Комплекс из: Комплекс из дерева 2.6 Ecoplay

Содержание

Комплекс из турников с лавками для пресса Romana 501.11.01

Габаритные размеры, мм:
Длина (L)    5460
Ширина (B)    3370
Высота (H)    2706
Возраст пользователей    от 14 лет
Нагрузка на комплекс, кг, не более    500
Количество одновременно занимающихся, не более    4
Срок службы, (не менее).    5 лет

Вес: 305 кг.

Спортивное оборудование входит в комплекс «Воркаут», наряду с другими спортивными элементами устанавливается на территориях игровых зон, зон отдыха, спортивных площадках для пользователей от 14 лет. Предназначено для доступных занятий физической культурой на свежем воздухе. Изделия могут эксплуатироваться круглогодично.

Комплектация:

- стойки комплекса должны быть изготовлены из стальной трубы диаметром не менее 108 мм с толщиной стенки не менее 4 мм.  Стойки разновысотные – 10 шт;
- перекладины должны быть изготовлены из металлической трубы диаметром не менее 34 мм с толщиной трубы не менее 5 мм. С двух сторон труба обжата до диаметра 33,5 мм, на длину 39 мм. Перекладина – 9 шт;
- шведская стенка должна быть изготовлена из металлических труб размерами не Ø33,5*2,8. Габаритные размеры должны быть не менее 2134*1389 мм. Шведская стенка – 1 шт;

- скамья для пресса - длиной не менее 1850 мм, не более 1860 мм и шириной не менее 300 мм не более 350 мм должна быть изготовлена из фанеры ФОФ с высокой влаго- и износостойкостью, с антискользящим покрытием толщиной не менее 30 мм. Скамья – 2 шт;
- все встраиваемое оборудование должно крепиться к стойкам при помощи алюминиевых хомутов (обойм) с отверстиями для перекладин, с возможностью их фиксации от поворота и прочной фиксацией на вертикальном опорном столбе, которые закрепляются на стойке посредством резьбового соединения. Обойма – 22 шт;
- металлические детали должны быть окрашены полимерной порошковой эмалью методом запекания в заводских условиях;
- выступающие крепежные элементы должны быть закрыты антивандальными декоративными заглушками из полиэтилена;
- торцы труб должны быть закрыты антивандальными эллиптическими заглушками диаметром 108 мм;
- все крепежные элементы должны быть оцинкованы.

Изделие устанавливается на открытых уличных участках, находящихся под контролем ответственного лица – эксплуатанта. Установка должна проводится на ровной площадке, свободной от насаждений. Размер площадки не менее 8500*7100 мм. Над зоной безопасности, должно быть свободное пространство на высоту 5,3 метра, т.е над ней не должно быть ни веток, ни элементов других конструкций.

Пока не было вопросов.

Двухкомпонентный комплекс из маски и патчей " Смягчение и восстановление ", 1 шт

Шаг 1: Фольгированные патчи «Золото» Патчи с кофеином мгновенно смягчают и увлажняют нежную кожу вокруг глаз. Благодаря технологии «Термотерапия» эффективно борются с отеками, темными кругами и осветляют кожу. Шаг 2: Ампульная маска «Смягчение и восстановление» на тканевой основе Маска богата антиоксидантами, смягчает и восстанавливает кожу, борется с первыми признаками старения. Ионы золота способствуют увеличению эластичности, уменьшают видимость морщин и придают сияние. Интенсивная ампульная маска наполнена антиоксидантами, которые глубоко увлажняют и оживляют даже самую сухую и тусклую кожу.

Шаг 1: Фольгированные патчи «Золото» Water(Eau), Glycerin, Butylene Glycol, 1,2-Hexanediol, Hydroxyacetophenone, Hydroxyethylcellulose, Arginine, Carbomer, Chlorphenesin, Trehalose, Allantoin, Dipropylene Glycol, Dipotassium Glycyrrhizate, Disodium EDTA, Polyglyceryl-10 Laurate, Polyglyceryl-10 Myristate, Sodium Hyaluronate, Lavandula Angustifolia (Lavender) Oil, Panthenol, Glutathione, Coffea Arabica (Coffee) Seed Extract, Salvia Officinalis (Sage) Leaf Extract, Ethylhexylglycerin, Acetyl Hexapeptide-8, Gold.

Шаг 2: Ампульная маска «Смягчение и восстановление» на тканевой основе Water(Eau), Dipropylene Glycol, Propanediol, Glycerin, 1,2-Hexanediol, Arginine, Hydroxyacetophenone, Acrylates/c10-30 alkyl acrylate crosspolymer, Carbomer, Chlorphenesin, Trehalose, Allantoin, Disodium EDTA, Dipotassium Glycyrrhizate, Polyglyceryl-10 Laurate, Polyglyceryl-10 Myristate, Lavandula Angustifolia (Lavender) Oil, Butylene Glycol, Sodium Hyaluronate, Calendula Officinalis Flower Extract, Coptis Japonica Root Extract, Gold.

Шаг 1: Фольгированные патчи «Золото» Наложите патчи на чистую кожу зоны под глазами.

Шаг 2: Ампульная маска «Смягчение и восстановление» на тканевой основе Сразу же после патчей наложите маску. Держите 15-20 минут. Снимите маску и патчи, распределите остатки сыворотки по лицу массажными движениями. Не смывайте.

Игровой комплекс из дерева"Baby - 6"

Комплектация:

  • Игровой домик с крышей и балдахином;
  • Горка пластиковая 1.18 м;
  • Альпинистская стенка с канатом;
  • Сетка-лазалка;
  • Турник металлический;
  • Кольца гимнастические;
  • Шведская стенка;
  • Качели;
  • Бинокль;
  • Штурвал пластиковый;

Основным преимуществом наших комплексов, кроме безопасности, долговечности и красоты, является его функциональность. Он способен обеспечивающие физическое развитие ребенка, ловкость, смелость, развитие координации движений, преодоление страха высоты и умение дружить в коллективных играх.

  Трансформация комплекса безгранична. В один момент комплекс может превратится из зоны активных игр в уютный домик, из уютного домика в пиратский корабль и из корабля в уютное спальное месте для отдыха от активных игр. Благодаря высокой платформе под комплексом-кроватью Савушка Baby спокойно размещаются ящики с любимыми игрушками.

     Материал: Каркас изделия, ограждение и иные элементы изготовлены из массива  сосны. Все детали качественно шлифованы. 

   

Покрытие: Окраска производится ЛКМ на водной основе производства Германия, с наличием сертификата, который разрешает применение для покрытия детских игровых площадок, и имеет знак "Голубого ангела". 


Цвет игрового комплекса можно выбать самим. Для этог надо запросить палитру цвета у нашего менеджера.

    
   Габариты: 
Длинна комплекса 2,370 м.
Глубина с горкой 2.0 м; 
Высота с крышей 2,00 м; 
Высота платформы 0,6м; 
Длина горки 1,18 м. 

   Вес: общий вес 125 кг (+/- 5кг). 

   Описание: Товар упакован в гофрокартонные короба: 5 мест + горка. Вес горки 1,95 кг.
Товар поставляется в разобранном виде. Прилагается подробная инструкция по сборке. Матрас в стоимость и комплект поставки не входит. 

Изделие может эксплуатироваться круглогодично как в помещениях, так и на улице при окружающей температуре воздуха от -30°С до + 40°С и относительной влажности воздуха не более 90% При эксплуатации на улице, с целью обеспечения наиболее длительного срока его службы, игровой комплекс  рекомендуется обработать защитным покрытием. В качестве покрытия рекомендуется использовать защитные материалы на водной основе (масла, грунты-пропитки, лаки и т.п.)  

 

Открытые данные

Дом культуры ст. Анапской МБУК «Анапская централизованная клубная система» муниципального образования город-курорт Анапа
Адрес:  353431, Краснодарский край, Анапский район, станица Анапская, ул. Школьная, 62
Телефоны:  (86133)7-17-74
Время работы:  Понедельник – пятница с 8.30 до 21.30. Суббота, воскресенье с 10.00-22.00

ЗАО
Адрес:  353425, Краснодарский край, г. Анапа, с. Юровка, ул. Октябрьская, 1
Телефоны:  (86133)9-51-17

ООО
Адрес:  юридический: г. Анапа, Анапское шоссе, 1г; почтовый: 353440, г. Анапа, ул. Крымская, 218

Телефоны:  (86133)5-43-36

ООО
Адрес:  353440, г. Анапа, ул. Астраханская, 71
Телефоны:  (86133)5-43-36

Муниципальное бюджетное учреждение «Ремстрой» муниципального образования город-курорт Анапа
Адрес:  юридический: 353440, Краснодарский край, г. Анапа, ул. Шевченко, 286; почтовый: 353440, Краснодарский край, г. Анапа, ул. Промышленная, 9.
Телефоны:  (86133)90281

Анапский район РЭС филиала ОАО
Адрес:  353440 Россия, Краснодарский край, г. Анапа, пер. Строительный, 5
Телефоны:  (86133)5-43-28, диспетчер: (86133)5-42-22

Филиал АО "НЭСК" "Анапаэнергосбыт"
Адрес:  юридический: 350033, Краснодарский край, г. Краснодар, пер. Переправный, д.13, офис 101; почтовый: 353440, Краснодарский край, г. Анапа, пер. Успенский, д.15а
Телефоны:  (86133) 9-66-98


Филиал №18 АО "Газпром газораспределение Краснодар"
Адрес:  353440 Краснодарский край, г. Анапа, ул. Чехова, 2
Телефоны:  (86133) 3-79-59

ООО «Анапагаз»
Адрес:  353440 Россия, Краснодарский край, г. Анапа, ул.Парковая, 66
Телефоны:  (86133)4-04-34

АО «Теплоэнерго»
Адрес:  353440 Россия, Краснодарский край, г. Анапа, ул. Парковая, 58а
Телефоны:  (86133)4-30-75

АО «Анапа Водоканал»
Адрес:  353454, Краснодарский край, г. Анапа, ул. Ленина, 125
Телефоны:  (86133)4-50-47

ООО "Сити Кристалл"
Адрес:  юридический: 353430, Краснодарский край, г. Анапа, ст.Анапская, ул.Набережная ,148; почтовый: 353440, Краснодарский край, г. Анапа, ул. Крымская, 218
Телефоны:  (86133)4-35-08


ООО "Альтернативные коммунальные системы"
Адрес:  юридический: 353440, Краснодарский край, г. Анапа, ул. Краснодарская, 19; почтовый: 353440, Краснодарский край, г. Анапа, ул. Ленина, 129
Телефоны:  (86133)3-26-28

ООО ЖКХ "Абсолют"
Адрес:  353411, Краснодарский край, г. Анапа, с.Супсех, ул.Советская, 55
Телефоны:  (86133)2-96-34

ООО "Коммунальщик - Витязево"
Адрес:  353417, Краснодарский край, город-курорт Анапа, п. Витязево,пер.Морской, 3
Телефоны:  (86133)7-38-17

ООО "Югсервис"
Адрес:  353430, Краснодарский край, г. Анапа, п. Виноградный, ул.Садовая, 9
Телефоны:  (86133)9-61-84

ООО "Экрон-Анапа"
Адрес:  Юридический адрес: г. Анапа, ул. Ленина, 167, кв. 29; почтовый адрес: 353430, Анапский район, станица Анапская, ул. Комсомольская, 75


Телефоны:  (918)6673605

ООО ЖКХ "Джигинка"
Адрес:  юридический: 353424, Краснодарский край, г. Анапа, с. Джигинка, ул.Октябрьская , 31/4; почтовый: 353424, Краснодарский край, г. Анапа, с. Джигинка, ул. Центральная, 8
Телефоны:  (86133)7-63-07

ООО ЖКХ "Приморское"
Адрес:  353421, Краснодарский край, г. Анапа, п.Цибанобалка, пер.Штабной, 5
Телефоны:  (86133)2-31-40

ОАО "Коммунальщик"
Адрес:  353440, Краснодарский край, город-курорт Анапа, ул.Ленина,141
Телефоны:  (86133)4-28-78, 4-02-90, телефон аварийной службы (круглосуточный) - (86133)4-09-58
Время работы:  понедельник, вторник, среда, четверг - с 08:00 до 17:00 (перерыв с 12:00 до 13:00), пятница - с 08:00 до 16:00


Новости 1 - 20 из 24
Начало | Пред. |
1
2 | След. | Конец

"Жить в раю", комплекс из 5 городских вилл

Все 5 вилл, возведенных в Баден-Бадене, полностью оснащены системой теплоизоляции, к которой, равно как и к звукоизоляционной системе, предъявлены повышенные требования. Проблема устранения мостиков холода стояла особенно остро из-за наличия в проекте множества фасадных выступов и архитектурных деталей.

