40. Hitosugi M, Hamada K, Misaka K. Эффекты Bacillus subtilis var. продукты натто при симптомах, вызванных нарушением кровотока у пациенток с заболеваниями, связанными с образом жизни. Int J Gen Med . 2015; 8: 41-46.2565355141. Чанг YY, Лю JS, Lai SL, Wu HS, Lan MY. Мозжечковое кровоизлияние, вызванное совместным применением наттокиназы и аспирина у пациента с церебральными микрокровотечениями. Медицинский работник . 2008; 47 (5): 467-469.1831098542. Элахи М.М., Чой СН, Конда С., Шейк Дж. Последствия замены наттокиназы на варфарин пациенту после замены аортального клапана механическим протезом. Proc (Bayl Univ Med Cent) . 2015; 28 (1): 81-82.2555281043. Иномата Н., Чин К., Нагашима М., Икезава З. Анафилаксия с поздним началом из-за поли (γ-глутаминовой кислоты) в супе из коммерческой холодной китайской лапши у пациента с аллергией на ферментированные соевые бобы (натто). Аллергол Инт . 2011; 60 (3): 393-396.2143043744.Ikezawa Z, Isoda Y, Inomata N, Matsukura S, Aihara M. Клинический обзор 18 пациентов с поздним началом анафилаксии после приема внутрь соевых бобов, ферментированных Bacillus subtilis (натто). [Аннотация] 30-й симпозиум Collegium Internationale Allergologicum. Петерсберг, Германия. 15 сентября 2014 г. http://www.ciaweb.org/UserFiles/sym14-finalv11_lores.pdf. Проверено 2 февраля 2015 г. 45. Сугимото С., Фуджи Т., Моримия Т., Джодо О., Накамура Т. Фибринолитическая активность новой протеазы, полученной из гриба-продуцента темпе, Fusarium sp.BLB. Биоси Биотехнология Биохим . 2007; 71 (9): 2184-2189.17827689

Заявление об ограничении ответственности

Эта информация относится к травяным, витаминным, минеральным или другим диетическим добавкам. Этот продукт не проверялся FDA, чтобы определить, является ли он безопасным или эффективным, и не подпадает ли он под действие стандартов качества и стандартов сбора информации о безопасности, которые применимы к большинству рецептурных препаратов. Эта информация не должна использоваться для принятия решения о приеме этого продукта.Эта информация не подтверждает, что этот продукт безопасен, эффективен или одобрен для лечения любого пациента или состояния здоровья. Это только краткое изложение общей информации об этом продукте. Он НЕ включает всю информацию о возможном использовании, направлениях, предупреждениях, мерах предосторожности, взаимодействиях, побочных эффектах или рисках, которые могут относиться к этому продукту. Эта информация не является конкретным медицинским советом и не заменяет информацию, которую вы получаете от своего поставщика медицинских услуг. Вам следует поговорить со своим врачом для получения полной информации о рисках и преимуществах использования этого продукта.

Этот продукт может неблагоприятно взаимодействовать с определенными состояниями здоровья и здоровья, другими рецептурными и безрецептурными лекарствами, продуктами питания или другими пищевыми добавками. Этот продукт может быть небезопасным при использовании перед операцией или другими медицинскими процедурами. Важно полностью проинформировать вашего врача о травах, витаминах, минералах или любых других добавках, которые вы принимаете, перед любой операцией или медицинской процедурой. За исключением некоторых продуктов, которые обычно считаются безопасными в нормальных количествах, включая использование фолиевой кислоты и пренатальных витаминов во время беременности, этот продукт недостаточно изучен, чтобы определить, безопасно ли его использовать во время беременности или кормления грудью или лицами моложе. старше 2 лет.

Подробнее о наттокиназе

Сопутствующие лечебные руководства

Дополнительная информация

Всегда консультируйтесь со своим врачом, чтобы убедиться, что информация, отображаемая на этой странице, применима к вашим личным обстоятельствам.

Заявление об ограничении ответственности за медицинское обслуживание

Как правильно съесть Натто, восхитительный японский суперпродукт

▼ Youtube

Ниже вы найдете текст и изображения, которые все объясняют.В объяснении есть моменты, которых нет в видео, поэтому, пожалуйста, прочтите его!

Что такое натто?

Натто — это ферментированный продукт, полученный путем ферментации соевых бобов с использованием бактерий, называемых «Bacillus subtilis».

