализы крови, чтобы выяснить, какой у вас тип анемии и насколько она серьезна.

Подсчет ретикулоцитов. Подсчет ретикулоцитов (re-TIK-u-lo-site) измеряет количество молодых эритроцитов в крови. Тест показывает, вырабатывает ли ваш костный мозг эритроциты с правильной скоростью.

Люди с гемолитической анемией обычно имеют высокое количество ретикулоцитов, потому что их костный мозг усердно работает, чтобы заменить разрушенные эритроциты.

Периферический мазок. Для этого теста ваш врач будет смотреть на ваши эритроциты через микроскоп. Некоторые виды гемолитической анемии изменяют нормальную форму эритроцитов.

Тест Кумбса. Этот тест может показать, вырабатывает ли ваше тело антитела (белки) для разрушения эритроцитов.

Гаптоглобин, билирубин и функциональные пробы печени. Когда эритроциты разрушаются, они выделяют гемоглобин в кровоток. Гемоглобин соединяется с химическим веществом, называемым гаптоглобином. Низкий уровень гаптоглобина в кровотоке — признак гемолитической анемии.

Гемоглобин расщепляется на соединение, называемое билирубином. Высокий уровень билирубина в кровотоке может быть признаком гемолитической анемии. Высокий уровень этого соединения также наблюдается при некоторых заболеваниях печени и желчного пузыря.Таким образом, вам могут потребоваться функциональные тесты печени, чтобы выяснить, что вызывает высокий уровень билирубина.

Электрофорез гемоглобина. Этот тест проверяет различные типы гемоглобина в вашей крови. Это может помочь диагностировать тип анемии, который у вас есть.

Обследование на пароксизмальную ночную гемоглобинурию (ПНГ). При ПНГ в красных кровяных тельцах отсутствуют определенные белки. Тест на ПНГ может обнаружить эритроциты, в которых отсутствуют эти белки.

Проверка осмотической хрупкости. Этот тест ищет более хрупкие эритроциты, чем обычно. Эти клетки могут быть признаком наследственного сфероцитоза (наследственный тип гемолитической анемии).

Исследование на дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD) . При дефиците G6PD в красных кровяных тельцах отсутствует важный фермент, называемый G6PD. Тест на дефицит G6PD ищет этот фермент в образце крови.

Анализ мочи

Анализ мочи будет определять наличие свободного гемоглобина (белка, переносящего кислород в кровь) и железа.

Тесты костного мозга

Тесты костного мозга показывают, здоров ли ваш костный мозг и производит ли оно достаточное количество кровяных телец. Два теста костного мозга — это аспирация (as-pi-RA-shun) и биопсия.

Для аспирации костного мозга ваш врач удаляет небольшое количество жидкости костного мозга через иглу. Образец исследуют под микроскопом, чтобы проверить наличие дефектных клеток.

Биопсия костного мозга может быть сделана одновременно с аспирацией или после нее. Для этого теста ваш врач удаляет небольшое количество ткани костного мозга через иглу.Ткань исследуется, чтобы проверить количество и тип клеток в костном мозге.

Вам могут не понадобиться анализы костного мозга, если анализы крови показывают причину гемолитической анемии.

Тесты на другие причины анемии

Поскольку у анемии много причин, вам могут быть назначены тесты на такие состояния, как:

• Почечная недостаточность
• Отравление свинцом
• Дефицит витаминов или железа

Тестирование новорожденных на серповидно-клеточную анемию и дефицит G6PD

Все штаты требуют скрининга на серповидно-клеточную анемию в рамках своих программ скрининга новорожденных.Некоторые государства также требуют проверки на дефицит G6PD. Эти унаследованные типы гемолитической анемии можно обнаружить с помощью обычных анализов крови.

Как можно раньше диагностировать эти состояния, чтобы дети могли получить надлежащее лечение.

Источник: Национальный институт сердца, легких и крови, Национальные институты здравоохранения.

.