История

Строительный проект возник в результате выигранного тендера Ideal & Vogel Projektbau GmbH в  конкурсе инвесторов города Баден-Баден. Основным отличием от проектов других конкурсантов было оригинальное техническое решение: провести параллельную улицу для получения доступа к  домам, расположенным в самом низу склона. Эта идея оказала существенное влияние на общую архитектурную картину всего района.

Гордо смотрят ввысь 5 городских вилл; подобные постройки приютились на так называемом Возвышении Фридриха, а в самом сердце района перед нашим взором предстает "Каскад фонтанов". Традиционную  архитектуру виллы можно наблюдать вдоль Бернардштрассе и улицы принца Веймара с ее аллеями, усаженными  длинными молчаливыми линиями деревьев по краям.

Расположены дома тоже согласно их величины, по определенной системе. Таким образом, первый дом является наименьшим, и размер домов возрастает по направлению к горному замку. Территории у входа на виллы великолепно оформлены по всем канонам зодчества. Это поистине захватывающее зрелище: дома, расположенные вдоль Бернардштрассе, с характерными фасадами из песчаника.

Дома, построенные в конце улицы, отличаются тем, что они как бы развернуты в противоположную сторону, и таким образом открывается вид на долину.

5 городских вилл, в частности, каждая отдельная квартира,  имеют такую планировку, что из них открывается неповторимый, уникальный вид на историческую область старой части города, в том числе на замок.

Вид из домов на город, а также, наоборот, из города на дома, дает в итоге четкое представление об архитектуре Баден-Бадена, выдающиеся ансамбли которой в сочетании с захватывающими дух пейзажами представляют собой единое целое, создающее то самое впечатление неповторимости и непостижимости Баден-Бадена.

Сложное определение и значение | Словарь английского языка Коллинза

Примеры "сложный" в предложении

комплекс

Эти примеры были выбраны автоматически и могут содержать конфиденциальный контент. Подробнее… Комплекс включает восемь зданий, окруженных крепостной стеной.

Smithsonian Mag (2017)

Она продемонстрировала свою готовность вмешаться, объявив о пересмотре сложной системы железнодорожных билетов.

Times, Sunday Times (2016)

Жители имеют доступ к развлекательному комплексу.

Times, Sunday Times (2016)

Это вызвало у меня что-то вроде комплекса неполноценности.

Times, Sunday Times (2016)

Предполагаемый объект по обогащению урана строится в рамках более крупного исследовательского комплекса.

Times, Sunday Times (2016)

Это может быть очень сложная система.

Smithsonian Mag (2017)

Этот комплекс зданий и маршрутов через ландшафт превращает короткое путешествие в космос в путешествие в глубокое время.

Times, Sunday Times (2017)

Но помогает и то, что 200-миллионный тренировочный комплекс удобнее любого отеля.

The Sun (2016)

Но это намного сложнее, и спонсорство - лишь часть целого.

Times, Sunday Times (2016)

На проработку сделок может уйти от трех до четырех лет, а для сложных - до десяти лет.

Солнце (2017)

Подробнее ...

Почему кто-то подумал, что строительство чего-то такого сложного и трудного было хорошей инвестицией?

Times, Sunday Times (2011)

В учебном комплексе также есть кинотеатр.

Солнце (2014)

Они могут годами жить в одном доме или жилом комплексе и не знать своих соседей.

Христианство сегодня (2000)

Результатом стала чрезвычайно сложная налоговая система, полная лазеек.

Times, Sunday Times (2014)

Этот комплекс должен образоваться на месте повреждения.

Lashford, Stephanie The Residue Report - план действий по обеспечению более безопасной пищи (1988)

Он позволяет нашему организму лучше получать доступ к калориям, заключенным в сложных органических молекулах.

Times, Sunday Times (2012)

Эта фобия - самый яркий цветок моего комплекса неполноценности.

Times, Sunday Times (2014)

Некоторые развлекательные комплексы уже показали путь, по которому можно идти.

Редвуд, Джон Глобальный рынок (1993)

Однако картина гораздо сложнее.

Times, Sunday Times (2014)

Тем не менее регулирующие органы в других странах могут не захотеть брать на себя такие крупные и сложные банки.

Times, Sunday Times (2011)

Мы можем перестать поддерживать менталитет жертвы, преодолев наш комплекс вины.

Times, Sunday Times (2006)

В вашей стране не было бы военно-промышленного комплекса.

Times, Sunday Times (2012)

Этот лот уже мог говорить на жаргоне достаточно, чтобы понимать почти наверняка сложные комедийные предложения.

Times, Sunday Times (2007)

Новые средства массовой информации ставят сложные вопросы права.

Times, Sunday Times (2011) У

PA и секретарей сегодня сложные и ответственные роли.

Times, Sunday Times (2006)

То, что мы считаем личностью, является сложным продуктом всех этих сил.

Bee, Helen The Growing Child (7-е изд.) (1995)

Ищете тихое время в хорошо оборудованном многонациональном жилом комплексе?

Times, Sunday Times (2012)

Но система сложнее, чем кажется.

Пчелка, Хелен - Развивающийся ребенок (7-е изд.) (1995)

Это сложные эмоциональные пьесы, сыгранные с ослепительной техникой.

The Sun (2008)

Инвесторы возражают, что некоторые компании прячутся за консультантами по заработной плате, которые используют сложные формулы и дополнительные льготы, чтобы скрыть количество денег, идущих руководителям.

Times, Sunday Times (2012)

Что такое комплекс неполноценности? Симптомы, причины, диагностика и лечение

Исследования показывают, что поведенческие и психологические характеристики, связанные с комплексом неполноценности, возникают из-за комбинации факторов, в том числе:

Генетическая предрасположенность Например, исследование в Proceedings of the National Академия наук обнаружила, что люди, унаследовавшие вариацию рецептора окситоцина, гормона, который способствует положительным эмоциям, чувствовали себя менее оптимистично, имели более низкую самооценку и чувствовали меньшее личное мастерство, чем люди, унаследовавшие другой тип рецептора для окситоцин.(5)

Семья происхождения По словам Мэддукса, десятилетиями изучавшего самооценку, ваши опекуны в раннем возрасте могут оказать огромное влияние на то, будет ли генетическая склонность к неуверенности в себе «обостряться» или «смягчаться». Ребенок, чей крайне критичный родитель постоянно повторяет такие вещи, как «ты глупый», «ты глупец» или «ты никогда ничего не делаешь правильно», может усвоить эти наставления настолько полно, что они переносят их во взрослую жизнь.

«Когда вы очень молоды и впечатлительны и сталкиваетесь с постоянной критикой, вы большую часть времени чувствуете себя бессильным, никчемным, стыдливым, застенчивым и лишенным энтузиазма», - объясняет психолог Элейн Н.Арон, доктор философии, автор книги Недооцененная личность . «Чувствуя, что во всем виновата ваша вина, вы хронически недооцениваете себя».

Общество Нереалистичные стандарты, исходящие от рекламодателей, социальных сетей, знаменитостей и других авторитетных фигур, могут создавать или укреплять представления о себе, которые приводят к огромной неуверенности в себе. «Когда общество засыпает нас сообщениями о том, как мы должны действовать, что мы должны приобрести, а также о том, какого типа, размера и цвета должны быть наши тела, мы усваиваем и чувствуем себя униженными до такой степени, что это влияет на нашу собственную оценку того, кто мы есть и какова наша реальная ценность », - говорит Карен Шапиро, лицензированный клинический социальный работник и психотерапевт, практикующий в частной практике в Нью-Йорке.

«Люди с очень низкой самооценкой склонны больше сравнивать себя с другими, - отмечает Флауэрс. - И когда они сравнивают себя, они сравнивают себя только с самыми успешными людьми».

Узнать больше о причинах комплекса неполноценности

Неканонический комплекс SWI / SNF является синтетической летальной мишенью для рака, вызванного возмущением комплекса BAF

  • 1.

    Narlikar, GeetaJ., Sundaramoorthy, R. & Оуэн-Хьюз, Т. Механизмы и функции АТФ-зависимых ферментов ремоделирования хроматина. Cell 154 , 490–503 (2013).

    CAS Статья Google ученый

  • 2.

    Clapier, C. R. & Cairns, B.R. Биология комплексов ремоделирования хроматина. Annu. Rev. Biochem. 78 , 273–304 (2009).

    CAS Статья Google ученый

  • 3.

    Ho, L. et al. Комплекс ремоделирования хроматина эмбриональных стволовых клеток, esBAF, необходим для самообновления и плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток. Proc. Natl Acad. Sci. США 106 , 5181–5186 (2009).

    CAS Статья Google ученый

  • 4.

    Lessard, J. et al. Существенный переключатель в субъединичном составе комплекса ремоделирования хроматина во время нервного развития. Нейрон 55 , 201–215 (2007).

    CAS Статья Google ученый

  • 5.

    Ликерт, Х.и другие. Baf60c необходим для функционирования комплексов ремоделирования хроматина BAF в развитии сердца. Nature 432 , 107–112 (2004).

    CAS Статья Google ученый

  • 6.

    Priam, P. et al. Субъединица SMARCD2 комплексов SWI / SNF, ремоделирующих хроматин, опосредует гранулопоэз посредством механизма, зависимого от CEBPε. Nat. Genet. 49 , 753–764 (2017).

    CAS Статья Google ученый

  • 7.

    Witzel, M. et al. Фактор ремоделирования хроматина SMARCD2 регулирует транскрипционные сети, контролирующие дифференцировку нейтрофильных гранулоцитов. Nat. Genet. 49 , 742–752 (2017).

    CAS Статья Google ученый

  • 8.

    Staahl, B.T. et al. Кинетический анализ переключения npBAF на nBAF показывает обмен SS18 с CREST и интеграцию с путями нервного развития. J. Neurosci. 33 , 10348–10361 (2013).

    CAS Статья Google ученый

  • 9.