Согласно древнейшей легенде, связанной с его созданием, он был придуман где-то в 10 веке до нашей эры и в середине 3 века нашей эры. Считается, что его начали продавать как продукт в период Эдо (1603–1868), и в конечном итоге он стал стандартной частью японского завтрака.

Сегодня вы можете купить 3 упаковки натто примерно за 100 иен в таких местах, как супермаркеты или мини-маркеты в Японии. Он чрезвычайно популярен как полезный для здоровья деликатес, поскольку содержит большое количество витамина К, соевого белка и пищевых волокон. Поскольку это ферментированная пища, она издает особый запах, исходящий от бактерий, который людям явно нравится или не нравится.

Виды натто

Существует несколько видов натто, которые различаются размером, разновидностью сои, методом обработки и т. Д.

Слева у вас натто с соевыми бобами разного размера: крупными, средними и мелкими.

Там даже натто помещают в чашку, чтобы ее было легче есть!

С другой стороны, есть еще один вид натто, называемый «хикивари натто», который довольно известен. Он создается путем измельчения соевых бобов перед их ферментацией.

Как употреблять натто

Во-первых, откройте упаковку и достаньте пакеты со специальным соусом и японской горчицей.

Оторвите прозрачную пленку поверх натто.

Тщательно перемешайте натто.
Говорят, что вкус лучше, если его хорошо перемешать, чтобы он стал липким.

Добавьте специальный соус и японскую горчицу.

Снова перемешайте все вместе.

Съешьте вместе с рисом.Он также приятен на вкус, если съесть его отдельно!

Как снять прозрачную пленку

Натто чрезвычайно липкий и липкий, поэтому, если вы не будете осторожны, ваши руки быстро испачкаются при снятии прозрачной пленки. Чтобы этого не произошло, мы научим вас некоторым методам снятия прозрачной пленки, не пачкая рук!

Метод торнадо

Откройте упаковку и возьмите прозрачную пленку.

Двигайте рукой по кругу, собирая нитки натто.

Положите его на крышку упаковки.

Скользящий метод

Откройте упаковку.

Сдвиньте пленку так, чтобы она выступала с одной стороны контейнера.

Закройте крышку и вытяните пленку.

Супер секретный метод

Подготовьте одноразовые деревянные палочки для еды (еще не расколотые) и откройте упаковку.

Воткните палочками в пленку.

Поверните их, чтобы удалить пленку.

Топпинги для Натто

Если запах натто не нравится, рекомендуется его чем-нибудь приправить.Добавление различных ингредиентов или приправ не только улучшает вкус, но также может немного смягчить уникальный запах натто.

Стандартные начинки включают (слева на картинке выше) зеленый лук, кацуобуси (нарезанный сушеный бонито), кимчи и сырые яйца.

японцев добавляют либо целое сырое яйцо, либо только желток, но для людей из стран, где употребление сырых яиц не является нормальным явлением, попробовать это с яйцом с солнечной стороной вверх может быть хорошим началом.

Есть много других ингредиентов, которые хорошо сочетаются с натто. Например, попробуйте его с такими ингредиентами, как васаби, сыр, майонез, нори (морские водоросли), листья периллы или умэбоши (маринованные сливы). Перец или тунец тоже отлично сочетаются с натто!

Еще один распространенный способ есть натто — это добавить выбранные вами ингредиенты, а затем хорошо смешать их с соевым соусом вместо специального соуса или японской горчицы, которые идут в упаковке! Найдите подходящую начинку и попробуйте правильно съесть натто — он обязательно будет вкусным!

Удивительно, но натто хорошо сочетается не только с рисом, но и с хлебом и макаронами.Испытайте себя, попробовав!