    Ю, А. С., Стал, Б. Т., Чен, Л. и Крэбтри, Г. Р. МикроРНК-опосредованное переключение комплексов ремоделирования хроматина в нервном развитии. Nature 460 , 642–646 (2009).

    CAS Статья Google ученый

  • 10.

    Yoo, A. S. et al. МикроРНК-опосредованное преобразование человеческих фибробластов в нейроны. Nature 476 , 228–231 (2011).

    CAS Статья Google ученый

  • 11.

    Pedersen, T. A., Kowenz-Leutz, E., Leutz, A. & Nerlov, C. Для дифференциации адипоцитов требуется взаимодействие между доменами рекрутинга C / EBPα TBP / TFIIB и SWI / SNF. Genes Dev . 15 , 3208–3216 (2001).

    CAS Статья Google ученый

  • 12.

    Pan, J. et al. Исследование структуры, функции и принадлежности белкового комплекса млекопитающих с использованием фитнес-экранов в масштабе генома. Cell Syst. 6 , 555–568 (2018).

    CAS Статья Google ученый

  • 13.

    Alpsoy, A. & Dykhuizen, E.C. Ген 1 кандидатной области опухолевого супрессора глиомы ( GLTSCR1 ) и его паралог GLTSCR1-подобный образуют подкомплексы ремоделирования хроматина SWI / SNF. J. Biol. Chem . 293 , 3892–3903 (2018).

    CAS Статья Google ученый

  • 14.

    Wang, W. et al. Разнообразие и специализация комплексов SWI / SNF млекопитающих. Genes Dev. 10 , 2117–2130 (1996).

    CAS Статья Google ученый

  • 15.

    Kaeser, M. D., Aslanian, A., Dong, M. Q., Yates, J. R. 3rd & Emerson, B.M. BRD7, новая PBAF-специфическая субъединица SWI / SNF, необходима для активации и репрессии целевого гена в эмбриональных стволовых клетках. J. Biol. Chem. 283 , 32254–32263 (2008).

    CAS Статья Google ученый

  • 16.

    Kadoch, C. et al. Протеомный и биоинформатический анализ комплексов SWI / SNF млекопитающих позволяет определить значительную роль в злокачественных новообразованиях человека. Nat. Genet. 45 , 592–601 (2013).

    CAS Статья Google ученый

  • 17.

    Шайн А. Х. и Поллак Дж. Р. Спектр мутаций SWI / SNF, повсеместно распространенных при раке человека. PLoS ONE 8 , e55119 (2013).

    Артикул Google ученый

  • 18.

    Biegel, J. A. et al. Зародышевые и приобретенные мутации INI1 при атипичных тератоидных и рабдоидных опухолях. Cancer Res. 59 , 74–79 (1999).

    CAS PubMed Google ученый

  • 19.

    Итон, К. В., Тук, Л. С., Уэйнрайт, Л. М., Джудкинс, А. Р. и Бигель, Дж. А. Спектр мутаций SMARCB1 / INI1 в семейных и спорадических рабдоидных опухолях. Pediatr. Рак крови 56 , 7–15 (2011).

    Артикул Google ученый

  • 20.

    Versteege, I.и другие. Усекающие мутации hSNF5 / INI1 при агрессивном детском раке. Nature 394 , 203–206 (1998).

    CAS Статья Google ученый

  • 21.

    Jones, S. et al. Частые мутации гена ремоделирования хроматина ARID1A при светлоклеточном раке яичников. Наука 330 , 228–231 (2010).

    CAS Статья Google ученый

  • 22.

    Varela, I. et al. Секвенирование экзома выявляет частую мутацию гена PBRM1 комплекса SWI / SNF при карциноме почек. Nature 469 , 539–542 (2011).

    CAS Статья Google ученый

  • 23.

    McBride, M. J. et al. Онкопротеин слияния SS18-SSX нарушает нацеливание и функцию комплекса BAF, управляя синовиальной саркомой. Cancer Cell 33 , 1128–1141 (2018).

    CAS Статья Google ученый

  • 24.

    Helming, K. C. et al. ARID1B представляет собой специфическую уязвимость при раке с мутантным ARID1A. Nat. Med. 20 , 251–254 (2014).

    CAS Статья Google ученый

  • 25.

    Hoffman, G.R. et al. Функциональный подход к эпигенетике определяет BRM / SMARCA2 как критическую синтетическую летальную мишень для рака с дефицитом BRG1. Proc. Natl Acad. Sci. США 111 , 3128–3133 (2014).

    CAS Статья Google ученый

  • 26.

    Мейерс, Р. М. и др. Вычислительная коррекция эффекта числа копий улучшает специфичность скрининга существенности CRISPR – Cas9 в раковых клетках. Nat. Genet. 49 , 1779–1784 (2017).

    CAS Статья Google ученый

  • 27.

    Черняк А. и др. Составление карты зависимости от рака. Cell 170 , 564–576 (2017).

    CAS Статья Google ученый

  • 28.

    Wang, T. et al. Профилирование эссенциальности генов выявляет генные сети и синтетические летальные взаимодействия с онкогенными Ras. Cell 168 , 890–903 (2017).

    CAS Статья Google ученый

  • 29.

    McDonald, E.R. 3rd et al. Project DRIVE: сборник зависимостей от рака и синтетических летальных отношений, выявленных в результате широкомасштабного глубокого скрининга РНКи. Cell 170 , 577–592 (2017).

    CAS Статья Google ученый

  • 30.

    Cowley, G. S. et al. Параллельные скрины потери функций в масштабе генома в 216 линиях раковых клеток для выявления контекстно-специфических генетических зависимостей. Sci. Данные 1 , 140035 (2014).

    CAS Статья Google ученый

  • 31.

    Bell, A.C. & Felsenfeld, G. Метилирование CTCF-зависимой границы контролирует импринтированную экспрессию гена Igf2 . Nature 405 , 482–485 (2000).

    CAS Статья Google ученый

  • 32.

    Bell, A.C., West, A.G. и Felsenfeld, G. Белок CTCF необходим для энхансер-блокирующей активности инсуляторов позвоночных. Cell 98 , 387–396 (1999).

    CAS Статья Google ученый

  • 33.

    Hark, A. T. et al.CTCF опосредует чувствительную к метилированию активность по блокированию энхансеров в локусе h29 / Igf2. Nature 405 , 486–489 (2000).

    CAS Статья Google ученый

  • 34.

    Kanduri, C. et al. Функциональная ассоциация CTCF с инсулятором выше гена h29 является родительским элементом, специфичным для происхождения и чувствительным к метилированию. Curr. Биол. 10 , 853–856 (2000).

    CAS Статья Google ученый

  • 35.

    Alver, B.H. et al. Комплекс ремоделирования хроматина SWI / SNF необходим для поддержания клон-специфичных энхансеров. Nat. Commun. 8 , 14648 (2017).

    Артикул Google ученый

  • 36.

    Mathur, R. et al. Утрата ARID1A нарушает опосредованную энхансером регуляцию генов и вызывает рак толстой кишки у мышей. Nat. Genet. 49 , 296–302 (2017).

    CAS Статья Google ученый

  • 37.

    Wang, X. et al. SMARCB1-опосредованная функция комплекса SWI / SNF важна для регуляции энхансера. Nat. Genet. 49 , 289–295 (2017).

    CAS Статья Google ученый

  • 38.

    Nakayama, R.T. et al. SMARCB1 необходим для широко распространенной опосредуемой комплексом BAF активации энхансеров и двухвалентных промоторов. Nat. Genet. 49 , 1613–1623 (2017).

    CAS Статья Google ученый

  • 39.

    Кадоч, К. и Крэбтри, Г. Р. Обратимое разрушение комплексов mSWI / SNF (BAF) онкогенным слиянием SS18-SSX в синовиальной саркоме. Cell 153 , 71–85 (2013).

    CAS Статья Google ученый

  • 40.

    Clark, J. et al. Идентификация новых генов SYT и SSX, участвующих в транслокации t (X; 18) (p11.2; q11.2), обнаруженной в синовиальной саркоме человека. Nat. Genet. 7 , 502–508 (1994).

    CAS Статья Google ученый

  • 41.

    Hohmann, A. F. et al. Чувствительность и инженерная устойчивость клеток миелоидного лейкоза к ингибированию BRD9. Nat. Chem. Биол. 12 , 672–679 (2016).

    CAS Статья Google ученый

  • 42.

    Martin, L.J. et al. Конструирование на основе структуры активного селективного ингибитора BRD9 in vivo. Дж.Med. Chem. 59 , 4462–4475 (2016).

    CAS Статья Google ученый

  • 43.

    Remillard, D. et al. Расщепление фактора BRD9 комплекса BAF гетеробифункциональными лигандами. Angew. Chem. Int. Эд. 56 , 5738–5743 (2017).

    CAS Статья Google ученый

  • 44.

    Wang, X. et al. Онкогенез, вызванный потерей опухолевого супрессора SNF5, зависит от активности BRG1, АТФазы комплекса ремоделирования хроматина SWI / SNF. Cancer Res. 69 , 8094–8101 (2009).

    CAS Статья Google ученый

  • 45.

    Chun, H.J. et al. Полногеномные профили экстракраниальных злокачественных рабдоидных опухолей выявляют гетерогенность и нарушение регуляции путей развития. Cancer Cell 29 , 394–406 (2016).

    CAS Статья Google ученый

  • 46.

    Теодулу, Н.H. et al. Открытие I-BRD9, селективного клеточно-активного химического зонда для ингибирования бромодомена, содержащего белок 9. J. Med. Chem. 59 , 1425–1439 (2016).

    CAS Статья Google ученый

  • 47.

    Coatham, M. et al. Параллельная инактивация ARID1A и ARID1B в дедифференцированных карциномах эндометрия и яичников. Мод. Патол. 29 , 1586–1593 (2016).

    CAS Статья Google ученый

  • 48.

    Tauziede-Espariat, A. et al. Потеря экспрессии SMARCE1 является специфическим диагностическим маркером светлоклеточной менингиомы: комплексный иммунофенотипический и молекулярный анализ. Brain Pathol. 2 , 466–474 (2017).

    Артикул Google ученый

  • 49.

    Naka, N. et al. Синовиальная саркома - это злокачественная опухоль стволовых клеток. Стволовые клетки 28 , 1119–1131 (2010).

    CAS Google ученый

  • 50.

    Munoz, D. M. et al. Скрины CRISPR обеспечивают всестороннюю оценку уязвимости рака, но генерируют ложноположительные совпадения для сильно амплифицированных областей генома. Рак Discov. 6 , 900–913 (2016).

    CAS Статья Google ученый

  • 51.

    Mashtalir, N. et al. Аутодеубиквитинирование защищает опухолевый супрессор BAP1 от цитоплазматической секвестрации, опосредованной атипичной убиквитинлигазой UBE2O. Mol. Ячейка 54 , 392–406 (2014).

    CAS Статья Google ученый

  • 52.

    Langmead, B. & Salzberg, S. L. Быстрое выравнивание по пробелам и считыванию с Bowtie 2. Nat. Методы 9 , 357–359 (2012).

    CAS Статья Google ученый

  • 53.

    Zhang, Y. et al. Модельный анализ ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 , R137 (2008).

    Артикул Google ученый

  • 54.

    Zhu, L.J. et al. ChIPpeakAnno: пакет Bioconductor для аннотирования данных ChIP-seq и ChIP-chip. BMC Bioinform. 11 , 237 (2010).

    Артикул Google ученый

  • 55.

    Дейл, Р. К., Педерсен, Б. С. и Куинлан, А. Р. Pybedtools: гибкая библиотека Python для управления наборами геномных данных и аннотациями. Биоинформатика 27 , 3423–3424 (2011).

    CAS Статья Google ученый

  • 56.

    Liao, Y., Smyth, G. K. & Shi, W. Средство выравнивания Subread: быстрое, точное и масштабируемое отображение чтения методом seed-and-voice. Nucleic Acids Res. 41 , e108 (2013).

    Артикул Google ученый

  • 57.

    Loven, J. et al. Селективное ингибирование опухолевых онкогенов за счет разрушения суперэнхансеров. Cell 153 , 320–334 (2013).

    CAS Статья Google ученый

  • 58.

    Whyte, W. A. ​​et al. Основные факторы транскрипции и медиатор создают суперэнхансеры в ключевых генах клеточной идентичности. Cell 153 , 307–319 (2013).

    CAS Статья Google ученый

  • 59.

    Андерс, С., Пил, П. Т. и Хубер, В.HTSeq - фреймворк Python для работы с высокопроизводительными данными секвенирования. Биоинформатика 31 , 166–169 (2015).

    CAS Статья Google ученый

  • 60.

    McLean, C. Y. et al. GREAT улучшает функциональную интерпретацию регулирующих областей цис . Nat. Biotechnol. 28 , 495–501 (2010).

    CAS Статья Google ученый

  • 61.

    Machanick, P. & Bailey, T. L. MEME-ChIP: анализ мотивов больших наборов данных ДНК. Биоинформатика 27 , 1696–1697 (2011).

    CAS Статья Google ученый

  • 62.

    Dobin, A. et al. STAR: сверхбыстрый универсальный выравниватель RNA-seq. Биоинформатика 29 , 15–21 (2013).

    Артикул Google ученый

  • 63.

    Фенг, Дж.и другие. GFOLD: обобщенное кратное изменение для ранжирования дифференциально экспрессируемых генов по данным RNA-seq. Биоинформатика 28 , 2782–2788 (2012).

    CAS Статья Google ученый

  • 64.

    Рамирес, Ф., Дандар, Ф., Диль, С., Грунинг, Б. А. и Манке, Т. DeepTools: гибкая платформа для исследования данных глубокого секвенирования. Nucleic Acids Res. 42 , W187 – W191 (2014).

    CAS Статья Google ученый

  • 65.

    Subramanian, A. et al. Анализ обогащения набора генов: основанный на знаниях подход к интерпретации профилей экспрессии в масштабе всего генома. Proc. Natl Acad. Sci. США 102 , 15545–15550 (2005).

    CAS Статья Google ученый

  • 66.

    Tripathi, S. et al. Мета- и ортогональная интеграция данных «OMICs» гриппа определяет роль UBR4 в почковании вируса. Клеточный микроб-хозяин 18 , 723–735 (2015).

    CAS Статья Google ученый

  • Границы | Структура и динамика антигенных пептидов в комплексе с ТАП

    Введение

    Нашему человеческому организму постоянно угрожают миллиарды потенциальных патогенов, например, бактерии, вирусы, грибки и паразиты. Таким образом, возникла многослойная защита для защиты позвоночных от этих патогенов с помощью сложных механизмов. Физические и химические барьеры, такие как кожа или желудочный сок, являются первичными, неспецифическими защитными экранами, предотвращающими проникновение патогенов в организм хозяина.С патогенами, способными преодолеть этот первый барьер, борется врожденная иммунная система в качестве вторичного защитного экрана, реагирующего с немедленным патоген-ориентированным ответом, опосредованным иммунными клетками, такими как макрофаги, гранулоциты и естественные клетки-киллеры, или каскадом белков плазмы крови. система дополнения. В качестве третьего уровня защиты адаптивная иммунная система распознает антигены и поддерживает иммунологическую память. Адаптивный иммунитет действует через гуморальный и клеточный ответ. Гуморальный, опосредованный антителами ответ зависит от распознавания антигена / патогена B-лимфоцитами в лимфе или крови.Однако клеточный путь адаптивного иммунитета использует Т-лимфоциты, распознающие антигенные пептиды, представленные основными комплексами гистосовместимости (MHC). Этот путь выполняет регуляторные и цитотоксические функции (1).

    Презентацию антигена

    можно подразделить на пути, зависимые от MHC класса I и MHC класса II. Антигенные пептиды, происходящие из экзогенных антигенов, загружаются в лизосомальные компартменты на молекулах MHC II и, наконец, презентируются Т-хелперным лимфоцитам CD4 + (2, 3).Эндогенные антигены расщепляются через убиквитин / протеасому и другие протеолитические пути. Продукты деградации могут перемещаться в просвет эндоплазматического ретикулума (ER) с помощью переносчика, связанного с процессингом антигена (TAP). Комплекс загрузки пептидов (PLC), состоящий из TAP1 и TAP2, двух шаперонов ER, тапазина и кальретикулина, оксидоредуктазы ERp57 вместе с тяжелой цепью MHC I и β 2 -микроглобулина, необходим для эффективной загрузки антигенных пептидов. на молекулы MHC I.После проверки эпитопа и контроля качества в PLC, кинетически стабильные комплексы пептид-MHC высвобождаются, чтобы доставить свой антигенный груз по секреторному пути к плазматической мембране. На поверхности клетки молекулы MHC I представляют свои антигенные пептиды цитотоксическим Т-лимфоцитам CD8 + , которые в конечном итоге вызывают элиминацию вирусно или злокачественно трансформированных клеток (2, 3). Перекрестная презентация является подтипом MHC I-зависимой презентации антигена, но опосредована эффективным захватом и процессингом экзогенных антигенов.Предлагаются два основных пути для перекрестной презентации. Однако точные механистические детали до сих пор не ясны. В то время как цитозольный путь является протеасомным и TAP-зависимым, вакуолярный путь не зависит ни от протеасомы, ни от TAP (4).

    Фундаментальная роль транспортного комплекса ТАР в адаптивном иммунитете предопределяет ТАР как мишень для инфекционных заболеваний и злокачественных заболеваний, таких как синдром голых лимфоцитов типа I и рак. Таким образом, подробные знания о структуре и транспортном механизме TAP имеют решающее значение для разработки методов лечения или лекарств против таких заболеваний, но на сегодняшний день многие аспекты определены недостаточно.Этот обзор посвящен структуре и динамике антигенных пептидов, связанных с TAP, проливая свет на недавние попытки определить структуру связанного субстрата и локализовать соответствующий сайт связывания с помощью биофизических и теоретических методов, таких как электронный парамагнитный резонанс (ЭПР), ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и эксперименты по стыковке молекул.

    Структурная организация комплекса ТАП человека

    TAP1 и TAP2 являются членами ABC-связывающей кассеты (ABC) подсемейства B (ABCB2 и ABCB3) и обнаруживаются во всех ядросодержащих клетках челюстных позвоночных.TAP преимущественно находится в ER и cis -Golgi, хотя сигнал ER-targeting или ER-retention на сегодняшний день не определен (5). Гетеродимерный комплекс TAP необходим и достаточен для связывания и транслокации пептида, тогда как гомодимеры TAP1 или TAP2 нефункциональны (6, 7). TAP состоит из двух трансмембранных доменов (TMD), содержащих сайт связывания субстрата, и двух нуклеотид-связывающих доменов (NBD), ответственных за связывание и гидролиз АТФ (рис. 1A). Каждый полутранспортер содержит N-концевой четырехтрансмембранный спиральный пучок, называемый TMD0.Было обнаружено, что консервативный солевой мостик между TMD0 и тапазином, расположенный внутри мембраны ER, необходим для сборки PLC и для эффективного процессинга антигена (8, 9). Напротив, коровые субъединицы TAP, лишенные этих TMD0, достаточны для сборки TAP, нацеливания на ER, связывания пептидов и транслокации пептидов (8, 10). Основной транспортер и TMD0 соединены локтевыми спиралями (EH), функция которых до сих пор не определена. Связывающие спирали Ch2 и Ch3, расположенные в цитозольных петлях (CL) между TM2 и TM3, а также TM4 и TM5, обеспечивают перекрестную связь между TMD и NBD в цис- и в транс-.Они встроены в бороздку между RecA-подобным и α-спиральным доменами NBD, тем самым взаимодействуя с Q- и X-петлей, а также с областью NBD, которая позиционирует пуриновое основание АТФ (рис. 1B) ( 11, 12).

    Рис. 1. Структурная организация транспортера комплекса транслокации антигена, связанного с процессингом антигена (TAP). (A) 3D-модель гомологии комплекса TAP человека на основе TAP-родственного гетеродимерного ABC-связывающего кассетного транспортера TmrAB в обращенной внутрь конформации (13, 14).Гетеродимерный механизм транслокации (TAP1 и TAP2) состоит из основного домена 2 × 6 TMH, двух дополнительных N-концевых четырехтрансмембранных спиральных пучков (TMD0, схематично показано) и двух нуклеотид-связывающих доменов (NBD). Основные трансмембранные домены (TMD) и TMD0 связаны через изогнутых спиралей (EH). Два NBD способствуют связыванию и гидролизу АТФ. (B) Вид сверху из просвета ER вдоль интерфейса TMD – NBD. Спираль связывания Ch2 обеспечивает междоменный перекрестный обмен между NBDs и TMD в цис- и в транс-, тогда как Ch3 взаимодействует с в транс-. (C) Схематическое изображение асимметричных NBD комплекса TAP. NBD плотно упакованы в обращенной наружу конформации и, таким образом, образуют два АТФ-связывающих сайта. Наличие неэквивалентных, консенсусных и неконсенсусных сайтов АТФазы основано на аберрантных аминокислотных остатках в пределах консервативных мотивов последовательности. TAP1: серый, TAP2: синий, CH / EH: малиновый.

    Несколько консервативных мотивов, таких как Walker A, Walker B, подпись ABC (C-петля), A- / D- / Q-loop и H-switch, характерны для белков ABC.X-петля является дополнительной консервативной областью, но присутствует только у некоторых экспортеров ABC, таких как TAP. Подходы с использованием сканирования цистеина и перекрестного связывания показали, что обе связывающие спирали взаимодействуют в транс- с Х-петлей противоположной субъединицы (TEVD E AG и TDVG E KG; консервативный глутамат выделен жирным шрифтом). Транспортная активность снижалась без влияния на связывание пептида, когда консервативный глутамат Х-петли в TAP2 был мутирован. Поперечное сшивание X-петли с Ch2 или Ch3 препятствует транспорту или связыванию субстрата, соответственно (11, 12).

    Неэквивалентность двух сайтов связывания нуклеотидов (NBS I и II), каждый из которых координирует молекулу АТФ посредством обоих NBD, является интригующей особенностью, общей для многих переносчиков ABC человека, включая TAP (рис. 1C). В TAP1 консервативный глутамат рядом с Walker B, действующий как каталитическое основание, заменяется аспартатом, а консервативный гистидин H-переключателя - глутамином. Кроме того, сигнатурный мотив (C-петля) TAP2 отличается на два остатка (от L SG GQ до L AA GQ).Измененные остатки локализуются исключительно в NBS I, который демонстрирует сильно сниженную активность АТФазы. Таким образом, NBS I квалифицируется как сайт без единого мнения. Роль этого вырожденного NBS в переносчиках ABC все еще остается загадкой. Однако пептид-специфический захват переходного состояния гидролиза АТФ в обоих NBS может наблюдаться только после одного цикла гидролиза АТФ, а не в обратной реакции в присутствии АДФ и улавливающего реагента (15). Тем не менее, мутировавший комплекс TAP, несущий две вырожденные C-петли, обнаруживает резко сниженную скорость транспорта.Таким образом, NBS I, по-видимому, принимает на себя регулирующую роль, в то время как консенсусный сайт представляет собой движущий двигатель для транспорта субстрата с помощью TAP. Это подтверждается увеличением транспортной активности химеры с двумя каноническими С-петлями (16, 17).