Африканский журнал микробиологических исследований

РЕФЕРАТ

Штамм Bacillus natto был выделен из натто, и было обнаружено, что он имеет высокий выход наттокиназы. Фрагменты генов aprN и pro-aprN, кодирующие наттокиназу из Bacillus natto, амплифицировали с использованием двух пар праймеров и экспрессировали в клетках-хозяевах Bacillus subtilis WB800N с использованием плазмиды pHT43 в качестве вектора.В этой системе было исследовано влияние лидерных пептидов на активность наттокиназы, что показало, что эти лидерные пептиды опосредуют функцию сворачивания наттокиназы. После оптимизации условий экспрессии (1 ммоль / л индуктора IPTG при 37 ° C, pH 7,5, OD600 культуры клеток 0,6) максимальная ферментативная активность наттокиназы составила 848,52 МЕ / мл после индукции ферментации в течение 4 часов, при этом время был произведен максимальный внеклеточный белок. Среда для ферментации инженерного штамма была оптимизирована и была выделена очищенная наттокиназа с помощью осаждения соли и ультрафильтрации.По отношению к супернатантам ферментации степень очистки наттокиназы достигала 6,63 с общим извлечением 80% и удельной активностью фермента 11507,92 МЕ / мг. Эти результаты показывают, что сверхэкспрессия наттокиназы с использованием вектора pHT43 в клетках WB800N является эффективным средством достижения эффективного производства наттокиназы, и сконструированные штаммы, сконструированные здесь, имеют большие перспективы в качестве потенциальных промышленных штаммов для продукции наттокиназы.

Ключевые слова: Наттокиназа, ген aprN, Bacillus subtilis WB800N, фибринолитическая активность, сконструированный штамм, ферментация.

Sumi et al. (1987) впервые продемонстрировали присутствие в натто сильного фибринолитического фермента, который они назвали наттокиназой (NK) (Sumi et al., 1987; Sumi et al., 1988). Впоследствии исследователи из разных стран провели исследование наттокиназы, определив, что открытая рамка считывания, кодирующая ген наттокиназы, состоит из 381 аминокислоты, из которых 29 N-концевых аминокислот образуют сигнальный пептид, следующие 77 составляют лидерный пептид. , а следующие 275 аминокислот образуют зрелый пептид (Nakamura et al., 1992). Наттокиназа представляет собой щелочную протеазу с молекулярной массой около 27,7 кДа и изоэлектрической точкой белка PI 8,6 (Fujita et al., 1993).

Как в исследованиях на животных, так и на людях, NK проявлял значительную и мощную фибринолитическую и антитромботическую активность (Fujita et al., 1995; Nagata et al., 2017; Chen et al., 2018). NK не только непосредственно растворяет фибрин, но также способствует высвобождению активатора плазминогена тканевого типа (tPA) из клеток и катализирует высвобождение проурокиназы из печени, тем самым увеличивая образование плазминогена (Dabbagh et al., 2014). В клинических испытаниях пероральные NK увеличивали tPA, значительно снижали ELT и значительно снижали уровни фактора VII и фактора VIII в крови человека, что позволяет предположить, что NK можно использовать в качестве фибринолитического / антикоагулянтного агента с потенциалом снижения риска тромбоза и сердечно-сосудистых заболеваний. у человека (Sumi et al., 1990; Hsia et al., 2009; Kurosawa et al., 2015). Кроме того, было обнаружено, что NK обладает антигипертензивным (Lee et al., 2015), антиатеросклеротическим, гиполипидемическим и антикоагулянтным (Park et al., 2012) и нейропротекторными эффектами (Metkar et al., 2017). Недавние токсикологические исследования ( in vivo и in vitro ) предоставляют убедительные доказательства безопасности перорального употребления NK (Lampe et al., 2016). Таким образом, исследования показали, что NK безопасен, экономичен, имеет длительный период полураспада, его легко производить в больших количествах и он обладает множеством полезных сердечно-сосудистых эффектов, что делает его пригодным лекарством для лечения сердечно-сосудистых заболеваний (Dabbagh et al. др., 2014; Рен и др., 2017).

Чтобы повысить активность наттокиназы и упростить последующие операции, гетерологичная экспрессия наттокиназы была изучена в нескольких системах микробной экспрессии, в том числе в Escherichia coli , Pichia pastoris, Bacillus subtilis и Lactococcus lactis (Wei et al., 2015; Wu) и др., 2011). Наттокиназа достигает высоких уровней экспрессии в модельных системах E. coli , но большинство рекомбинантных белков в них находятся в форме неактивных телец включения (Ni et al., 2016). Хотя активная наттокиназа может экспрессироваться в рекомбинантных P. pastoris и L. lactis , экспрессия относительно низкая и очистка продукта затруднена (Dabbagh et al., 2014). Как грамположительная бактерия, B. subtilis является привлекательным хозяином для продукции гетерологичных секретируемых белков, поскольку он непатоген и способен секретировать функциональные внеклеточные белки непосредственно в культуральную среду (Nishito et al., 2010). .