    Транспортный механизм пептидов по TAP

    Детали транспортного механизма и конформационной динамики транспортера TAP до настоящего времени не выяснены. Текущая рабочая модель механизма транслокации пептидов с помощью TAP была получена из биохимических подходов и недавних структур ABC-экспортеров, которые имеют сходную общую архитектуру (Figure 2).TMD комплекса TAP закрывают путь к просвету ER в открытой внутрь конформации. Связывание пептидов с TMD происходит независимо от связывания АТФ с NBD, которые отделены друг от друга (15-17). В физиологических условиях транспортный комплекс нагружен двумя АТФ-Mg в состоянии покоя. Связывание пептидов TAP запускает аллостерический перекрестный обмен между NBD и TMD, передаваемый посредством связывающих спиралей. Принятое связанное с субстратом состояние вызывает димеризацию NBD и, предположительно, образование окклюдированного состояния.Последующая конформационная перестройка TMD переключает TAP из обращенного внутрь состояния в обращенное наружу состояние. Плотный димер NBD окружает две молекулы АТФ на своей границе раздела. Как обсуждалось выше, каждая молекула АТФ тесно координируется в NBS с помощью обоих NBDs (18-20). Примечательно, что гидролиз АТФ с помощью ТАР строго связан со связыванием и транслокацией пептида. Базальной активности АТФазы в отсутствие пептидных субстратов не наблюдалось (12, 21, 22). Гидролиз АТФ связан с высвобождением пептида в просвет ER.После гидролиза АТФ димер NBD дестабилизируется, и переносчик возвращается в открытое внутрь состояние «покоя», в котором неорганический фосфат и АДФ обмениваются на АТФ-Mg (23-25).

    Рисунок 2. Текущая модель цикла транслокации пептидов переносчиком, связанным с процессингом антигена (TAP) . В физиологических условиях ТАР нагружен АТФ в обращенной внутрь конформации. Связывание пептида (стадия 1) вызывает конформационную перестройку комплекса TAP и, как следствие, димеризацию нуклеотид-связывающего домена.Предположительно, формируется закрытое состояние (этап 2), за которым следует переключение на обращенную наружу конформацию, запускающую транслокацию пептида через мембрану (этап 3) и последующее высвобождение пептида в просвет эндоплазматического ретикулума (ER) (этап 4). Гидролиз АТФ (стадия 5) возвращает комплекс ТАР в состояние покоя, и АДФ обменивается на АТФ (стадия 6). При высоких концентрациях пептида в просвете ER (16 мкМ) ТАР блокируется транс-ингибированием.

    Связывание субстрата человеческого TAP

    Распознавание пептида TAP - это начальный этап цикла транслокации, за которым следуют аллостерически связанные конформационные изменения и гидролиз ATP.Кинетический анализ связывания пептидов выявил двухэтапный процесс, состоящий из быстрой ассоциации и медленной конформационной перестройки переносчика (26). Процесс связывания пептида характеризуется высокой энергией активации и включает 25% всех остатков ТАР (27). Связывание пептидов и АТФ происходит независимо друг от друга, но связывание и транслокация пептидов вызывают гидролиз АТФ (21). Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия показала, что только один пептид одновременно может связываться с комплексом TAP (22).TAP способен связывать пептиды, состоящие из 8–16 аминокислот с аналогичным наномолярным сродством (16). Кроме того, не препятствует связыванию пептидов с 40 аминокислотами или объемными боковыми цепями, такими как флуорофоры, спиновые зонды, химические протеазы или полилизиновые цепи (21, 28–30). Для отбора пептидов с помощью TAP критическими являются первые три N-концевых остатка и C-концевой остаток пептида (17, 28, 29, 31–35). Принцип распознавания человеческого ТАП был исследован путем применения библиотек комбинаторных пептидов, включающих один определенный остаток, в подходе сканирования, тогда как все остальные положения полностью рандомизированы (36).Эти исследования показали, что человеческий TAP отдает предпочтение положительно заряженным (положения 1 и 2), а также ароматическим остаткам (положение 3) в N-концевых положениях и гидрофобным или основным аминокислотам на C-конце пептида. Свободные N- и C-концы являются важной предпосылкой для связывания с высоким сродством (15, 36). Область между этими N- и C-концевыми «якорными» остатками может сильно различаться по последовательности и длине. Спектроскопия ЭПР дала первое представление о динамике и структуре пептидов, связанных с ТАП (29).Остатки якоря ограничены в движении, в то время как остатки между ними очень эластичны. Примечательно, что расстояние между N- и C-концами TAP-связанного пептида было определено примерно до 2,5 нм с помощью экспериментов с двойным электрон-электронным резонансом независимо от длины пептида (29). Эти данные предполагают, что более длинные пептиды приспосабливают протяженную изогнутую структуру в TAP-связанном состоянии.

    Структурно определенное расстояние N-C для TAP-связанных пептидов и принципы распознавания указывают на коэволюцию иммунопротеасомы, TAP и MHC I для улучшения презентации антигена (Рисунок 3).Иммунопротеасома, сборка которой стимулируется интерфероном-γ, предпочтительно генерирует пептиды, снабженные гидрофобными или основными С-концами, которым благоприятствует TAP (37). Комплекс TAP перемещает эти пептиды в просвет ER. Более длинные пептиды обрезаны с N-конца резидентной аминопептидазой ER (ERAP) до фрагментов, содержащих в основном восемь или девять аминокислот. Помимо предпочтительного С-концевого остатка, эти пептиды предпочтительно помещаются в связывающий карман MHC I (38). Рентгеновские кристаллические структуры показали фиксированное расстояние от N до C для пептидов, связанных с MHC I, что определяет минимальную длину лигандов MHC I (39).Таким образом, N- и C-концы пептида связываются с карманами A и F канавки связывания MHC I. Преобладающий N-концевой якорный остаток расположен в положении 2, тогда как второй гидрофобный якорный остаток находится на С-конце пептида (1, 39). Рецепторы Т-клеток, наоборот, распознают пептидные остатки в положениях, расположенных между якорными остатками транспортера ТАР (40).

    Рисунок 3. Коэволюция ключевых механизмов на пути процессинга антигена основных комплексов гистосовместимости (MHC) I .Продукты протеасомной деградации с предпочтительной длиной и гидрофобным С-концом распознаются переносчиком, связанным с комплексом процессинга антигена (TAP), и перемещаются в просвет эндоплазматического ретикулума (ER). Пептиды, которые не помещаются в связывающий карман MHC I, обрезаны на N-конце резидентной аминопептидазой ER (ERAP) и впоследствии загружены в молекулы MHC I для дальнейшей обработки. Сходные C-концевые якорные остатки и перекрывающееся расстояние от N до C у пептидов, связанных с TAP и MHC I [(13), PDB: 2BSR], указывают на коэволюцию обоих компонентов в процессинге антигена.

    Помимо хорошо охарактеризованного высокоаффинного сайта связывания пептида, доступного в обращенной внутрь конформации, был предложен второй, низкоаффинный сайт связывания, основанный на исследованиях транспорта TAP, восстановленного в протеолипосомах (41). Транслокация пептидов в протеолипосомы не превышала концентрации пептида в просвете около 16 мкМ, хотя TAP является активным однонаправленным переносчиком. Эта максимальная концентрация пептида не зависит от количества комплексов ТАП в мембране.Таким образом, ингибирование в транс- указывает на второй сайт связывания с низким сродством, обращенный к просвету ER (фиг. 2). Предполагается, что насыщение сайта связывания пептида просвета ER препятствует переключению транспортера обратно на обращенную внутрь конформацию и индукции другого транспортного цикла. Этот процесс, также называемый транс-ингибированием, может предотвратить индукцию стресса ER и развернутый белковый ответ при высокой концентрации пептида в просвете ER (41).

    Сайт связывания субстрата TAP

    Ряд остатков и участков последовательности в человеческом TAP имеют решающее значение для связывания и транспорта пептида (рисунок 4; таблица 1).Первоначальные исследования фото-перекрестного связывания картировали сайт связывания пептида в TMD комплекса coreTAP, который ограничен CL между TMh5 и TMH5 (P375-M420 TAP1 и R354-M389 TAP2 ), а также линкерная область между TMD и NBD каждого полутранспортера (Q453-R487 TAP1 и I414-M433 TAP2 ) (42). Кроме того, остатки G282 / I284 / R287 / V288 в CL1 TAP1 были идентифицированы как сенсорная область пептида, участвующая в междоменном перекрестном взаимодействии для аллостерического связывания пептида и гидролиза АТФ (28).Кроме того, были определены несколько остатков, важных для субстратной специфичности. Делеция или замена E263 TAP1 в мышиных или человеческих клетках вызвала фенотип, сравнимый с TAP1-дефицитными клетками, как показывает поверхностная экспрессия MHC I. У этого мутанта TAP нарушено связывание и транслокация пептидов (43). A374 и C213 TAP2 были идентифицированы как контролирующие репертуар пептидов (42, 44). Замена C213 TAP2 на серин приводит к изменению субстратной специфичности человеческого TAP.В этом мутанте отрицательно заряженные пептидные остатки предпочтительны в положениях 1, 2 и особенно на С-конце, как определено методом сканирования с использованием комбинаторных пептидных библиотек. Подходы к перекрестному связыванию открыли C-концевые пептидные остатки, непосредственно контактирующие с C213 TAP2 (44). Удивительно, но это открытие противоречит моделям гомологии транспортера TAP, в которых C213 TAP2 указывает на бислой мембраны (12, 13, 45, 46). Исследования перекрестного связывания и мутационный анализ на крысинских ТАР привели к дополнительным остаткам в ТАР-комплексе, которые, как предполагалось, контролируют субстратную специфичность или вносят вклад в сайт связывания пептида.Кроме того, были идентифицированы несколько других остатков в TAP2 (A217, E218, Q380, Q262, S265 и L266 у крысы, соответствующие T217, M218, R380, N262, P265 и L266 у человека) для модуляции специфичности пептида (30 , 47). Недавно в TAP1 крысы (соответствующие S296, Y408 и E459 в TAP человека) были определены остатки C273, Y385 и E436 для непосредственной координации связанного пептида (46).

    Фигура 4. Остатки, участвующие в связывании и транслокации пептида . Исследования перекрестного связывания (малина) и мутационные анализы (синий) выявили переносчик, связанный с остатками процессинга антигена (TAP), способствующими связыванию / транслокации субстрата (см. Таблицу 1).Модель трехмерной гомологии человеческого комплекса ТАП основана на гомологе ТАП TmrAB в обращенной внутрь конформации (13, 14).

    Таблица 1. Существенные остатки для функционирования транспортера, связанного с процессингом антигена (TAP) .

    Несмотря на идентификацию остатков, предположительно вносящих вклад в сайт связывания субстрата, оценка местоположения субстрат-связывающего кармана комплекса TAP и обнаружение пептидного эпитопа в этом кармане является сложной задачей.Чтобы прояснить этот аспект, были применены подходы молекулярного докинга. Первое исследование докинга эпитопа HLA-B27 RRYQKSTEL было основано на модели гомологии TAP, полученной из гомодимерного переносчика ABC ABCB10 (45). Электростатические взаимодействия между заряженными пептидными остатками и самим связывающим карманом также необходимы для связывания пептида в дополнение к свободным N- и C-концам пептида. Расчеты электростатических потенциалов предсказанного сайта связывания показали наличие двух карманов связывания.Один связывающий карман отрицательно заряжен и связывает N-конец пептида, в то время как другой заряжен положительно и координирует С-конец пептида, связанного с TAP. Здесь связанный нонамер принимает расширенную конформацию, параллельную плоскости мембраны, с расстоянием от N до C, равным 2,2 нм, в соответствии с импульсными измерениями расстояния ЭПР (29). Эти исследования стыковки ограничивали сайты взаимодействия TAP выясненными электростатическими связывающими карманами, в то время как динамика пептидов не ограничивалась. Второе докинговое исследование объединило недавно идентифицированные остатки с моделью гомологии TAP, основанной на гомодимерном переносчике ABC Atm1 (46).В этом исследовании было высказано предположение, что пептиды связываются с TAP в β-шпильке-подобной конформации, параллельной плоскости мембраны (46), что противоречит ограничениям расстояния EPR для пептидов, связанных с TAP (29), и исследованиям докинга (45). Несмотря на то, что стыковка двойного спин-меченного β-шпилечного пептида привела к ограничению спиновых меток в сайте связывания TAP с межспиновым расстоянием ~ 2,3 нм (46), эта конформация пептида не объясняет ограничение связывания TAP. пептиды до минимальной длины в восемь остатков.Следовательно, конформация пептида в состоянии, связанном с ТАР, была проанализирована с помощью твердотельного ЯМР, чтобы прояснить эти противоречивые результаты.

    Твердотельный ЯМР с динамической ядерной поляризацией позволил выявить конформацию расширенной основной цепи пептидов, связанных с ТАП, с атомным разрешением благодаря значительному усилению сигнала и значительному сокращению времени сбора данных (13). Молекулярное присоединение пептида с ограниченным остовом, но свободно вращающимися боковыми цепями в модель гомологии TAP, основанную на гетеродимерном транспортном комплексе ABC TmrAB, выявило пептид, связанный с TAP в наклонной ориентации по отношению к плоскости мембраны (рис. 5).Большинство пептидных координирующих остатков TAP совпадают с остатками, идентифицированными биохимическими методами в предыдущих исследованиях. Полученная структура основной цепи дополнительно поддерживает коэволюцию молекул TAP и MHC I, уже обсуждавшуюся выше (Рисунок 3). Анализ химического сдвига позволил по-новому взглянуть на взаимодействие пептид-TAP. Пептид координируется TAP в положениях 1, 3 и 9. Исследование дополнительно выявило гибкость пептида в пределах его сайта связывания, поскольку для N-концевой аминогруппы наблюдались два различных режима связывания.Интересно, что большая полость, образованная TMD обоих полутранспортеров, может быть обнаружена рядом с сайтами связывания пептидных якорных остатков. Эта полость может способствовать размещению объемных боковых цепей пептида и даже ковалентно связанных флуорофоров (рис. 5).

    Фиг. 5. Расположение сайта связывания субстрата внутри транспортера, связанного с комплексом процессинга антигена (TAP) . Трансмембранные домены позиционируют пептид (темно-серый) через его N- и C-концы между TAP1 (серый) и TAP2 (голубой).Вытянутый пептидный остов ориентирован в наклонном положении по отношению к плоскости мембраны и окружен большой полостью (малиновой). Увеличение сайта связывания субстрата иллюстрирует связанный нонамер в виде шарика и палочки (красный: O, синий: N, белый: H), тогда как боковые цепи показаны только для одного конформера. Модель трехмерной гомологии комплекса TAP основана на гетеродимерном ABC-связывающем кассетном транспортере TmrAB в обращенной внутрь конформации (13, 14).

    Заключительные замечания

    Несколько биохимических и теоретических попыток локализовать сайт связывания субстрата в комплексе TAP теперь приводят к лучшей картине выбора субстрата переносчиком.Хотя подходы молекулярного стыкования обеспечивают полезное различение потенциальных мест для сайтов связывания субстрата, эти анализы смещены из-за ограничения конформационной свободы пептида и потенциального числа доноров и акцепторов водорода. Недавно выясненная структура основной цепи и точные измерения расстояний до N и C концов TAP-связанных пептидов предоставили экспериментальные доказательства, которые значительно улучшили эти подходы к стыковке молекул. Однако дальнейшее уточнение положений связывающего кармана (ов) с помощью, например,g., требуется импульсная спектроскопия ЭПР. Эти исследования будут дополнены рентгеноструктурным анализом комплексов пептид-ТАП с высоким разрешением. С другой стороны, крио-ЭМ-структуры могут также предоставить ценную информацию о субстрат-связывающей области, что продемонстрировано для связанного с TAP транспортера ABC TmrAB (48) и транспортера TAP со связанным вирусным ингибитором ICP47 (49).

    Беспрецедентное понимание динамики связывания и транслокации пептидов с помощью TAP будет достигнуто путем применения передовых биофизических методов, таких как резонансная передача энергии Фёрстера одиночными молекулами.Вместе с изображенным сайтом связывания пептида эти исследования значительно улучшат общее понимание транслокации субстрата с помощью TAP и, таким образом, обеспечат основу для разработки новых лекарств или терапевтических подходов. Несмотря на обилие биохимических данных о сайте связывания с субстратом с высокой аффинностью, термодинамическая и кинетическая характеристика сайта связывания с низким сродством на сегодняшний день является неполной. Субстратная специфичность последнего сайта и его расположение в комплексе TAP будет представлять большой интерес в проспективных исследованиях.Эти исследования комплекса TAP также будут новаторскими для других переносчиков ABC, таких как TAP-подобные (ABCB9) (50), обнаруживая аналогичные транс-ингибирующие эффекты. Более того, решающим будет определение того, как транс-ингибирование TAP помогает сбалансировать процессинг антигена, а также гомеостаз ER, и как эти процессы участвуют в контроле стресса ER, вызванного накопленными пептидами.

    Авторские взносы

    EL подготовила рисунки и таблицы. EL и RT написали рукопись.

    Заявление о конфликте интересов

    Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

    Благодарности

    Авторы благодарят доктора Руперта Абеле, доктора Саймона Трович и Кристину Ле Галь за критическое прочтение рукописи.

    Финансирование

    Немецкий исследовательский фонд (SFB 807 - Транспорт и коммуникация через биологические мембраны и Ab149 / 1) поддержал эту работу.

    Список литературы

    1. Мерфи К.М. Иммунобиология Джейнвей . Лондон: Гарланд Наука (2012).

    Google Scholar

    5. Lankat-Buttgereit B, Tampé R. Транспортер, связанный с процессингом антигена: функция и значение при заболеваниях человека. Physiol Rev (2002) 82: 187–204. DOI: 10.1152 / Physrev.00025.2001

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    6. Meyer TH, van Endert PM, Uebel S, Ehring B., Tampé R.Функциональная экспрессия и очистка комплекса переносчиков ABC, связанного с процессингом антигена (TAP) в клетках насекомых. FEBS Lett (1994) 351: 443–7. DOI: 10.1016 / 0014-5793 (94) 00908-2

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    7. Urlinger S, Kuchler K, Meyer TH, Uebel S, Tampé R. Внутриклеточное расположение, комплексообразование и функция переносчика, связанного с процессингом антигена в дрожжах. Eur J Biochem (1997) 245: 266–72.DOI: 10.1111 / j.1432-1033.1997.00266.x

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    8. Koch J, Guntrum R, Heintke S, Kyritsis C, Tampé R. Функциональное рассечение трансмембранных доменов транспортера, связанного с процессингом антигена (TAP). J Biol Chem (2004) 279: 10142-7. DOI: 10.1074 / jbc.M312816200

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    9. Blees A, Reichel K, Trowitzsch S, Fisette O, Bock C., Abele R, et al. Сборка комплекса загрузки пептида MHC I определяется консервативным ионным переключателем блокировки. Научный журнал (2015) 5: 17341. DOI: 10.1038 / srep17341

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    10. Кох Дж., Гунтрум Р., Тампе Р. Первая N-концевая трансмембранная спираль каждой субъединицы антигенного пептидного транспортера ТАП важна для независимого связывания тапазина. FEBS Lett (2006) 580: 4091–6. DOI: 10.1016 / j.febslet.2006.06.053

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    12. Оанча Г., О’Мара М.Л., Беннетт В.Ф., Тилеман Д.П., Абеле Р., Тампе Р.Структурное расположение интерфейса передачи в транспортном комплексе антигена ABC TAP. Proc Natl Acad Sci U S A (2009) 106: 5551–6. DOI: 10.1073 / pnas.0811260106

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    13. Ленерт Э., Мао Дж., Мехдипур А.Р., Хаммер Дж., Абеле Р., Глаубиц С. и др. Распознавание антигенного пептида на человеческом транспортере ABC TAP, разрешенное с помощью твердотельной ЯМР-спектроскопии с усилением DNP. J Am Chem Soc (2016) 138: 13967–74.DOI: 10.1021 / jacs.6b07426

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    14. Нелл А., Томас К., Хербринг В., Цоллманн Т., Барт К., Мехдипур А.Р. и др. Кристаллическая структура и механистическая основа функционального гомолога транспортера антигена ТАП. Proc Natl Acad Sci U S A (2017). DOI: 10.1073 / pnas.1620009114

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    15. Андролевич М.Дж., Крессвелл П. Человеческие транспортеры, связанные с процессингом антигена, обладают беспорядочным сайтом связывания пептидов. Иммунитет (1994) 1: 7–14. DOI: 10.1016 / 1074-7613 (94)

    -3

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    16. ван Эндерт П.М., Тампе Р., Мейер Т.Х., Тиш Р., Бах Дж. Ф., МакДевитт Х.О. Последовательная модель связывания и транспорта пептидов транспортерами, связанными с процессингом антигена. Иммунитет (1994) 1: 491–500. DOI: 10.1016 / 1074-7613 (94)

    -4

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    17. Uebel S, Meyer TH, Kraas W., Kienle S, Jung G, Wiesmüller KH, et al.Требования к пептидному связыванию с человеческим транспортером, связанным с процессингом антигена, выявляются с помощью сканирования пептидов и сложных пептидных библиотек. J Biol Chem (1995) 270: 18512-6. DOI: 10.1074 / jbc.270.31.18512

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    18. Чен М., Абеле Р., Тампе Р. Функциональная неэквивалентность АТФ-связывающих сигнатурных мотивов кассеты в транспортере, связанном с процессингом антигена (ТАР). J Biol Chem (2004) 279: 46073–81.DOI: 10.1074 / jbc.M404042200

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    19. Эрнст Р., Кох Дж., Хорн С., Тампе Р., Шмитт Л. Разработка АТФазной активности в изолированной кассете АВС человеческого ТАП1. J Biol Chem (2006) 281: 27471–80. DOI: 10.1074 / jbc.M601131200