В этом исследовании мы использовали челночную плазмиду pHT43 для создания двух генно-инженерных штаммов B. subtilis WB800N, и затем мы оптимизировали условия экспрессии этих генно-инженерных штаммов. Наконец, мы установили оптимальные протоколы для последующего разделения и очистки NK с помощью осаждения солей и ультрафильтрации.

Бактериальные штаммы, плазмиды и реагенты

B. subtilis natto и E. coli DH5α — штаммы, консервированные в лабораторных условиях. B. subtilis WB800N и вектор pHT43 были приобретены в Wuhan Miaoling Biotech.Все ферменты, используемые для манипуляций с ДНК, были приобретены в Takara (Далянь). Изопропил-β-D тиогалактопиранозид (IPTG) был получен от Bio Basic Inc. Стандарт урокиназы (1240 МЕ) был приобретен в Beijing Zhongke Quality Biotech. Фибриноген и тромбин были приобретены в Shanghai Yuanye Biotech.

Амплификация гена наттокиназы

Эталонная последовательность гена наттокиназы из B. subtilis YF038 (номер доступа в GenBank AY219901) была использована для конструирования специфических праймеров (таблица 1) с использованием биологического программного обеспечения Clone Manager, и эти праймеры были синтезированы Sangon Biotech (Шанхай).ПЦР-амплификацию последовательности гена проводили с использованием геномной ДНК из B. subtilis natto в качестве матрицы. Оптимизированная программа ПЦР для амплификации гена была следующей: денатурация при 94 ° C в течение 5 мин, затем 30 циклов по 30 с при 94 ° C, 30 с при 55 ° C и 1 мин при 72 ° C, затем заключительное удлинение в течение 5 минут при 72 ° C.

Конструирование штаммов бактерий

Продукты гена амплифицированного aprN (содержащего только последовательность зрелого пептида NK), про-aprN (содержащего как лидерную, так и последовательность зрелого пептида NK) и плазмиду pHT43 расщепляли с использованием BamH I и Sma I, а затем лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4. .Затем лигированные плазмиды pHT43-aprN и pHT43-pro-aprN трансформировали по отдельности в клетки E.coli DH5a и размножали в среде с добавлением 100 мкг / мл ампициллина (Tu et al., 2016; Zhou et al., 2018 ). Рекомбинантную плазмидную ДНК pHT43-aprN или pHT43-pro-aprN из отдельных колоний экстрагировали и подтверждали расщеплением рестрикционным ферментом и секвенированием. Последовательности ДНК этих вставок pHT43-aprN и pHT43-pro-aprN были проанализированы Sangon Biotech (Шанхай).

Б. subtilis Клетки WB800N, полученные из глицерина, затем наносили штрихами на чашки с агаром, содержащим неомицин, и инкубировали в течение ночи при 37 ° C. Затем были получены компетентные клетки WB800N, как описано ранее Chityala et al. (2015), и рекомбинантные плазмиды pHT43-aprN или pHT43-pro-aprN с подтвержденной последовательностью вводили в клетки посредством электропорации (Vojcic et al., 2012). Эти электротрансформированные клетки быстро добавляли в 500 мкл среды для реанимации и инкубировали в течение 40 мин.Затем эти клетки добавляли к свежей стерильной среде Лурия – Бертани (LB) (1 мл) и инкубировали еще 45 мин. Клетки центрифугировали при 3000 об / мин в течение 2 минут, и осадки клеток ресуспендировали в 100 мкл среды LB и распределяли по чашкам с агаром LB, содержащим хлорамфеникол, которые затем инкубировали при 37 ° C в течение ночи. Трансформированные колонии дополнительно отбирали с использованием планшета с двумя антибиотиками. Затем рекомбинантную плазмидную ДНК из отдельных колоний экстрагировали и подтверждали амплификацией ПЦР.Проверенные сконструированные штаммы, названные WB800N / pHT43-aprN и WB800N / pHT43-pro-aprN, затем хранили в глицерине при -80 ° C.

Индуцированная экспрессия инженерной наттокиназы

Отдельные колонии WB800N / pHT43-aprN и WB800N / pHT43-pro-aprN инокулировали в 25 мл LB, содержащего хлорамфеникол (5 мкг / мл), и инкубировали при 37 ° C со встряхиванием при 200 об / мин в течение ночи. Во время последующего культивирования pH поддерживали на фиксированном уровне 7,5. Свежую среду LB (25 мл) инокулировали этой ночной культурой в виде 2% инокулята, а затем инкубировали при 37 ° C со встряхиванием 200 об / мин.Экспрессию NK в этих клетках индуцировали с использованием 0,1 мМ IPTG после того, как плотность клеток достигла 0,6–0,8 OD ₆₀₀ (оптическая плотность при 600 нм), а затем клетки инкубировали при 30 ° C в течение 24 часов. Затем образцы собирали и центрифугировали при 8000 об / мин в течение 2 минут при 4 ° C, и супернатанты хранили при 4 ° C для последующего анализа SDS-PAGE и определения ферментативной активности NK.

Определение молекулярной массы модифицированной наттокиназы

SDS-PAGE выполняли, как описано ранее (Laemmli et al., 1970). Для оценки уровней экспрессии NK в образцах брали одинаковое количество супернатанта из каждой культуры для приготовления идентично разведенных загрузочных образцов, и эти образцы обрабатывали на геле вместе с лестницей молекулярной массы. Затем определяли молекулярную массу сконструированных белков NK с помощью стандартной белковой лестницы и полуколичественно измеряли уровни экспрессии этого белка.

Анализ фибринолитической активности

Инженерная ферментативная активность NK оценивалась с использованием метода фибриновых пластин, как описано ранее (Man et al., 2018) с небольшими корректировками. Все растворы урокиназы, тромбина, агарозы и фибриногена готовили в фосфатном буфере 10 ммоль / л (pH 7,5). 5 мл раствора агарозы (10 г / л), 5 мл раствора фибриногена (2,2 г / л) и 100 мкл (10 МЕ) тромбина смешивали в колбе Эрленмейера на 50 мл, а затем выливали в стерильные чашки Петри. Раствор в планшете оставляли в покое на 1 час для образования фибриновых сгустков, а затем в планшете делали лунки диаметром 2 мм для внесения образца. 1 мл ферментационного бульона центрифугировали при 8000 об / мин в течение 2 минут при 4 ° C, а супернатант хранили при 4 ° C для анализа ферментативной активности.Для наблюдения за фибринолитической активностью в каждую лунку осторожно добавляли 4 мкл этого раствора образца, планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 18 часов, а затем измеряли диаметр прозрачного круга фибрилл. Восемь различных концентраций стандартного раствора урокиназы разбавляли для получения стандартной кривой активности наттокиназы, позволяющей количественно оценить фибринолитическую активность NK.

Оптимизация параметров ферментации для экспрессии сконструированной наттокиназы

Был проведен тест параметров ферментации, чтобы максимизировать выработку инженерной наттокиназы.Параметры теста, которые модулировались один за другим, включали: температуру культивирования (18, 25, 30, 37 и 40 ° C), pH среды (4, 5, 6, 7, 7,5, 8, 9, 10, 11, и 12), концентрации IPTG для индукции экспрессии NK (0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4 и 1,6 ммоль / л) и стадии роста клеток во время индукции IPTG (культура клеток OD ₆₀₀ 0,2, 0,6, 1,0, 1,4 и 1,8). В каждой группе экспериментов был один контрольный образец и три параллельных повтора. Каждый образец измеряли в среднем 3 раза, и среднее значение анализировали как статистические данные.

Выделение и очистка наттокиназы

Генно-инженерный посевной раствор инокулировали 3% посевным материалом в 100 мл оптимизированной среды для ферментации (содержащей 26,05 г / л пептона, 29,29 г / л глюкозы, 1,5 г / л MgSO ₄ , 0,74 г / л CaCl ₂ , 1,5 г / л KH ₂ PO ₄ , 10 г / л NaCl, pH 7,2 ~ 7,5), в шейкере 200 об / мин, 37 ° C и выращивание до плотности клеток OD _{600 нм} = 0.6, после чего добавляли 1 мМ IPTG для индукции ферментации в течение 4 часов. После ферментации образцы вращали со скоростью 8000 об / мин в течение 10 минут для сбора супернатанта ферментации. К супернатанту добавляли сульфат аммония до 30%, и образцы оставляли на ночь при 4 ° C с последующим центрифугированием при 12000 об / мин в течение 20 минут для удаления супернатанта. Затем добавляли сульфат аммония до 60% насыщения, после чего его оставляли на ночь при 4 ° C с последующим вращением при 12000 об / мин. Через 20 минут осадок растворяли в 5 мл 0.04 моль / л барбитального натрий-HCl буфера, pH 8,0, и неочищенный раствор фермента получали после диализа.

Соответствующие количества неочищенного раствора фермента после высаливания добавляли в ультрафильтрационную центрифужную пробирку 30 кДа и центрифугировали при низкой температуре в течение 20 минут со скоростью 8000 об / мин. Затем ультрафильтрат переносили в центрифужную пробирку для ультрафильтрации 10 кДа и центрифугировали при 8000 об / мин в течение 20 минут. Ультрафильтрованный раствор хранили при 4 ° С и подвергали последующему анализу.

Получение рекомбинантных плазмид и сконструированных штаммов

Два набора фрагментов ДНК, кодирующих ген наттокиназы, амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК B. subtilis natto. Отдельные полосы на рисунке 1 подтверждают, что продукты ПЦР aprN (размер 828 п.н.) и про-aprN (размер 1059 п.о.) имеют ожидаемый размер. Затем рекомбинантные плазмиды pHT43-aprN и pHT43-pro-aprN экстрагировали из клеток E.coli DH5a и проверяли расщеплением рестрикционным ферментом с использованием BamH I и Sma I (рис. 2), а также последовательности ДНК pHT43-aprN и Были проанализированы вставки pHT43-pro-aprN.Результаты показали, что последовательность ДНК клонированных генов идентична последовательности наттокиназы из штамма-предшественника B. subtilis YF038 (номер доступа GenBank AY219901), что подтверждает успешное создание конструкции.

Экспрессия наттокиназы и оценка фибринолитической активности

Поскольку клонированный ген находился под контролем lac-оперона, который индуцируется IPTG, индукцию экспрессии сконструированной наттокиназы оценивали путем добавления 0.1 мМ IPTG в среде трансформированных клеток B. subtilis WB800N. IPTG добавляли в ферментационный бульон, когда OD ₆₀₀ культуры достигала 0,6-0,8. Затем внеклеточный белок, продуцируемый при 30 ° C в течение 24 часов после индукции, собирали для SDS-PAGE и для анализа фибринолитической активности с использованием клеток B. subtilis WB800N, трансформированных пустым вектором pHT43 в качестве контроля.

Присутствие сконструированного протеина наттокиназы в супернатантах культур сначала было подтверждено анализом SDS-PAGE.Основная полоса белка примерно 28 кДа, аналогичная молекулярной массе наттокиназы из натто B. subtilis , наблюдалась в образцах pHT43-aprN и pHT43-pro-aprN, тогда как соответствующая полоса не наблюдалась в образцах pHT43 ( Рисунок 3), что свидетельствует о том, что как штаммы WB800N / pHT43-aprN, так и WB800N / pHT43-pro-aprN успешно экспрессируют наттокиназу.

Затем была определена фибринолитическая активность сконструированного протеина наттокиназы с помощью метода на основе фибриновой пластины.Образцы из клеток, экспрессирующих aprN, действительно проявляли какую-либо ферментативную активность, в то время как образцы из клеток, экспрессирующих про-aprN, демонстрировали высокую активность, что указывает на то, что штамм WB800N / pHT43-pro-aprN успешно экспрессировал активную наттокиназу (рис. 4). Очевидное различие в ферментативной активности наттокиназы, экспрессируемой штаммами WB800N / pHT43-aprN и WB800N / pHT43-pro-aprN, подтвердило, что лидерная пептидная последовательность наттокиназы может управлять правильной укладкой белка, чтобы способствовать нормальной ферментативной активности.

Влияние концентраций IPTG на активность наттокиназы

IPTG добавляли в колбу для ферментации, когда плотность клеток WB800N / pHT43-pro-aprN достигала 0,6-0,8 OD _600. Никакого влияния различных концентраций IPTG на рост клеток в течение первых 26 часов ферментации при 30 ° C не наблюдалось ( Рисунок 5а). Оценка ферментативной активности через 24 ч после индукции IPTG показала, что увеличение концентрации IPTG до 1.0 мМ улучшил выработку сконструированной наттокиназы, которая достигла пика на уровне 701,59 МЕ / мл при концентрации IPTG 1,0 мМ (рис. 5b). Эти данные аналогичны предыдущему отчету, в котором 1,0 мМ IPTG был признан оптимальным для индукции экспрессии рекомбинантных ферментов, таких как процедурен B и антимикробный пептид кателицидин-BF (Nandana et al., 2014). Дальнейшее увеличение концентрации IPTG до 1,6 мМ привело к снижению экспрессии NK до уровня 504,82 МЕ / мл (рис. 5b).

Это снижение выхода фермента при более высоких концентрациях IPTG может быть связано с метаболической нагрузкой, вызванной IPTG, как предполагалось ранее (Glick et al., 1995). Исследование супернатантов этих образцов с помощью полуколичественного SDS-PAGE дополнительно подтвердило, что оптимальная концентрация IPTG составляла 1,0 мМ (фиг. 5c).

Влияние температуры на активность наттокиназы

Выход NK из клеток WB800N / pHT43-pro-aprN исследовали в диапазоне различных температур инкубации от 18 до 40 ° C. Инженерная продукция наттокиназы при этих температурах находилась в диапазоне 46,78-848,52 МЕ / мл.Было обнаружено, что выход фермента возрастает с увеличением температуры инкубации, вплоть до максимальной продукции фермента (848,52 МЕ / мл), которая достигается при 37 ° C. Дальнейшее повышение температуры до 40 ° C снизило продукцию фермента до уровня 691,23 МЕ / мл (рис. 6а). Эти результаты согласуются с предыдущим выводом о том, что 37 ° C является оптимальной температурой для производства наттокиназы из B. subtilis WB800 (Nguyen et al., 2013). Кроме того, разные температуры оказывают значительное влияние на рост клеток, и в соответствии с этим было обнаружено, что клетки росли медленнее при температурах ниже 25 ° C (рис. 6b).

Кинетика продукции наттокиназы

Чтобы исследовать кинетику продукции NK в клетках WB800N / pHT43-pro-aprN, оценивали изменения активности NK в течение времени ферментации. Как показано на фиг. 7a, активность NK быстро увеличивалась со временем ферментации в течение первых 4 часов после индукции IPTG до выхода на плато в течение следующих 4 часов. Через 4 часа после индукции с концентрацией IPTG 1.0 мМ уровень экспрессии NK (количественно определяемый на основе активности фермента на единицу биомассы) достиг максимума 835,83 МЕ / мл. Внеклеточный белок из различных временных точек ферментации с помощью полуколичественного анализа SDS-PAGE, максимальная продукция NK в течение 4 часов после индукции дополнительно оценивалась (фигура 7b). Дальнейшее изучение данных кинетики показало, что продукция NK была связана с ростом клеток только в течение этих первых 4 часов после индукции, и как таковые эти культуры можно было собирать до перехода в стационарную фазу роста, при этом обеспечивая максимальную продукцию NK.

Влияние фазы роста во время индукции на активность наттокиназы

Чтобы проверить, оказывает ли фаза роста клеток во время индукции IPTG какое-либо влияние на сконструированную активность наттокиназы в клетках WB800N / pHT43-pro-aprN, индукцию IPTG проводили при различных плотностях клеток, отражающих разные фазы роста клеток. Первоначально 2% посевного раствора культуры инокулировали в свежую среду, а затем добавляли IPTG (1,0 мМ) при выбранной плотности клеток (0.2–1,8 OD ₆₀₀ ) с последующим измерением экспрессии фермента через 4 часа после индукции. Когда индукцию IPTG проводили от фазы с более низкой плотностью клеток к фазе с более высокой, экспрессия сконструированного белка увеличивалась, достигая максимальной индукции 835,39 МЕ / мл при OD 0,6 ₆₀₀ , после чего выход снижался (рис. 8). Это открытие указывает на то, что на ранней стадии логарифмической фазы роста клеток добавление IPTG может способствовать экспрессии NK, тогда как позже, в логарифмической фазе роста, индуцированная IPTG экспрессия постепенно снижается.Эти данные показали, что оптимальная фаза роста клеток для индукции IPTG экспрессии наттокиназы в этих сконструированных штаммах — это ранняя логарифмическая фаза клеточного роста, что согласуется с отчетом о продукции антимикробного пептида кателицидин-BF, экспрессированного в сконструированном B. subtilis. клеток WB800N (Luan et al., 2014).

Влияние pH среды на активность ферментов

Оптимальный pH для экспрессии наттокиназы в клетках WB800N / pHT43-pro-aprN был определен равным 7.5, и при этом pH активность фермента NK достигала максимума 839,17 МЕ / мл. Когда pH был меньше 6 или больше 9, плотность клеток и активность фермента NK резко снижались (Рисунок 9).

Выделение и очистка наттокиназы

По сравнению с супернатантом ферментации степень очистки наттокиназы достигала 6,63, а общее извлечение составляло 80% (таблица 2). Гетеропротеины в ферментационном бульоне сначала удаляли осаждением соли, а затем выделяли наттокиназу и очищали с помощью ультрафильтрации.Анализ SDS-PAGE показал, что молекулярная масса одной полосы составляет около 28 кДа. Очищенную наттокиназу определяли с помощью анализа на фибринолитической пластине, и результаты показали хорошую фибринолитическую активность. Таким образом, наттокиназу с высокой степенью извлечения можно получить с помощью осаждения соли и ультрафильтрации.

В этом исследовании с использованием новых праймеров были амплифицированы aprN и pro-aprN, кодирующие наттокиназу в Bacillus natto .Две сконструированные клеточные линии с использованием плазмидного вектора pHT43, который был экспрессирован в Bacillus subtilis , были сконструированы WB800N, что позволило нам оценить ферментативную активность и оптимизировать условия культивирования. Хотя лидерный пептид не является частью функционального домена белка NK и не вносит вклад в функцию белка, он вносит вклад в формирование активной трехмерной структуры (Jia et al., 2010). Ябута и др. (2001) изучили путь рефолдинга протеазы Е B. subtilis in vitro , продемонстрировав, что лидерный пептид сообщает правильную информацию о фолдинге для домена во время процесса фолдинга.Исследования также показали, что специфические взаимодействия между лидерным пептидом и доменом протеазы B. subtilis важны для сворачивания предшественника (Weng et al, 2009; Sone et al, 2005). Поскольку наттокиназа представляет собой сериновую протеазу, продуцируемую B. subtilis , эти исследования дополнительно проливают свет на укладку NK. В этом исследовании сконструированные штаммы, экспрессирующие последовательности лидерных пептидов NK, дали белок NK с высокой ферментативной активностью, в то время как сконструированные штаммы, экспрессирующие только зрелый пептид без лидерной последовательности, продуцировали неактивный белок NK, что согласуется с предыдущими исследованиями важности лидерных пептидов.

Man et al. (2018) сконструировали штамм B. subtilis MX-6, экспрессирующий наттокиназу, чтобы максимизировать продукцию наттокиназы через 72 часа после индукции ферментации, достигая диаметра прозрачной зоны на пластине без плазминогена фибрина 21,60 мм. Guan et al. (2016) сконструировали штамм B. subtilis , экспрессирующий наттокиназу, оптимизировав промотор гена, достигнув максимальной продукции наттокиназы через 36 часов после индукции ферментации. Несколько исследований показали, что производство наттокиназы может достигать максимума после 24 часов ферментации.В отличие от этих предыдущих исследований, в настоящем исследовании сконструированные бактериальные штаммы, которые мы получили, достигли максимальной продукции наттокиназы всего через 4 часа после индукции и начала ферментации с максимальной сырой ферментативной активностью до 848,52 МЕ / мл, что представляет собой явное улучшение эффективность индустриализации. Анализ на основе SDS-PAGE показал, что сконструированные нами штаммы также производят относительно низкие уровни гетеропротеинов, что снизит потребность в последующей очистке и, следовательно, снизит стоимость промышленного производства NK.Мы смогли определить, что оптимальные условия культивирования для продукции NK с этой бактериальной системой экспрессии были следующими: pH среды 7,5, индукция 1 ммоль / л IPTG в течение 4 часов и ферментация при 37 ° C, достигая максимального выхода активности неочищенного фермента. 848,52 МЕ / мл. Эти результаты показывают, что сверхэкспрессия вектора pHT43 может быть эффективной и полезной стратегией для продукции NK, в то время как штамм-хозяин WB800N демонстрирует высокую эффективность и высокую чистоту секреции NK.

В последующих экспериментах оптимизировали ферментационную среду инженерного штамма и выделенную и очищенную наттокиназу с помощью осаждения соли и ультрафильтрации.По сравнению с супернатантами ферментации степень очистки наттокиназы достигла 6,63 с общим извлечением 80% и удельной активностью фермента 11507,92 МЕ / мг. Таким образом, сконструированные штаммы, созданные в этом исследовании, имеют большие перспективы в качестве потенциальных штаммов, полезных для производства NK в промышленных масштабах. Дальнейшие усилия по оптимизации и улучшению производства NK продолжаются с целью дальнейшего повышения выхода белка и снижения затрат на промышленное производство наттокиназы.