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    20. Procko E, Ferrin-O’Connell I, Ng SL, Gaudet R. Четкие структурные и функциональные свойства сайтов АТФазы в асимметричном переносчике ABC. Mol Cell (2006) 24: 51–62. DOI: 10.1016 / j.molcel.2006.07.034

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    21. Горбулев С., Абеле Р., Тампе Р. Аллостерическое перекрестное взаимодействие между пептидным связыванием, транспортом и гидролизом АТФ ABC транспортера TAP. Proc Natl Acad Sci U S. A (2001) 98: 3732–7. DOI: 10.1073 / pnas.061467898

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    22. Хергет М., Крайссиг Н., Кольбе С., Шёльц К., Тампе Р., Абеле Р.Очистка и восстановление антигенного транспортного комплекса ТАП: необходимое условие для определения стехиометрии пептидов и гидролиза АТФ. J Biol Chem (2009) 284: 33740–9. DOI: 10.1074 / jbc.M109.047779

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    23. Абеле Р., Тампе Р. Азбука иммунологии: структура и функция ТАР, переносчика, связанного с процессингом антигена. Физиология (2004) 19: 216–24. DOI: 10.1152 / Physiol.00002.2004

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    26. Neumann L, Tampé R. Кинетический анализ связывания пептида с транспортным комплексом TAP: доказательства структурных перестроек, индуцированных связыванием субстрата. J Mol Biol (1999) 294: 1203–13. DOI: 10.1006 / jmbi.1999.3329

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    27. Neumann L, Abele R, Tampé R. Термодинамика связывания пептида с переносчиком, связанным с процессингом антигена (TAP). J Mol Biol (2002) 324: 965–73. DOI: 10.1016 / s0022-2836 (02) 01148-8

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    28. Herget M, Oancea G, Schrodt S, Karas M, Tampé R, Abele R. Механизм определения субстрата и передачи сигнала в ABC-транспортере: использование стратегии троянского коня. J Biol Chem (2007) 282: 3871–80. DOI: 10.1074 / jbc.M608480200

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    29. Хергет М., Балдауф С., Шёльц С., Парсей Д., Визмюллер К. Х., Тампе Р. и др.Конформация пептидов, связанных с транспортером, связана с процессингом антигена (TAP). Proc Natl Acad Sci U S A (2011) 108: 1349–54. DOI: 10.1073 / pnas.1012355108

    CrossRef Полный текст | Google Scholar

    30. Koopmann JO, Post M, Neefjes JJ, Hämmerling GJ, Momburg F. Транслокация длинных пептидов переносчиками, связанными с процессингом антигена (TAP). Eur J Immunol (1996) 26: 1720–8. DOI: 10.1002 / eji.1830260809

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    31.Heemels M, Schumacher T, Wonigeit K, Ploegh H. Транслокация пептидов вариантами переносчика, связанными с процессингом антигена. Science (1993) 262: 2059–63. DOI: 10.1126 / science.8266106

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    32. Momburg F, Roelse J, Hämmerling GJ, Neefjes JJ. Выбор размера пептида с помощью пептидного транспортера, кодируемого основным комплексом гистосовместимости. J Exp Med (1994) 179: 1613–23. DOI: 10.1084 / jem.179.5.1613

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    33.Громме М., ван дер Валк Р., Слидрегт К., Верни Л., Лискамп Р., Хэммерлинг Г. и др. Рациональный дизайн ингибиторов ТАП с использованием модификаций пептидных субстратов и пептидомиметиков. Eur J Immunol (1997) 27: 898–904. DOI: 10.1002 / eji.1830270415

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    34. Габлер Б., Даниэль С., Армандола Е.А., Хаммер Дж., Кайлат-Цукман С., ван Эндерт П.М. Отбор субстрата переносчиками, связанными с процессингом антигена, происходит во время связывания пептида с ТАР. Mol Immunol (1998) 35: 427–33. DOI: 10.1016 / S0161-5890 (98) 00059-5

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    35. van Endert PM, Riganelli D, Greco G, Fleischhauer K, Sidney J, Sette A, et al. Пептид-связывающий мотив для человеческого транспортера, связанный с процессингом антигена. J Exp Med (1995) 182: 1883–95. DOI: 10.1084 / jem.182.6.1883

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    36. Убель С., Краас В., Кинле С., Висмюллер К. Х., Юнг Г., Тампе Р.Принцип распознавания транспортера ТАР раскрывается комбинаторными пептидными библиотеками. Proc Natl Acad Sci U S. A (1997) 94: 8976–81. DOI: 10.1073 / pnas.94.17.8976

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    37. Нидерманн Г., Гримм Р., Гейер Э., Маурер М., Реалини С., Гартманн С. и др. Потенциальная иммунокомпетентность протеолитических фрагментов, продуцируемых протеасомами до эволюции иммунной системы позвоночных. J Exp Med (1997) 186: 209–20.DOI: 10.1084 / jem.186.2.209

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    38. Савиану Л., Кэрролл О., Линдо В., Дель Вал М., Лопес Д., Лепеллетье Ю. и др. Согласованное обрезание пептидов комплексами аминопептидаз ERAP1 и ERAP2 человека в эндоплазматическом ретикулуме. Nat Immunol (2005) 6: 689–97. DOI: 10.1038 / ni1208

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    41. Гроссманн Н., Ваккасоглу А.С., Хульпке С., Абеле Р., Годе Р., Тампе Р.Механистические детерминанты направленности и энергетики активного экспорта гетеродимерным транспортером ABC. Нац Коммун (2014) 5: 5419. DOI: 10.1038 / ncomms6419

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    42. Армандола Е.А., Момбург Ф., Нийенхейс М., Бюльбук Н., Фрю К., Хаммерлинг Г.Дж. Точечная мутация в транспортере человека, связанная с процессингом антигена (TAP2), изменяет специфичность транспорта пептидов. Eur J Immunol (1996) 26: 1748–55.DOI: 10.1002 / eji.1830260813

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    43. Ритц Ю., Дрекслер И., Саттер Д., Абеле Р., Хубер С., Селигер Б. Нарушение функции транспортера, связанное с функцией процессинга антигена (ТАР), приписываемое изменению одной аминокислоты в пептидной субъединице ТАР ТАР1. J Immunol (2003) 170: 941–6. DOI: 10.4049 / jimmunol.170.2.941

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    44. Baldauf C, Schrodt S, Herget M, Koch J, Tampé R.Одиночный остаток в комплексе транслокации антигена TAP контролирует репертуар эпитопа, стабилизируя рецептивную конформацию. Proc Natl Acad Sci U S. A (2010) 107: 9135–40. DOI: 10.1073 / pnas.1001308107

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    45. Корради В., Сингх Г., Тилеман Д. П.. Человеческий переносчик, связанный с процессингом антигена: молекулярные модели для описания компетентных состояний связывания пептида. J Biol Chem (2012) 287: 28099–111.DOI: 10.1074 / jbc.M112.381251

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    46. Генг Дж., Погожева И.Д., Мосберг Х.И., Рагхаван М. Использование функциональных полиморфизмов для выяснения сайта связывания пептида комплексов ТАП. J Immunol (2015) 195: 3436–48. DOI: 10.4049 / jimmunol.1500985

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    47. Деверсон Е.В., Леонг Л., Силиг А., Коадвелл В.Дж., Треджетт Е.М., Бутчер Г.В. и др. Функциональный анализ с помощью сайт-направленного мутагенеза сложного полиморфизма крысиного транспортера, связанного с процессингом антигена. J Immunol (1998) 160: 2767–79.

    PubMed Аннотация | Google Scholar

    48. Ким Дж., Ву С., Томасиак Т.М., Мергель К., Винтер МБ, Стиллер С.Б. и др. Структура электронной криомикроскопии субнанометрического разрешения гетеродимерного ABC-экспортера. Nature (2015) 517: 396–400. DOI: 10.1038 / природа13872

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    50. Цоллманн Т., Мойсет Г., Тумулка Ф., Тампе Р., Пулман Б., Абеле Р. Анализ транслокации пептидов с помощью переносчика АВС TAPL с помощью одного липосома. Proc Natl Acad Sci U S A (2015) 112: 2046–51. DOI: 10.1073 / pnas.1418100112

    PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

    Комплекс природных красот и исторических памятников Хыонг Сон

    Описание

    Природный и культурный комплекс Huong Son Comples расположен на известняковой горной гряде, примерно в 60 км к юго-западу от национальной столицы Фаноя. Этот горный массив образовался более 200 миллионов лет назад.Во время его орогенетических движений образовались ручьи и пещеры многих живописных долин, что добавило привлекательности известняковым горам и естественным лесам.

    Территория комплекса Huong Son является естественной средой обитания многих редких и ценных видов тропической фауны и флоры, а также первобытного человека на севере Вьетнама. Ряд пещер, таких как Луон, Сап Бон, Сунг Сам и Гиак, археологические памятники, принадлежащие культуре HOA BINE, датируются более чем 10 000 лет назад.

    В далеком прошлом, пользуясь местной природной красотой, древние Виетс построили систему из сотен буддийских пагод и храмов в пещерах на склонах гор и береговых ручьях, самой впечатляющей из которых является пещера Хыонгтич, которая также является самой красивой. природная пещера на даче.

    В этом районе ежегодно проводится фестиваль пагоды Хыонг, который длится месяц весной, в нем принимают участие сотни тысяч человек, как вьетнамцев, так и иностранцев.

    Комплекс Хуонг Сон состоит из трех групп пагодов, храмов и пещер, связанных друг с другом водными путями (ручьями):

    - Группа Хуонг Тич, к которой можно добраться у ручья Йен, включая храм Трин, пещеру Сон Тхуи Ху Тинь, мост Хой, пагоду Тхань Сон, пагоду Хунг Дай, пагоду Тхиен Тхья; пагода Хинь Донг, пагода Тянь, пагода Зяй Оан, храм Куа Вонг и пещера Хыонг Тио.

    - Группа Лонг-Ван, к которой ведет поток Лонг-Ван, включая пещеру Лонг-Ван, пещеру Тьен, пещеру Нгуби-Суа (древний человек) и пагоду Кай-Хе.

    - Группа пагод Туйет, доступная у ручья Туйет, в том числе храм Мау Ха, храм Мау Тхуонг, пагода Ка, пагода Бао Дай, пагода Туйет, пагода Ам и пещера Хонг Сон.

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    Комплекс внутреннего соединения ресничек является центром взаимодействия, который включает посттрансляционные модификации тубулина

    Существенные изменения:

    Никаких экспериментальных изменений не требуется.Рецензенты сочли, что за отдельными частями рукописи трудно следить, и предложили поработать над улучшением текста и рисунков. Предложения перечислены ниже.

    Рецензент 2:

    Хотя большинство структурных данных в документе имеют высокое разрешение и информативны, некоторые выводы, сделанные на их основе, недостаточно хорошо подтверждаются данными. Такие слова, как «однозначный» и «не оставляет сомнений» используются несколько раз. Соответствие индивидуальных белков плотности ЭМ достаточно убедительно, но ни один из белков не был подтвержден структурно с использованием соответствующих мутантов мечения недавно идентифицированных белков IJ.

    Мы ценим комментарии и исправили все тексты, чтобы убедиться, что они не востребованы.

    Другая серьезная проблема с рукописью касается компонентов, которые присутствуют в структурах томографии, но отсутствуют здесь. Компоненты протофиламента IJ отсутствуют в Tetrahymena, отсутствуют ли они после промывки солью или они частично заняты?

    Наша соляная промывка определенно влияет на стабильность определенных MIP. Стабильность конкретных MIP неодинакова у разных видов.Например, в A-канальце много МИПов. Хламидомонада отсутствует. Для PACRG и FAP20 почти все PACRG и FAP20 отсутствуют в Tetrahymena . Это должно происходить из-за солевой промывки. Как мы сообщали, только одна пара PACRG и FAP20 все еще существует. Вероятно, это связано со специфическим взаимодействием внутри 96-нм повтора этой пары. Мы действительно видим некоторую плотность вокруг этой конкретной пары в Tetrahymena , однако, поскольку наша карта представляет собой повторяющуюся единицу только 48 нм, эта плотность очень слабая, чтобы показать.

    В рукописи есть несколько противоречащих друг другу предложений, которые делают ситуацию весьма запутанной:

    A) В третьем абзаце подраздела «Множественные связывающие белки существуют в IJ», «нет IJ PF Tetrahymena». Пожалуйста, поясните, что это могло быть связано с биохимической очисткой, использованной в данном исследовании.

    B) Подраздел «Множественные белки привязки существуют в IJ», абзац седьмой, первое предложение: это предложение противоречит предыдущим предложениям: FAP20 / PACRG присутствует в Tetrahymena, но с меньшей занятостью, а также, по-видимому, имеет различную занятость на протяжении 96-нм повтора. .

    C) Подраздел «PACRG, FAP20, FAP52 и FAP276 образуют комплекс IJ», третье предложение: это предложение, похоже, повторяет предложение в третьем абзаце подраздела «Множественные связывающие белки существуют в IJ»

    D) Обсуждение, абзац второй: «в котором IJ PF был смыт…»

    Мы переписали текст, чтобы прояснить этот момент.

    «С другой стороны, область IJ, соединяющая PF B10 и A1 дублета Chlamydomonas , осталась нетронутой (рис. 1A-D).На соответствующей карте дублета Tetrahymena , обработанной солью, большая часть области IJ, соединяющей PF B10 и A1, отсутствует (7, 8) (более подробно позже). […] Присутствие полной IJ PF стабилизирует B-канальцы дублет Chlamydomonas относительно Tetrahymena , о чем свидетельствуют измерения местного разрешения (Рисунок 1 - рисунок в приложении 1D) ».

    Раздел результатов:

    «Ранее сообщалось, что в структуре Tetrahymena отсутствует целая нить IJ PACRG и FAP20, вероятно, из-за солевой промывки, а также диализа (8).Однако после настройки порогового значения рендеринга поверхности мы наблюдали, что одна пара PACRG и FAP20 осталась в структуре (Рисунок 1 - приложение к рисунку 1E) (7). Это может быть результатом специфической области в 96-нм повторе дублета Tetrahymena , который имеет дополнительные взаимодействия для предотвращения их отделения во время подготовки образца ».

    «Поскольку B-трубочка гибкая у Tetrahymena , разрешение в области IJ было значительно ниже, чем у Chlamydomonas (Рисунок 1 - приложение к рисунку 1D).”

    Обсуждение

    «В нашем дублете Tetrahymena , в котором большая часть IJ PF была смыта, даже с присутствием FAP52 и FAP106, дублет все еще остается гибким, что можно увидеть по более низкому разрешению B-канальца по сравнению с А-трубочка (Рисунок 1 - рисунок в приложении 1D) ».

    Рецензент 3:

    Мой общий комментарий - качество цифр следует улучшить. Судя по некоторым рисункам, я не совсем уверен, что структурные модели и белок-белковые взаимодействия, описанные в статье, верны.Эти опасения следует устранить, добавив больше деталей в рисунках и пояснениях в основном тексте. Вот подробности:

    1) Модель FAP276 и взаимодействия. «… Боковая цепь однозначно соответствует сигнатуре плотности в этой области». Какую последовательность и плотность вы использовали, чтобы присвоить FAP276 Y-образную плотность? Это неясно из рисунка 2 - рисунка дополнения 1G и H. Также авторы описали «сам FAP276 образует многочисленные формы, взаимодействующие с тубулином». Как они взаимодействуют? Я хотел бы увидеть детали их взаимодействия на рисунке.

    Мы удалили слово «однозначно», чтобы не переусердствовать. Мы добавили подробности о последовательности для всех белков теперь в Материалы и методы.

    Кроме того, чтобы проиллюстрировать взаимодействие FAP276 с тубулинами, мы заменили рис. 2C новым, показывающим, как FAP276 вставляется в решетку тубулина. Чтобы не переоценивать взаимодействие, мы писали сейчас: «FAP276 сам по себе образует различные контакты с тубулином как с N-, так и с C-концом, таким образом, он обеспечивает прочное закрепление FAP52 на решетке тубулина (рис. 2C).”

    2) Взаимодействия PACRG и FAP20. На рис. 2E и H авторы хотят показать детали белок-белковых взаимодействий? Пригодность боковых цепей? Это не ясно из этих цифр. Авторы должны сделать увеличенное изображение взаимодействий боковой цепи / боковой цепи и описать, как именно они взаимодействуют (например, линиями).

    Для этой цели мы улучшили рисунки 2E, F и H. Новый рисунок 2E заменен на рисунок 2G. Кроме того, чтобы не переоценивать карту при таком разрешении, мы выделили h236 как важные остатки для взаимодействия с тубулином B10, поскольку h236 консервативен у разных видов (Khan et al., 2019), тогда как другие остатки в этой петле не законсервированы. Мы тоже отразили это в тексте.

    Например, на рисунке 2H неясно, как боковые цепи, показанные на рисунке, вносят вклад в белок-белковые взаимодействия между β-тубулином и PACRG и FAP20. Кроме того, где находятся E432 и F437?

    Теперь мы более четко обозначили тубулин. Также, чтобы не истолковывать слишком много, укажите возможные остатки во взаимодействии на фигурах и произнесите это в тексте.

    Они, помеченные на Рисунке 2H, не указывают четко, где они находятся. Также авторы описали: «Интерфейс связывания PACRG и FAP20, по-видимому, включает множественные водородные связи…». Однако они не показали подробностей этих водородных связей на рис. 3A, B и C.Особенно важно показать, как FAP20-связывающая петля PACRG взаимодействует с FAP20, а остатки FAP20, которые взаимодействуют с петлей, сохраняются (связанные к рисунку 3 - приложение к рисунку 1).

    Чтобы проиллюстрировать взаимодействие FAP20 и PACRG, мы теперь включили новый рисунок 3B, показывающий детальную область взаимодействия.Мы также выделяем область взаимодействия FAP20 с PACRG в его выравнивании последовательностей на рисунке 3 - рисунок в приложении 1. Вот что мы сейчас пишем об этом взаимодействии в тексте:

    «Интерфейс связывания PACRG и FAP20 включает в себя дополнительные поверхностные заряды, что свидетельствует о специфическом и сильном взаимодействии (рис. 3B-D). Петля N225-I260 PACRG образует укладку β-листов, как взаимодействия с цепью h43-R36 FAP20 (рис. 3B). Кроме того, остаток Q264 PACRG образует водородную связь с остатком T38 FAP20.”

    3) Модель PACRG. На рис. 2I на красной модели отсутствует область. Как авторы пришли к выводу, что эти два красных сегмента принадлежат одному и тому же белку?

    Они являются частью одного и того же белка, потому что 1) все окружающие плотности были отнесены к димерам α-β-тубулина, 2) Существует 101 длинный сегмент N-конца PACRG, который все еще не привязан к плотности и 3) сигнатура плотности ниже и выше разрыва совпадает с идентичностью последовательности N-конца PACRG, как показано на рисунке 2 - приложение к рисунку 1B.

    Мы включили это в Материалы и методы.

    4) Взаимодействие с FAP52. Авторы описали «сегмент FAP52 G142-P143, по-видимому, взаимодействует с T41 α-тубулина из PF B9». Если остатки этих областей были связаны, эти взаимодействия должны быть показаны на рисунке. Также на рисунке 4F положения остатков неясны, атомы азота в R225 не синего цвета, поэтому было трудно идентифицировать остаток. Из этого рисунка я не уверен, что R225 делает солевой мостик с D39.

    Мы улучшили рисунки 4F и G, чтобы отразить предложения. Мы удалили текст выше и написали новый текст следующим образом. Мы не наблюдали боковую цепь для D39 или T41 из-за низкого разрешения в этой области. Следовательно, мы можем только строить догадки о взаимодействии, основанном на близости.

    Мы переписали следующим образом:

    «Плотность петли α-K40 PF B10 более полная, что позволяет нам предположить, что остаток K229 FAP52 взаимодействует с основной цепью D39 α-тубулина из PF B10.Также возможно, что существует гидрофобное взаимодействие между L226 и I42 (рис. 4E). Остатки R225 FAP52 и D39 α-тубулина находятся в среде, где они могут образовывать взаимодействие. Однако плотности боковых цепей для обоих остатков четко не определены. Во второй точке контакта с тубулином сегмент FAP52 G142-P143 находится в непосредственной близости от петли α-K40 от PF B9 (рис. 4B). В нижней части FAP52 петля V268-L279 находится в непосредственной близости с N-концом PACRG (рис. 4B).”

    5) Модель FAP106. В первом абзаце подраздела «FAP106 - это петля Tether, состоящая из плотностей Tether 1 и 2», как авторы пришли к выводу, что эти две отдельные плотности принадлежат одному и тому же белку, а не двум? Не видя взаимосвязи плотностей и не зная идентичности белков (до этого момента), это не убедительный их вывод. Петля в Tetrahymena выглядит связанной. Они использовали это как поддержку? Если да, пожалуйста, четко объясните. Кроме того, в подразделе «FAP106 - это петля Tether, состоящая из плотности Tether 1 и 2», в четвертом абзаце авторы не показали «сигнатуру плотности», которая должна быть показана на рисунке с моделью FAP106 с боковыми цепями.Является ли подпись плотности мотивом «[FHY] xWxxKxx [FHY]» (подраздел «FAP106»)? Если да, то укажите плотность рисунка и его модели на панели рисунков.

    Мы использовали Tetra как средство поддержки связи в этом регионе. Мы отразили это сейчас в Материалах и методах.

    Мы добавили мотив «[FHY] xWxxKxx [FHY]» сигнатуры плотности, как на рисунке 5 - теперь добавление к рисунку 1A.

    6) Модель FAP126. Подраздел «FAP126, гомолог FLTOP, взаимодействует с тросовой петлей, FAP106», абзац второй, авторы упомянули «WPxxxxxW».Покажите увеличенное изображение этой плотности с моделью на панели рисунков.

    Мы добавили Рисунок 6 - приложение к рисунку 1C, чтобы показать плотность мотива для поиска идентичности FAP126. Также отметьте соответствующую последовательность на рисунке 6 - приложение к рисунку 1A.

    7) Взаимодействия FAP106 и FAP126. На рисунке 5 авторы должны показать на панели рисунков, как взаимодействуют боковые цепи FAP106 и FAP126 в деталях.

    Мы улучшили рисунок 6B, чтобы выделить взаимодействие между FAP106 и FAP126.

    https://doi.org/10.7554/eLife.52760.sa2 .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *