Hb гемоглобин: Гемоглобин, правила подготовки к сдаче анализа, расшифровка результатов и показатели нормы.

Содержание

Лабораторные исследование и диагностика, цены на услуги

Экспресс-тест для качественного обнаружения гемоглобина (Hb) и гемоглобин-гаптоглобинового комплекса (Hb/Hp) в кале, используемый для скрининга предраковых заболеваний и рака толстой кишки.

Рак толстой кишки занимает второе место в структуре женской онкологической заболеваемости, уступая лишь раку молочной железы, и третье место в структуре мужской заболеваемости после рака предстательной железы и легкого в России. Для скрининга предраковых заболеваний и рака толстой кишки могут быть использованы различные методы, в том числе:

  • методы прямой визуализации: колоноскопия, гибкая сигмоидоскопия;
  • методы непрямой визуализации: компьютерная томография (КТ), магнитно-резонансная томография (МРТ), капсульная эндоскопия, бариевая клизма с двойным контрастированием;
  • исследование кала: анализ кала на скрытую кровь (гваяковая проба и иммунохимические тесты), тест на ДНК в кале.

Каждый из указанных методов имеет свои преимущества и недостатки. Так, например, методы визуализации требуют особой подготовки кишечника, часто дискомфортной и потенциально опасной для пациента. По сравнению с ними анализ кала на скрытую кровь – безболезненный и гораздо более удобный для пациента метод. С другой стороны, колоноскопию достаточно проводить один раз в 10 лет, тогда как анализ кала необходимо сдавать каждый год. В целом можно сказать, что выбор скринингового теста определяется предпочтениями пациента, возможностью медицинского центра и осведомленностью врача о новых методах. Одним из таких новых методов скрининга рака толстой кишки является анализ на скрытую кровь ColonView. Этот тест обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционной гваяковой пробой.

Тест «Colon View Hb и Hb/Hp » — это визуальный иммунохроматографический тест для обнаружения скрытых кровотечений из желудочно-кишечного тракта. Данный тест позволяет определить гемоглобин человека (Hb) и гемоглобин-гаптоглобиновый комплекс (Hb/ Hp) в образцах кала.

Наиболее распространенными и возможными причинами скрытых кровотечений могут быть следующие заболевания желудочно-кишечного тракта:

  • воспалительные заболевания кишечника;
  • дивертикулярная болезнь;
  • сосудистые аномалии (гемангиомы, телеангиоэктазии и др.)
  • эрозивно-язвенные поражения желудочно-кишечного тракта (НПВП гастро- и энтеропатии и др.)
  • аденоматозные полипы;
  • колоректальный рак.

Ранее доступные для использования тесты на скрытую кровь были основаны на гуаяковом методе и требовали соблюдения диеты с целью минимизации ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Методика теста «Colon View» основана на чувствительной и специфичной иммунохимической реакции обнаружения человеческого гемоглобина или гемоглобин/ гаптоглобинового комплекса в образцах стула, поэтому не требует соблюдения диеты и специфичен только для крови человека.

Молекула гемоглобина распадается при прохождении через желудочно-кишечный тракт. По этой причине тест только на гемоглобин специфичен лишь для диагностики кровотечения из толстого и прямого кишечника. Молекулы диссоциированного гемоглобина связываются с белком гаптоглобином с формированием гемоглобин/гаптоглобинового комплекса (Hb/Hp-комплекс). Доказано, что данный комплекс более стабилен по сравнению с гемоглобином, это означает, что Hb/Hp-комплекс может быть обнаружен даже после достаточно продолжительного пассажа через кишечник. Поэтому определение Hb/Hp-комплекс может также диагностировать кровотечения из желудочно-кишечного тракта выше уровня толстого кишечника, из верхних отделов ЖКТ. Также это означает, что может быть обнаружена кровь, выделяемая крупными кишечными полипами и распространенными карциномами. Обнаружение Hb/Hp-комплекса представляет собой значительное увеличение чувствительности при распознавании колоректальных аденом, а также в отношении карцином при комбинировании с обнаружением Hb.

В связи с тем, что некоторые новообразования кровоточат не постоянно, а периодически, а также с тем, что кровь может быть неравномерно распределена в образце кала, для получения достоверного результата рекомендуется проводить исследование на скрытую кровь несколько раз последовательно. Так, при исследовании 2 — х образцов кала, достоверность составляет 89%, при тестировании 3 – х образцов — 100%.

Иммунохимический тест не должен использоваться у пациентов, имеющих заболевания, сопровождающиеся  явными кровотечениями, такие как геморрой, анальная трещина или у женщин в период, а так же в течение 3-х дней после менструации. На ложноположительный результат может повлиять прием препаратов для разжижения крови (аспирина, варфарина)

Показания к назначению исследования:

  • скрининг патологий ЖКТ по возрасту (старше 40 лет)
  • группа риска по раку кишечника (онкология у родственников, диффузный семейный полипоз)
  • при наличии запоров, диарея, длительных болей в животе, метеоризме
  • для дифференциации анемии неясного происхождения
  • при затяжных воспалительных кишечных заболеваниях
  • перенесшим онкологические заболевания (рак шейки или тела матки, яичников)

 

Гликированный гемоглобин HbA1c, оборудование для лабораторий, описание и характеристики

Гликирование гемоглобина – это неферментная реакция между внутриэритроцитарной глюкозой и аминогруппами цепей гемоглобина. Эта реакция происходит на протяжении всего времени жизни эритроцитов. Гликированный гемоглобин накапливается в эритроцитах в течение всех 120 дней их жизни. Уровень гликированного гемоглобина, соответствующий «объединенному» значению всех гликемических изменений за последние недели, используется в качестве целевого показателя при лечении диабета, а также при диагностике сахарного диабета.

В соответствии с рекомендациями IFCC, под HbA1c понимается стабильное соединение глюкозы с N-терминальной аминокислотой β-цепи гемоглобина «A». И значение его рассчитывается по формуле

HbA1c = HbA1c / (HbA1c + HbA0)

Метод капиллярного электрофореза Sebia позволяет провести измерении HbA1c в строгом соответствии с расчетной формулой IFCC, а также определить присутствие аномальных форм гемоглобина, которые могут быть связаны с измененным временем жизни эритроцитов, т.е. вызывать физиологическую интерференцию.

Результаты. Результатом анализа является количественная оценка HbA1c, выраженная в единицах IFCC (ммоль/моль) и/или NGSP (%) в зависимости от выбора оператора. А также полный гемоглобиновый профиль пациента, свидетельствующий о нормальном или аномальном синтезе гемоглобина.

Материал для исследования. цельная кровь с антикоагулянтом K2ЭДТА или K3ЭДТА.

Пробоподготовка. гемолиз и разведение образцов полностью автоматизированы, выполняются на борту прибора.

Совместимость с прибором

№ по каталогу

Наименование набора

Кол-во тестов на набор

Capillarys 2 Flex piercing

2015

Белковые фракции гемоглобина КАПИЛЛЯРИС (CAPILLARYS Hb A1C)

720*

MINICAP

2215

Белковые фракции гемоглобина МИНИКАП (MINICAP Hb A1c)

185*

* Количество тестов в наборе может варьировать в зависимости от потока

Контрольные материалы

Все приборы Sebia

4774

Контрольная сыворотка для электрофореза Hb A1c (Hb A1c CONTROLS)

2 × 0,6 мл

Контрольные материалы

Все приборы Sebia

4755

Калибраторы для электрофореза Hb A1c (Hb A1c CALIBRATORS)

2 × 0,6 мл

Дополнительные реагенты и расходные материалы (по потребности)

Все приборы Sebia

9202

Пробирки для контролей

20 шт/уп

2058

Раствор Капиклин (CAPICLEAN)

25 мл

Каталоги и буклеты

Гликированный гемоглобин со скидкой до 50%

Срок исполнения

Анализ будет готов в течение 1 дня, исключая субботу, воскресенье и день забора. Срок может быть увеличен на 1 день в случае необходимости. Вы получите результаты на эл. почту сразу по готовности.

Срок исполнения: 2 дня, исключая субботу и воскресенье (кроме дня взятия биоматериала)

Подготовка к анализу

Заранее

Обсудите с врачом прием лекарственных препаратов накануне и в день проведения исследования крови, а также другие дополнительные условия подготовки.

Не сдавайте анализ крови сразу после рентгенографии, флюорографии, УЗИ, физиопроцедур.

Накануне

За 24 часа до взятия крови:

  • Ограничьте жирную и жареную пищу, не принимайте алкоголь.

От 8 до 14 часов до сдачи крови не принимайте пищу, пейте только чистую негазированную воду.

В день сдачи

Перед забором крови

  • 60 минут не курить,
  • 15-30 минут находиться в спокойном состоянии.

Информация об анализе

Показатель

Гликированный гемоглобин — комплекс, образованный из глюкозы, соединившейся с гемоглобином. Анализ на гликированный гемоглобин показывает содержание глюкозы в крови в динамике, то есть за период до трех месяцев.

Назначения

Благодаря исследованию можно выяснить степень развития сахарного диабета и эффективность назначенного лечения.

Специалист

Назначается терапевтом или эндокринологом.

Важно

Анализ на HbА1с не отражает резкие перепады содержания глюкозы в крови. Колебания глюкозы у пациентов с лабильным диабетом тоже не будут выявлены данным тестом.

Метод исследования — Высокоэффективная жидкостная хроматография

Материал для исследования — Венозная кровь с ЭДТА

Состав и результаты

Гликированный гемоглобин

Узнайте больше о популярных анализах:

Что можно и нельзя перед анализом крови?

Как расшифровать общий и биохимический анализы крови?

Биохимические исследования крови – значение и важность

Основной задачей врача при лечении сахарного диабета является нормализовать уровень глюкозы в крови. Контролировать данный метаболит в крови больной может либо самостоятельно (портативными глюкометрами), либо в лаборатории. По разовому определению глюкозы крови можно судить лишь о концентрации глюкозы на момент взятия, поэтому предполагать о состоянии углеводного обмена пациента между измерениями не представляется возможным. Чтобы оценить углеводный обмен у пациента за более длительный промежуток времени необходимо провести тест на содержание гликированного гемоглобина (HbA1c) в крови.

Согласно данным, полученным в результате проведённого Национальным институтом диабета, болезней пищеварения и почек (США) 10-ти летнего исследования под названием DCCT (The Diabetes Control and Complications Trial) в США и Канаде в 1983-1993 годах, было установлено, что контроль уровня гликемии, скоррелированный по уровню концентрации HbA1c, напрямую связан с риском развития отдаленных осложнений диабета 1 типа и их прогрессированием. Специалистами из Великобритании в 1999 году было показано, что снижение содержания глюкозы в сыворотке пациента, оцененное по концентрации HbA1с, уменьшает количество микроангиопатий при сахарном диабете 2 типа.

Гликированный гемоглобин это гемоглобин, в котором молекула глюкозы неферментативно соединена с β- концевым валином β – цепей глобина гемоглобина А1 и обозначается как HbA1c. Содержание HbA1c имеет прямую корреляцию с уровнем глюкозы крови. В норме концентрация HbA1c от 4,4 до 6,1%, у больных сахарным диабетом его уровень зависит от степени гипергликемии и обычно в 2 – 3 раза превышает нормальные величины. Гликированный гемоглобин накапливается внутри эритроцитов и сохраняется в течение всего периода циркуляции эритроцита в кровяном русле, что составляет около 60 суток. Таким образом, концентрация HbA1c отражает степень гликемии за 60 – 90 дней до исследования. Множественные исследования измерения содержания глюкозы традиционными методами подтвердили взаимосвязь HbA1c и уровня гликемии пациента. Результаты исследований DCCT, проведённых в 90-х годах, подтвердили гипотезы о том, что уровень HbA1c напрямую связан с уровнем глюкозы в крови и является наиболее целесообразным критерием при мониторинге эффективности лечения больных сахарным диабетом.

В начале 90-х годов не существовало единой международной согласованной стандартизации измерения гликозилированного гемоглобина, что снижало клиническую эффективность использования данного теста. Чтобы достигнуть единого стандарта и преодолеть проблемы связанные с его выработкой, Международная федерация клинической химии (IFCC) создала в 1993 году Рабочую группу по стандартизации оценки HbA1c. Результатом ее работы стала Национальная программа по стандартизации исследований гликозилированного гемоглобина (NGSP). Большинство производителей приборов и наборов для анализа крови на гликозилированный гемоглобин обязали проходить проверку на соответствие результатов с данными, полученными референсными методами. Если результат проверки удовлетворяет референсным данным, производителю выдаётся «сертификат соответствия NGSP». Американская Диабетическая Ассоциация (ADA) рекомендует всем лабораториям использовать тесты для анализа крови на гликозилированный гемоглобин сертифицированные NGSP.

Существует множество аналитических методов, позволяющих определять HbA1c. К таким методам относятся электрофорез, жидкостная хроматография, аффинная хроматография, иммунологические методики, колоночные методики. Одним из основных критериев при выборе анализатора для выполнения анализа крови на гликированный гемоглобин является наличие референсного метода NGSP, каким является жидкостная хроматография. При использовании стандартизованных методов исследования лаборатория имеет возможность сравнивать полученные результаты с данными, полученными с помощью референсных методов. Такое сравнение максимально повышает достоверность результатов исследований.

Несомненную важность представляет использование в работе лечащего врача только таких результатов исследований, которые получены в лабораториях, использующих тесты для анализа крови на гликированный гемоглобин, сертифицированные NGSP.

Гемоглобин и железо: информация для доноров крови — Консультирование доноров крови: руководство по внедрению

Каждый раз, когда вы приходите сдавать кровь или тромбоциты, мы проверяем уровень вашего гемоглобина. Гемоглобин (Hb) — это белок, содержащийся в красных кровяных тельцах, который переносит кислород в ваше тело и придает крови красный цвет. Уровень гемоглобина варьируется от человека к человеку. Мужчины обычно имеют более высокий уровень, чем женщины. Для сдачи крови устанавливается «пороговый» уровень гемоглобина, чтобы гарантировать, что ваш гемоглобин не упадет ниже нормы после того, как вы сдали кровь.Нормальные диапазоны гемоглобина различаются между этническими группами, мужчинами и женщинами, а также зависят от возраста, особенно у женщин. Люди с уровнем гемоглобина ниже нормального диапазона по определению анемичны. Есть много причин анемии, и анемия из-за дефицита железа является распространенным явлением.

Что будет дальше?

Если ваш уровень гемоглобина ниже порогового значения, вы не сможете сдавать кровь до тех пор, пока у вас не будет дополнительных анализов, чтобы узнать причину вашего низкого гемоглобина, получить лечение от этого состояния и иметь нормальный уровень гемоглобина. выше уровня отсечки.Мы хотим, чтобы вы вернулись как можно скорее, чтобы сдать кровь, но ваше здоровье превыше всего. Поэтому важно подождать некоторое время, чтобы ваш гемоглобин достиг нормального уровня. Мы надеемся, что в следующий раз, когда вы придете сдавать кровь, ваш гемоглобин будет выше порогового значения и вы больше не будете разочарованы.

Подробнее о железе

Железо очень важно, поскольку оно помогает организму вырабатывать гемоглобин. Вы отдаете железо, когда сдаете кровь, и поэтому донорам крови еще более необходимо есть много железосодержащих продуктов.

Откуда железо?

Поскольку железо содержится в различных продуктах, вы обычно можете получать его в достаточном количестве из сбалансированной диеты. Основными источниками железа являются мясо и мясные продукты, крупы и продукты из них, а также овощи.

Что я могу сделать, чтобы повысить уровень железа?

Железо плохо усваивается организмом, поэтому всем нам необходимо его регулярное поступление. Старайтесь придерживаться хорошо сбалансированной диеты. Кроме того, каждый день старайтесь съедать три порции пищи, которая является хорошим источником железа.Сокращение количества закусок и сладких продуктов, которые содержат очень мало железа, также поможет.

Эти продукты хорошие источники железа:

  • импульсов и бобов

  • яйца

  • яйца

  • хлопья завтраки — некоторые хлопья укреплены из железа

  • постное красное мясо, Турция и цыпленок

  • Рыба — в том числе замороженные и консервированные рыбы, такие как скумбрия, сардины, лосось и pilchards

  • гайки

  • коричневый рис

  • TOFU

  • хлеб — особенно цельная еда или коричневый хлеб

  • листовые зеленые овощи – особенно шпинат, кудрявая капуста, кресс-салат и брокколи

  • Сухофрукты – особенно абрикосы, изюм и чернослив.

Количество животных жиров в вашем рационе должно быть минимальным. Поэтому при употреблении мяса старайтесь выбирать нежирное мясо. Также лучше готовить пищу на гриле, на пару, в духовке или в микроволновой печи, а не жарить ее. Примечание о чае: чай может уменьшить усвоение железа из продуктов. Не пейте чай непосредственно перед, после или во время еды.

Витамин С

Витамин С (аскорбиновая кислота) помогает усваивать больше железа. Поэтому, чтобы получить максимальную отдачу от пищи, которую вы едите, употребляйте во время еды продукты, богатые витамином С: например, свежие фрукты и овощи или напитки, такие как свежевыжатый апельсиновый сок.

Что делать, если я вегетарианец или веган?

Хотя организму труднее усваивать железо из не мясных источников, люди, соблюдающие хорошо сбалансированную диету, должны получать достаточное количество железа из своего рациона.

Нужно ли мне принимать таблетки железа?

Большинство людей должны иметь возможность получать все необходимое им железо, питаясь разнообразной и сбалансированной пищей, и им не нужно принимать железосодержащие добавки или таблетки. Таблетки железа следует принимать только в том случае, если ваш врач посоветовал вам их принимать.

Устарели ли пороговые значения гемоглобина для анемии?

Установленные ВОЗ давние пороговые значения гемоглобина для анемии не соответствуют действительности для людей во всем мире, как показало перекрестное исследование.

Сводные оценки гемоглобина пятого процентиля составили 9,65 г/дл для детей и 10,81 г/дл для женщин по результатам 27 исследований питания в 25 странах с низкой дисперсией этих оценок между исследованиями, сообщил О.Йо Аддо, доктор философии, CDC и Университет Эмори в Атланте, и его коллеги.

В соответствии с этим открытием, графики концентрации гемоглобина в зависимости от растворимого рецептора трансферрина (биомаркера тканевого дефицита железа и физиологического показателя эритропоэза) показывают компенсаторное усиление эритропоэза, когда гемоглобин падает ниже 9,61 г/дл у детей и 11,01 г/дл у женщин, они отметили в JAMA Network Open .

Таким образом, недавно рассчитанные многонациональные оценки гемоглобина в пятом процентиле больше 1.На 0 г/дл ниже текущих пороговых значений ВОЗ для определения анемии у практически здоровых людей: 11,0 г/дл для детей до 5 лет и 12,0 г/дл для небеременных женщин.

Авторы исследования заявили, что это изменение подтверждается другими исследованиями, в которых также содержится призыв к снижению пороговых значений гемоглобина примерно на 1,0 г/дл.

Кроме того, они заявили, что их результаты «поддерживают использование объединенного многонационального пятого процентиля Hb [гемоглобина] для определения анемии, в отличие от принятия оценок Hb, которые специфичны для обследования, страны или расы / этнической принадлежности, что может привести к распространению множественных различных пороговых значений гемоглобина и, таким образом, усложняют их клиническое применение и количественную оценку глобального бремени болезни, помимо других факторов.»

Выпущенные в 1968 году пороговые значения ВОЗ были основаны на небольших исследованиях европейцев и канадцев, а затем подтверждены с использованием населения США.

«Оценка пороговых значений Hb ВОЗ была предметом активных исследований на протяжении десятилетий. Эти пороговые значения были получены на основе статистических пороговых значений, не связанных с физиологическими исходами или последствиями для здоровья. Кроме того, уместность этих пороговых значений для определения анемии среди определенных групп населения, возрастных групп , и этническая принадлежность неоднократно подвергалась сомнению», — написали Аддо и его коллеги.

Анемия определяется как уровень гемоглобина, слишком низкий для удовлетворения физиологических потребностей человека.

Тем не менее, оценка других факторов, связанных с анемией (например, малярия, витамин А, витамин В12, фолиевая кислота и наследственные заболевания крови), также имеет решающее значение для управления анемией, предупредила группа Аддо.

Поперечное исследование было основано на выборке здоровых детей из 13 445 детей (средний возраст 32,9 месяца, 50,2% мальчиков) и 25 880 небеременных женщин (средний возраст 31,0 год) после исключения детей с дефицитом железа, дефицитом витамина А, воспалением или малярия.

Оценки пятого процентиля гемоглобина по данным исследования варьировались от 7,90 г/дл (в Пакистане) до 11,23 г/дл (в США) для детей и от 8,83 г/дл (в Гуджарате, Индия) до 12,09 г/дл (в США) для женщин.

Результаты исследования сохранялись при использовании более высоких пороговых значений ферритина для определения дефицита железа.

Отсутствие единообразия в лабораторных оценках гемоглобина было главным предостережением исследования, признали авторы.

Кроме того, пороговые значения гемоглобина были получены без учета медицинских записей, что исключало возможность анализа связи гемоглобина с клиническими исходами.

  • Николь Лу — репортер MedPage Today, где она освещает новости кардиологии и другие разработки в области медицины. Подписаться

Раскрытие информации

Аддо сообщил об отсутствии раскрытия информации.

Один соавтор сообщил о получении грантов от Фонда Билла и Мелинды Гейтс помимо представленной работы.

Включите JavaScript, чтобы просматривать комментарии с помощью Disqus.

Оптическое поглощение гемоглобина

Скотт Прал

Аналоги

Одна из самых запутанных вещей при просмотре спектров гемоглобина (Hb). заключается в том, что значения обычно приводятся в таблице в эквивалентах.Термин «эквивалент» используется для обозначения количества гемоглобина, содержит 1 г атома Fe и соединяется с 1 г молекулы O 2 или CO. Предполагается, что один эквивалент гемоглобина равен 64 500/4 или 16 125 г. Концентрация 10 -6 эквивалентов составляет 16,125 мг гемоглобина на кубический сантиметр.

Таким образом, эквивалентов в четыре раза больше, чем молекул гемоглобина.

Несмотря на то, что другие используют эквиваленты, я представлю окси и спектры дезоксигемоглобина в пересчете на молярный коэффициент экстинкции.Чтобы преобразовать молярный коэффициент экстинкции e в оптическую плотность A , умножить на молярную концентрацию и длина пути. Например, если 90 143 x 90 144 — это количество граммов на литр. и кювета на 1 см, то абсорбция определяется выражением

        (e) [(1/см)/(моль/литр)] (x) [г/литр] (1) [см]
  А = ------------------------------------------------ ---
        64 500 [г/моль]
 
используя 64 500 в качестве молекулярной массы гемоглобина в граммах.
Связывание кислорода изменяет спектры

Если молекула гемоглобина связана с кислородом, то имеется оксигемоглобин или Hb0 2 . Если молекула гемоглобина связана с монооксидом углерода, то это карбоксигемоглобин или HbCO. Если молекула гемоглобина ничем не связана, то это дезоксигемоглобин или Hb. Если молекула гемоглобина расщеплена, то получается мет-гемоглобин. Все они имеют разные спектры.

На приведенном ниже графике показана наилучшая оценка спектра Hb и HbO 2 из различные источники Скотт Прал.(табличные данные)

Ниже приведено сравнение данных Моавени (точки) с моими скомпилированными значениями (кривая).

Ниже приведено сравнение данных Такатани (точки) с моими скомпилированными значениями (кривая).

Цельная кровь

Гемоглобин имеет нормальную концентрацию 150 г/л крови, что позволяет цельной крови переносить 65 раз больше кислорода, чем в плазме при P O2 100 мм рт.ст. Гематокрит определяет долю крови, состоящую из эритроцитов. То эритроциты в основном состоят из гемоглобина (95% сухой массы).

Когда артериальная кровь насыщена на 90%, некоторые молекулы гемоглобина имеют четыре связанных кислорода, у некоторых три, а у некоторых два или один. То статистическое среднее всего кислорода, связанного с молекулами гемоглобина, по отношению к общему количеству, которое может быть связано его насыщение кислородом. Один грамм O 2 функционального гемоглобин сочетается с 1,34мл O 2 , емкость O 2 нормальная кровь это

(150 г Hb/литр)(1,34 мл O 2 г Hb) = 200 мл O 2 /литр.


Но мне просто нужен типичный спектр крови в единицах, которые я могу понять…

Хватит ныть.

Предположим, 150 г гемоглобина/литр. Затем, чтобы преобразовать молярный коэффициент экстинкции и по коэффициент поглощения, умножить на молярная концентрация и 2,303,

μ a (лямбда) = (2,303) e (лямбда) (150 г/л)/(64 500 г Hb/моль)
= 0,0054 e (лямбда)

где μ a в (см -1 ) и e (лямбда) это молярная коэффициент ослабления для интересующей длины волны.

границ | Патофизиология внеклеточного гемоглобина, связанного с усилением окислительных реакций

Введение

Функциональная роль эритроцитов (эритроцитов) заключается в транспортировке кислорода от легких к тканям, обеспечивая кислород, необходимый всем клеткам и тканям. Гемоглобин (Hb) составляет 95–97% цитозольных белков внутри эритроцитов, а обратимое связывание кислорода с гемоглобином обеспечивает механизм транспорта кислорода эритроцитами. Кислород связывается с гемоглобином в легких при высоком парциальном давлении кислорода и выделяется в ткани при пониженном парциальном давлении кислорода в микроциркуляторном русле.Однако существует непрерывное медленное самоокисление Hb, связанного с кислородом, с образованием супероксида, который превращает функциональный Hb-Fe(II) в окисленный Hb-Fe(III), который больше не связывает кислород (уравнение 1).

Hb-Fe(II)O2↔Hb-Fe(III)+O2·-    (1)

Перекись водорода (H 2 O 2 ) образуется во время автоокисления гемоглобина в результате спонтанной и ферментативной дисмутации супероксида (уравнение 2).

2O2·−+2H+→h3O2+O2    (2)

В интактных эритроцитах есть ферменты, которые восстанавливают окисленный гемоглобин обратно до функционального Fe(II)-Hb.Кроме того, активные формы кислорода (АФК), H 2 O 2 и супероксид, нейтрализуются обширной антиоксидантной системой эритроцитов, включающей как неферментативные низкомолекулярные антиоксиданты, такие как глутатион, витамин Е и аскорбиновая кислота, так и ферментативные ферменты. антиоксиданты, включая супероксиддисмутазу, каталазу (Gonzales et al., 1984), глутатионпероксидазу (Nagababu et al., 2003) и пероксиредоксин-2 (Lee et al., 2003; Nagababu et al., 2013). Учитывая большой пул Hb и постоянную медленную реакцию самоокисления, интактные эритроциты защищают организм от потенциального основного источника окислительного стресса.

Единственная ненейтрализованная АФК, генерируемая интактными эритроцитами, включает небольшую фракцию гемоглобина, которая связывается с мембраной эритроцитов. АФК, образующиеся вблизи мембраны, менее доступны для клеточной антиоксидантной системы, которая в основном локализована в цитоплазме. Кроме того, эти АФК образуются там, где они могут повредить мембрану эритроцитов и/или высвобождаться из клетки, повреждая другие клетки и ткани.

Вклад гемоглобин-мембранных взаимодействий усиливается в микроциркуляторном русле, где Hb частично оксигенируется.Частичная оксигенация приводит к конформационному изменению Hb, которое вызывает резкое увеличение скорости автоокисления и сродства Hb к мембране RBC (Cao et al. , 2009). Повышенное самоокисление цитоплазматического гемоглобина и последующее образование АФК все еще могут быть нейтрализованы цитоплазматической антиоксидантной системой. Однако частичная оксигенация приводит к значительному увеличению образования АФК на мембране. Тем не менее, потенциальный источник окислительного стресса, связанного со связыванием с мембраной, ограничен тем фактом, что даже в оптимальных условиях менее 1% внутриклеточного гемоглобина может взаимодействовать с мембраной в любое время.

Внеклеточный гемоглобин как источник окислительного стресса

Внеклеточный гемоглобин, возникающий в результате гемолиза эритроцитов или инфузии бесклеточных кровезаменителей на основе гемоглобина, может быть основным источником окислительного стресса. В нормальных условиях этот потенциальный источник окислительного стресса минимизируется гаптоглобином и гемопексином, которые связывают гемоглобин и свободный гем соответственно. Они ингибируют окислительные реакции гемоглобина и гема и облегчают их удаление из кровотока. Было показано, что повышенные уровни свободного внеклеточного гемоглобина и гема, которые не могут быть нейтрализованы реакцией с гаптоглобином и гемопексином, вызывают множественные неблагоприятные клинические эффекты.

Механизмы этих патофизиологических эффектов широко обсуждались. Большой интерес в последние годы был направлен на реакцию NO с Hb (Rother et al., 2005), которая снижает уровень NO, доступного для многих важных функций. К ним относятся регуляция сосудистого тонуса, расслабление гладкой мускулатуры, адгезия нейтрофилов к эндотелиальным клеткам (ЭК) и активация тромбоцитов. Удаление NO внеклеточным гемоглобином явно имеет значительные патологические эффекты.

Однако необходимо также учитывать патологические эффекты, связанные с окислительными реакциями внеклеточного гемоглобина.

Повышенное самоокисление

Окислительные реакции, происходящие в эритроцитах, значительно усиливаются на участке мембраны, где внутриклеточная антиоксидантная система становится неэффективной. Потенциальный окислительный стресс, вызванный внеклеточным гемоглобином, дополнительно усугубляется резким увеличением скорости самоокисления частично оксигенированного гемоглобина, образующегося в микроциркуляторном русле, а также увеличением скорости самоокисления димеров гемоглобина, образующихся при диссоциации тетрамера гемоглобина на димеры. Рисунок 1) при сниженной концентрации Hb в плазме (Zhang et al., 1991). Более низкая молекулярная масса димеров гемоглобина также способствует перемещению гемоглобина из кровотока в сосудистую систему и другие ткани, чувствительные к окислительным реакциям гемоглобина (рис. 1).

Рисунок 1. Схема, иллюстрирующая различные реакции, происходящие с внеклеточным гемоглобином .

В случае внеклеточного гемоглобина нам нужно иметь дело не только с реакцией самоокисления и последующим образованием супероксида и H 2 O 2 , но нам необходимо рассмотреть вторичные окислительные реакции, включающие реакции H 2 O 2 с Хб. Также было показано, что прямая реакция H 2 O 2 с железом Fe(II)-гемоглобина может претерпевать реакцию Фентона с образованием высокореакционноспособного гидроксильного радикала (уравнение 3) (Sadrzadeh et al., 1984). ).

h3O2+Fe(II)→·OH+OH−+Fe(III)    (3)

На потенциальное значение этой реакции указывает обнаружение гидроксильных радикалов в серповидных эритроцитах (Hebbel, 1985). Из-за их высокой реакционной способности любое образование гидроксильных радикалов может привести к повреждению клеток и тканей.

Вторичные реакции окисления, включающие высвобождение гема и образование феррилгемоглобинов

Двухэлектронное окисление Fe(II)-Hb с помощью H 2 O 2 (уравнение 4) дает Fe(IV)-ferrylHb (рис. 1).

Hb(II)+h3O2→Hb(IV)=O    (4)

Хотя ferrylHb может быть источником окислительного повреждения, токсические эффекты, связанные с реакциями ferrylHb, не были продемонстрированы. Однако было показано, что ferrylHb реагирует с дополнительной молекулой H 2 O 2 (уравнение 5)

Hb(IV)=O+h3O2→Hb(III)+O2·−→гем деградация                 продукты+Fe(III)    (5)

, что приводит к деградации гема и высвобождению флуоресцентных продуктов деградации гема и свободного железа (рис. 1) (Nagababu and Rifkind, 1998, 2000).Было показано, что увеличение этих продуктов деградации гема указывает на усиление окислительного стресса (Nagababu et al., 2008a,b), хотя специфические токсические реакции с участием этих продуктов не установлены. Однако хорошо известно, что повышенный химический состав Фентона с участием свободного железа (Winterbourn, 1995) и увеличение содержания свободного железа при различных патологиях, возможно, связано с этой реакцией деградации гема (Nagababu and Rifkind, 1998).

Повышенное образование супероксида и H 2 O 2 из-за самоокисления внеклеточного Hb также приводит к окислению функционального двухвалентного Hb до Fe(III)metHb (уравнение 1).Хотя высокие концентрации metHb (гемоглобинурия) связаны с нарушением функции почек (Tracz et al., 2007), прямые патологические эффекты Fe(III)Hb не установлены. Однако гем, который имеет более низкое сродство к metHb, чем железосодержащий Hb, диссоциирует от metHb (Bunn and Jandl, 1968) (рис. 1). Гем, низкомолекулярная гидрофобная молекула, поглощается клеточными мембранами, белками плазмы и липидами. Сообщалось, что его реакция с липопротеинами низкой плотности приводит к образованию более токсичных окисленных липопротеинов низкой плотности (Balla et al., 1991). Связанный с белками плазмы, такими как альбумин, он также перемещается в различные ткани (Schaer et al., 2013), где может в дальнейшем вызывать токсические эффекты. Гем может связываться с определенными рецепторами, факторами транскрипции и ферментами. Эти взаимодействия могут изменять клеточную функцию, метаболизм и транскрипцию генов. Измененная транскрипция гена является основой гем-индуцированного провоспалительного эффекта (рис. 1) (Wagener et al., 2001b).

Двухэлектронное окисление Fe(III)Hb с помощью H 2 O 2 дает оксиферрилHb

Hb(III)+h3O2→·Hb(IV)=O+h3O    (6)

ОксиферрилHb нестабилен с миграцией неспаренного электрона к глобину с образованием радикалов с участием tyr-24, tyr-42 и his-20 альфа-цепи и tyr-35, tyr-130 и cys-93 бета-цепь (Детердинг и др. , 2004). Эти продукты обладают высокой реакционной способностью, и было показано, что они образуют сшитые мультимеры гемоглобина (Nagy et al., 2010). Было показано, что OxyferrylHb, как и metHb, высвобождает гем. Однако oxyferryl и/или образующиеся в результате мультимеры без диссоциирующего гема действуют как провоспалительные агонисты, атакующие эндотелий сосудов (Silva et al., 2009).

Сообщалось, что как гем, так и oxyferrylHb являются провоспалительными агонистами (рис. 1), что приводит к активации окислительно-восстановительного фактора транскрипции NF-κB.Однако задействованы два разных пути. Провоспалительный эффект oxyferrylHb запускается взаимодействием мультимерных гидрофобных агрегатов, распознаваемых врожденными рецепторами (Silva et al., 2009). Это разрушает мембраны и вызывает воспаление посредством пути передачи сигнала IL-1/1L-1Ra. Однако гем может связываться с TLR4 (Teng et al., 2009). Взаимодействие с TLR4 индуцирует активацию NF-κB (Lin et al., 2012).

Патологические эффекты, связанные с окислительными реакциями гемоглобина

При попытке оценить патологические эффекты окислительных реакций с участием внеклеточного гемоглобина в первую очередь следует обратить внимание на влияние на липопротеины плазмы и сосудистую сеть, с которыми гемоглобин вступает в непосредственный контакт.

Липопротеины и сосудистая сеть

Считается, что окисление липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) играет важную роль в инициировании атерогенеза (Steinbrecher et al., 1984). Окисление ЛПНП запускается поглощением гема ЛПНП. Сообщалось, что ЛПНП, обладающие высокой гидрофобностью, способны конкурировать с гемопексином и альбумином за свободный гем, при этом 80% гема, добавленного в плазму, немедленно поглощаются липопротеинами (Miller and Shaklai, 1999). Окислительные реакции ЛПНП включают низкие уровни гидроперекисей липидов или оксидантов, что приводит к окислительной деградации гема и высвобождению гемового железа (Sadrzadeh and Eaton, 1988).Считается, что именно это свободное железо приводит к ускоренному окислению полиненасыщенных жирных кислот и других компонентов ЛПНП.

Было показано, что атеросклеротические бляшки и особенно разрушенные бляшки (Nagy et al., 2010) лизируют эритроциты и окисляют высвобожденный Hb с образованием metHb, свободного гема, свободного железа и продукта окисления Fe(IV)Hb, oxyferrylHb. Обнаружены также дитирозин и сшитые гемоглобины, образующиеся в результате образования оксиферрилHb. В дополнение к гему, высвобождаемому из metHb, было показано, что гем высвобождается из oxyferrylHb.Повышенное высвобождение гема и свободного железа из-за взаимодействия бляшек с эритроцитами еще больше усиливает окисление компонентов бляшек, что приводит к цитотоксическим реакциям, затрагивающим эндотелий (Nagy et al., 2010).

Считается, что обсуждаемые окислительные реакции в первую очередь связаны с высвобождением гема и железа. Однако исследования in vitro продемонстрировали, что oxyferrylHb также действует как провоспалительный агонист (Silva et al., 2009). Исследования in vitro показали, что oxyferrylHb индуцирует образование F-актиновых стрессовых волокон, что приводит к образованию межклеточных промежутков, нарушающих целостность эндотелия.Это приводит к экстраваскулярной утечке. Эта утечка активирует семейство факторов транскрипции κB, индуцирующих экспрессию провоспалительных генов, таких как E-селектин, ICAM-1 и VCAM-1. Кроме того, oxyferrylHb активирует пути передачи сигнала с участием p38 MAPK и JNK. Было показано, что этот провоспалительный ответ увеличивает проницаемость ЭК и усиливает адгезию моноцитов. Комбинированные окислительные эффекты, обусловленные как metHb, oxyferrylHb, так и свободным гемом, усиливают окисление липидов бляшек, в то время как провоспалительные эффекты oxyferrylHb вызывают эндотелиальную цитотоксичность.В совокупности эти процессы играют значительную роль в патологии, связанной с атеросклерозом.

Почечная дисфункция

В дополнение к окислительным реакциям, затрагивающим липопротеины и сосудистую сеть, почечная дисфункция является основной патологией, возникающей в результате окислительных реакций, связанных с внеклеточным гемоглобином. Эта патология провоцируется поглощением димеров гемоглобина клубочками почек. Димеры гемоглобина образуются из внеклеточного гемоглобина за счет диссоциации тетрамерного гемоглобина на димеры (Акерс и Халворсон, 1974) при пониженной концентрации гемоглобина в плазме. Пониженная молекулярная масса димеров гемоглобина (32 кДа вместо 64 кДа) облегчает их перенос в ткани. Однако поглощение димеров гемоглобина наиболее выражено в почках, предназначенных для удаления свободного гемоглобина из кровотока.

Как обсуждалось выше, обширная антиоксидантная система эритроцитов серьезно ограничивает окислительные реакции с участием внутриклеточного гемоглобина. Антиоксидантная способность плазмы значительно меньше по сравнению с эритроцитами. Тем не менее, восстанавливающая способность аскорбиновой кислоты и уратов в плазме приводит к относительно низким уровням окисленного гемоглобина в плазме (Butt et al., 2010). Димеры гемоглобина, перемещаемые в почки, подвергаются гораздо более жесткой окислительной среде, о чем свидетельствуют высокие уровни metHb в моче при наличии повышенного уровня бесклеточного гемоглобина (Boretti et al., 2009). Повышенное окисление гемоглобина в почках также приводит к последующему высвобождению свободного гема. Свободный гем в почках, а также в других органах индуцирует гемоксигеназу-1, которая превращает гем в билирубин с антиоксидантной активностью (Stocker et al. , 1987). Избыток гема в почках, а также в других органах и тканях вызывает ряд цитотоксических эффектов.

Гидрофобный гем в клеточных мембранах может окислять липиды, денатурировать белки и нарушать целостность прикрепленного цитоскелета. Гем может окислительно денатурировать ДНК и нарушать активность цитозольных ферментов, включая глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу и глутатионредуктазу. Гем также может активировать повреждающие клетки ферменты, такие как каспазы и катепсины (Tracz et al., 2007). Гем влияет на функцию митохондрий, вызывая начальное усиление дыхания с последующим снижением и окончательным прекращением потребления кислорода (Nath et al., 1998). Даже относительно низкие уровни гема становятся цитотоксичными в присутствии H 2 O 2 , которые могут разрушать гем с образованием свободного железа.

В дополнение к прямым окислительным реакциям с участием гема было также показано, что повышенные уровни гема имеют провоспалительный эффект (см. выше). Исследования сосудистой системы (Silva et al., 2009) предполагают, что metHb не оказывает провоспалительного действия, и сообщалось об эффектах, связанных с metHb (Liu and Spolarics, 2003; Silva et al., 2009) может быть связано с контаминацией эндотоксинами. Однако есть четкие доказательства того, что гем, который легко диссоциирует от metHb, действительно оказывает провоспалительное действие даже в отсутствие эндотоксина (Fortes et al., 2012).

Индуцированный гем провоспалительный эффект в почках индуцирует хемоаттрактантный белок-1 моноцитов хемокинов (MCP-1) и изоформу 1 трансформирующего фактора роста b1 (TGF-бета-1) путем активации окислительно-восстановительного фактора транскрипции NF-κB (Kanakiriya et др., 2003). Считается, что возникающее в результате повышение уровня хемокинов и другие провоспалительные реакции способствуют канальцево-интерстициальному заболеванию (Qian et al., 2010), снижение почечной перфузии и внутриканальцевые цилиндры, образующиеся при взаимодействии белков гема с белком Тамма-Хорсфалла (Tracz et al. , 2007). Патология белка Тамма-Хорсфалла (Hoyer and Seiler, 1979) может привести к хронической почечной дисфункции.

Другие токсические эффекты, обусловленные окислительными реакциями гемоглобина

Хотя эти эффекты, как правило, наиболее выражены в почках, которые играют основную роль в удалении внеклеточного гемоглобина из организма, аналогичные эффекты наблюдаются и в других тканях, где гемоглобин перемещается из плазмы в ткани и подвергается воздействию повышенных окислительных условий.Было показано, что провоспалительные эффекты свободного гема вызывают активацию молекул адгезии в других органах, включая кишечник, печень и поджелудочную железу (Wijayanti et al., 2004). Это повышенное прилипание приводит к рекрутированию лейкоцитов и увеличению проницаемости сосудов (Wagener et al., 2001b). Эти эффекты особенно важны в пораженных и воспаленных тканях или после ишемического инсульта, когда в ткани присутствуют другие оксиданты. Также было показано, что провоспалительные эффекты гема вызывают запрограммированный некроз макрофагов (Fortes et al. , 2012) и участвовать во внутримозговых кровоизлияниях (Simoes et al., 2013). Было показано, что при серповидно-клеточной анемии гем, выбрасываемый в кровоток, вызывает экспрессию молекул эндотелиальной адгезии, что приводит к увеличению адгезии лейкоцитов и ретикулоцитов к эндотелию (Wagener et al., 2001a). Также было показано, что свободный гем вызывает тяжелую малярию, особенно церебральную малярию (Ferreira et al., 2008). Это связано с нарушением гематоэнцефалического барьера и адгезией инфицированных эритроцитов к эндотелию микрососудов головного мозга.Считается, что в этих процессах участвуют АФК, но приверженность может включать гем-индуцированную воспалительную реакцию. Таким образом, комбинированные эффекты внутренних окислительных реакций и окислительных реакций, запускаемых в результате воспаления, играют важную роль в патологии, возникающей в результате повышения концентрации внеклеточного гемоглобина.

Физиологические источники бесклеточного гемоглобина

В нормальных условиях происходит минимальный лизис эритроцитов до того, как состарившиеся клетки удаляются из кровотока. Таким образом, уровень бесклеточного гемоглобина в циркуляции минимален. Повышение уровня внеклеточного гемоглобина происходит, когда скорость лизиса эритроцитов увеличивается, а удаление внеклеточного гемоглобина из кровотока происходит медленнее, чем образование дополнительного гемоглобина в результате лизиса клеток.

Повышенный лизис эритроцитов in vivo возникает вследствие одного из двух классов патологических ситуаций.

(1) Модификации эритроцитов, снижающие их стабильность и усиливающие лизис по мере прохождения клеток через систему кровообращения.Эти изменения обычно связаны с изменением генов, которые контролируют производство и функцию эритроцитов. Это может повлиять на гемоглобин, мембрану эритроцитов или ферменты, необходимые для правильного функционирования эритроцитов. Например, при серповидноклеточной анемии и талассемии измененные гемоглобины менее стабильны, что приводит к усилению внутриклеточных окислительных реакций, которые повреждают клеточную мембрану и усиливают лизис эритроцитов (Nagababu et al. , 2008a). Серповидноклеточная анемия связана с мутацией остатка B6, которая приводит к тенденции гемоглобина к агрегации, что приводит к значительному сокращению жизни клеток (Wagener et al., 2001а). При талассемии адекватные уровни альфа- или бета-цепи не вырабатываются, и поэтому происходит нарушение стабильной четвертичной структуры гемоглобина (Kidd et al., 2001), что приводит к нарушению стабильности и усилению лизиса эритроцитов.

Примерами измененной структуры мембран являются наследственный сфероцитоз и наследственный эллиптоцитоз, при которых эритроциты имеют сферическую и эллиптическую форму, соответственно, вместо нормальных клеток двояковогнутой формы (Da et al., 2013). Измененные клетки менее деформируемы и с трудом проходят через узкие капилляры в микроциркуляторное русло, что приводит к повышенному лизису клеток.Пароксизмальная ночная гемоглобинурия также приводит к изменению структуры мембран эритроцитов (Basu et al., 2010), что приводит к увеличению тромбов в венах.

Примерами измененной активности ферментов, которые влияют на способность эритроцитов противостоять окислительному стрессу, являются дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD) (Rochford et al., 2013) и дефицит пируваткиназы (Abdel et al., 2010). G6PD играет важную роль в сбросе фосфатов, который помогает поддерживать антиоксидантную активность эритроцитов, а пируваткиназа является важным ферментом, участвующим в метаболизме глюкозы и производстве АТФ.В результате измененная метаболическая активность приводит к усилению окислительного стресса и усилению клеточного лизиса.

In vitro или in vivo Процессы, нагружающие мембраны эритроцитов, способствуют механической гемолитической анемии. Этот процесс аналогичен повышенному лизису, который происходит в некоторых аномальных Hbs с измененной формой клеток (см. выше) и при серповидно-клеточной анемии, когда серповидность вызывает снижение деформируемости. Ряд применяемых обработок также оказывает механическое воздействие на мембрану эритроцитов и может вызвать повышенный лизис. Это включает в себя искусственный сердечный клапан, гемодиализ при почечной недостаточности, аппарат искусственного кровообращения, используемый для операций на открытом сердце, преэклампсии и злокачественной гипертензии.

(2) Ситуации, когда эритроциты могут быть нормальными, но болезни вызывают лизис эритроцитов. Аутоиммунная гемолитическая анемия (АИГА) представляет собой ситуацию, при которой иммунная система вырабатывает антитела, атакующие эритроциты (Wakui et al., 1988). Хотя неизвестно, что вызывает АИГА, некоторые заболевания или инфекции, сопровождающиеся воспалением, такие как волчанка, гепатит и ВИЧ, повышают риск АИГА.Аллоиммунная гемолитическая анемия (Odabas et al., 2002) связана с образованием антител против крови, полученной при переливании крови, если перелитая кровь отличается от крови пациента. Лекарственно-индуцированная гемолитическая анемия вызывается некоторыми лекарствами, такими как те, которые используются в химиотерапии или лекарствами, используемыми для лечения малярии. Многие болезненные ситуации, которые приводят к усилению окислительных реакций/воспалению в определенных тканях, могут вызвать лизис эритроцитов, когда эритроциты вступают в контакт с этими воспаленными тканями.Например, лизис эритроцитов индуцируется при их контакте с атеросклеротической тканью (см. выше).

Повышение внеклеточного гемоглобина в результате гемолитической анемии усиливается частыми переливаниями крови для компенсации сниженного содержания эритроцитов и связанного с этим нарушения доставки кислорода. Необходимая инфузия крови наиболее выражена при операциях, сопровождающихся значительной кровопотерей.

Первоначально вызванный потребностью в источнике крови, доступном на поле боя, где цельная кровь недоступна, ряд исследований был сосредоточен на использовании кровезаменителей на основе гемоглобина.Hb в этих кровезаменителях был изменен, чтобы привести сродство кислорода к сродству цельной крови, и сшит, образуя более высокомолекулярные агрегаты, чтобы предотвратить быстрое удаление бесклеточного Hb почками. Первоначальная неспособность принять во внимание трудности, связанные с бесклеточным гемоглобином, включая как комплексообразование NO, так и окислительные реакции, привела к очень ограниченному использованию кровезаменителей на основе гемоглобина до тех пор, пока не будет введена модификация для сведения к минимуму этих серьезных побочных эффектов.

В настоящее время используются два источника крови: (1) сохраненная цельная кровь, собранная у добровольцев, и (2) эритроциты, полученные с помощью системы восстановления аутологичной крови, такой как «Cell Saver» (Ottesen and Froysaker, 1982).Кровь Cell Saver собирают у пациентов во время операций, связанных с большой кровопотерей. Поскольку в эту кровь Cell Saver добавлен антикоагулянт, клетки промывают для удаления избытка антикоагулянта, плазмы, тромбоцитов, лейкоцитов и любого свободного гемоглобина. Промытые и упакованные эритроциты затем суспендируют в физиологическом растворе до гематокрита 50% и переносят в транспортировочный пакет для реинфузии при необходимости. При необходимости реинфузию можно провести менее чем через 10 мин после забора крови (Keeling et al., 1983).

Кровь, даже in vivo , имеет ограниченный срок жизни 120 дней.После удаления из кровообращения немедленно начинают происходить метаболические и окислительные изменения. Чтобы свести к минимуму эти эффекты, кровь хранится в среде, которая должна минимизировать эти эффекты. В настоящее время FDA разрешает использовать хранящуюся кровь в течение 42 дней. Однако недавние исследования указывают на усиление окислительных реакций, а также на нестабильность мембраны эритроцитов, что приводит к увеличению скорости лизиса и более быстрому выведению из кровотока задолго до хранения в течение 42 дней (Wang et al., 2012).

Эритроциты

Cell Saver получены из свежей крови пациента и, следовательно, сводят к минимуму основные метаболические и окислительные трудности, связанные с хранимой кровью. Однако недавние исследования (Gueye et al., 2010) показывают, что эти клетки, тем не менее, подвержены лизису и продукции внеклеточного гемоглобина. Отчасти сообщаемое увеличение лизиса может быть связано с тем, что мы используем кровь пациентов с различными заболеваниями, которые предположительно связаны с усилением воспаления и окислительного стресса.

Принимая во внимание основные трудности, связанные с внеклеточным гемоглобином, крайне важны дополнительные исследования. Для хранимой крови необходимы методы увеличения стабильности сохраненных эритроцитов. Для клеток крови Cell Saver, где мы имеем дело со свежей кровью, важно определить источник любого повышенного лизиса и разработать методы минимизации лизиса и образования внеклеточного гемоглобина.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано (частично) Внутренней Исследовательской Программой NIH, Национального Института Старения.

Ссылки

Абдель, Ф. М., Абдель, Г. Е., Адель, А., Мосаллам, Д., и Камаль, С. (2010). Дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и пируваткиназы эритроцитов в случаях желтухи новорожденных в Египте. Педиатр. Гематол. Онкол . 27, 262–271. дои: 10.3109/08880011003639986

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Балла, Г., Jacob, H.S., Eaton, J.W., Belcher, J.D., and Vercellotti, G.M. (1991). Гемин: возможный физиологический медиатор окисления липопротеинов низкой плотности и повреждения эндотелия. Артериосклероз. Тромб . 11, 1700–1711 гг. дои: 10.1161/01.ATV.11.6.1700

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Боретти, Ф. С., Бюлер, П. В., Д’Аньилло, Ф., Клюге, К., Глаус, Т., Батт, О. И., и соавт. (2009). Секвестрация внеклеточного гемоглобина в гаптоглобиновом комплексе снижает его гипертензивные и окислительные эффекты у собак и морских свинок. Дж. Клин. Инвестировать . 119, 2271–2280. дои: 10.1172/JCI39115

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Батт, О. И., Бюлер, П. В., и Д’Аньилло, Ф. (2010). Дифференциальная индукция почечной гемоксигеназы и ферритина у видов, продуцирующих аскорбат и не аскорбат, которым переливают модифицированный бесклеточный гемоглобин. Антиоксидант. Окислительно-восстановительный сигнал . 12, 199–208. doi: 10.1089/ars.2009.2798

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Цао, З., Белл, Дж. Б., Моханти, Дж. Г., Нагабабу, Э., и Рифкинд, Дж. М. (2009). Нитрит усиливает гипоксический синтез АТФ в эритроцитах и ​​высвобождение АТФ в сосудистую сеть: новый механизм нитрит-индуцированной вазодилатации. утра. Дж. Физиол. Цирк Сердца. Физиол . 297, h2494–h2503. doi: 10.1152/ajpheart.01233.2008

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Да, К. Л., Галиманд, Дж., Феннето, О., и Мохандас, Н. (2013). Наследственный сфероцитоз, эллиптоцитоз и другие нарушения мембран эритроцитов. Кровь Rev . 27, 167–178. doi: 10.1016/j.blre.2013.04.003

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Детердинг, Л.Дж., Рамирез, Д.К., Дубин, Дж.Р., Мейсон, Р.П., и Томер, К.Б. (2004). Идентификация свободных радикалов на гемоглобине в результате его самоперекисного окисления с использованием масс-спектрометрии и иммуно-спиновой ловушки: наблюдение гистидинильного радикала. Дж. Биол. Химия . 279, 11600–11607. doi: 10.1074/jbc.M310704200

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Феррейра, А., Балла Дж., Джени В., Балла Г. и Соарес М.П. (2008). Центральная роль свободного гема в патогенезе тяжелой малярии: недостающее звено? Дж. Мол. Мед. (Берл.) 86, 1097–1111. doi: 10.1007/s00109-008-0368-5

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Fortes, G. B., Alves, L.S., de Oliveira, R., Dutra, F.F., Rodrigues, D., Fernandez, P.L., et al. (2012). Гем вызывает запрограммированный некроз макрофагов посредством аутокринной продукции TNF и ROS. Кровь 119, 2368–2375. doi: 10.1182/blood-2011-08-375303

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гонсалес Р., Оклер К., Вуазен Э., Гаутеро Х., Дерми Д. и Бойвин П. (1984). Супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионпероксидаза в эритроцитах больных злокачественными заболеваниями. Рак Res . 44, 4137–4139.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Академия Google

Гуйе, П.М., Бертран Ф., Дюпортейл Г. и Лессингер Дж. М. (2010). Внеклеточный гемоглобин, окислительный стресс и качество эритроцитов по отношению к периоперационному спасению крови. клин. хим. лаборатория Мед . 48, 677–683. doi: 10.1515/CCLM.2010.106

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Hebbel, RP (1985). Автоокисление и связанный с мембраной «реактив Фентона»: возможное объяснение развития мембранных повреждений серповидных эритроцитов. клин. Гематол . 14, 129–140.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Академия Google

Kanakiriya, S.K., Croatt, A.J., Haggard, J.J., Ingelfinger, J.R., Tang, S.S., Alam, J., et al. (2003). Гем: новый индуктор MCP-1 посредством HO-зависимых и HO-независимых механизмов. утра. Дж. Физиол. Ренал Физиол . 284, Ф546–Ф554. doi: 10.1152/ajprenal.00298.2002

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Килинг, М.М., Грей, Л.А. мл., Бринк, М.А., Хиллерих, В.К., и Бланд, К.И. (1983). Интраоперационная аутотрансфузия. Опыт в 725 случаях подряд. Энн. Сур . 197, 536–541. дои: 10.1097/00000658-198305000-00006

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кидд, Р. Д., Бейкер, Х. М., Мэтьюз, А. Дж., Бриттен, Т., и Бейкер, Е. Н. (2001). Олигомеризация и связывание лиганда в гомотетрамерном гемоглобине: две кристаллические структуры высокого разрешения гемоглобина Барта (гамма (4)), маркер альфа-талассемии. Белковая наука . 10, 1739–1749. doi: 10.1110/ps.11701

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Lee, T.H., Kim, S.U., Yu, S.L., Kim, S.H., Park, D.S., Moon, H.B., et al. (2003). Пероксиредоксин II необходим для поддержания продолжительности жизни эритроцитов у мышей. Кровь 101, 5033–5038. doi: 10.1182/blood-2002-08-2548

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лин, С., Liang, Y., Zhang, J., Bian, C., Zhou, H., Guo, Q., et al. (2012). Дефицит микроглиального TIR-домена, индуцирующего адаптер-индуцирующий интерферон-бета (TRIF), способствует выживанию ганглиозных клеток сетчатки и регенерации аксонов посредством ядерного фактора-каппаВ. J. Нейровоспаление 9, 39. doi: 10.1186/1742-2094-9-39

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лю, Х., и Сполярикс, З. (2003). Метгемоглобин является мощным активатором эндотелиальных клеток, стимулируя продукцию IL-6 и IL-8 и экспрессию мембраны E-селектина. утра. Дж. Физиол. Селл Физиол . 285, C1036–C1046. doi: 10.1152/ajpcell.00164.2003

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Нагабабу, Э., Хрест, Ф.Дж., и Рифкинд, Дж.М. (2003). Вызванная перекисью водорода деградация гема в эритроцитах: защитная роль каталазы и глутатионпероксидазы. Биохим. Биофиз. Acta 1620, 211–217. doi: 10.1016/S0304-4165(02)00537-8

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Нагабабу, Э., Fabry, M.E., Nagel, R.L., and Rifkind, J.M. (2008a). Деградация гема и окислительный стресс в мышиных моделях гемоглобинопатий: талассемии, серповидно-клеточной анемии и болезни гемоглобина С. Клетки крови Мол. Дис . 41, 60–66. doi: 10.1016/j.bcmd.2007.12.003

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Нагабабу, Э., Гуляни, С., Эрли, С.Дж., Катлер, Р.Г., Маттсон, М.П., ​​и Рифкинд, Дж.М. (2008b). Железодефицитная анемия усиливает окислительный стресс эритроцитов. Свободный радикал. Рез . 42, 824–829. дои: 10.1080/10715760802459879

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Nagy, E., Eaton, J.W., Jeney, V., Soares, M.P., Varga, Z., Galajda, Z., et al. (2010). Эритроциты, гемоглобин, гем, железо и атерогенез. Артериосклероз. тромб. Васк. Биол . 30, 1347–1353. doi: 10.1161/ATVBAHA.110.206433

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Нат, К.А., Гранде, Дж. П., Кроатт, А. Дж., Вероятно, С., Хеббель, Р. П., и Энрайт, Х. (1998). Внутриклеточные мишени при повреждении почек, вызванном гемовым белком. Почки Инт . 53, 100–111. doi: 10.1046/j.1523-1755.1998.00731.x

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Одабас А.Р., Тутуку К.Н., Туркмен А., Кескин Х. и Север М.С. (2002). Тяжелая аллоиммунная гемолитическая анемия после трансплантации почки. Нефрон 92, 743–745.дои: 10.1159/000064093

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки

Qian, Q., Nath, K.A., Wu, Y., Daoud, T.M., and Sethi, S. (2010). Гемолиз и острая почечная недостаточность. утра. Дж. Почки Дис . 56, 780–784. doi: 10.1053/j.ajkd.2010.03.025

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Рочфорд, Р., Орт, К., Баресел, П.С., Кампо, Б., Сампат, А., Мэджилл, А.Дж., и соавт. (2013). Гуманизированная мышиная модель дефицита глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы для оценки гемолитической токсичности in vivo . Проц. Натл. акад. науч. США . 110, 17486–17491. doi: 10.1073/pnas.1310402110

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Садрзаде С.М., Граф Э., Пантер С.С., Халлауэй П.Е. и Итон Дж.В. (1984). Гемоглобин. Биологический реагент Фентона. Дж. Биол. Химия . 259, 14354–14356.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Академия Google

Шаер, Д. Дж., Бюлер, П. В., Алаяш, А. И., Белчер, Дж.Д. и Верчеллотти, Г. М. (2013). Новый взгляд на гемолиз и свободный гемоглобин: изучение гемоглобина и поглотителей гемина как нового класса терапевтических белков. Кровь 121, 1276–1284. дои: 10.1182/кровь-2012-11-451229

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сильва Г., Джени В., Хора А., Ларсен Р., Балла Дж. и Соарес М. П. (2009). Окисленный гемоглобин является эндогенным провоспалительным агонистом, который нацелен на эндотелиальные клетки сосудов. Дж. Биол. Химия . 284, 29582–29595. doi: 10.1074/jbc.M109.045344

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Simoes, R.L., Arruda, M.A., Canetti, C., Serezani, C.H., Fierro, I.M., and Barja-Fidalgo, C. (2013). Провоспалительные реакции гема в альвеолярных макрофагах: последствия легочных геморрагических эпизодов. Медиаторы воспаления . 2013:946878. дои: 10.1155/2013/946878

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Штайнбрехер, Ю.П., Партасарати С., Лик Д.С., Вицтум Дж.Л. и Стейнберг Д. (1984). Модификация липопротеинов низкой плотности эндотелиальными клетками включает перекисное окисление липидов и деградацию фосфолипидов липопротеинов низкой плотности. Проц. Натл. акад. науч. США . 81, 3883–3887. doi: 10.1073/pnas.81.12.3883

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Стокер, Р. , Ямамото, Ю., МакДонах, А.Ф., Глейзер, А.Н., и Эймс, Б.Н. (1987). Билирубин является антиоксидантом возможного физиологического значения. Наука 235, 1043–1046. doi: 10.1126/science.3029864

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вагенер Ф.А., Абрахам Н.Г., ван Койк Ю., де Витте Т. и Фигдор К.Г. (2001a). Гем-индуцированная адгезия клеток в патогенезе серповидно-клеточной анемии и воспаления. Trends Pharmacol. Наука . 22, 52–54. doi: 10.1016/S0165-6147(00)01609-6

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вагенер, Ф.A., Eggert, A., Boerman, O.C., Oyen, W.J., Verhofstad, A., Abraham, N.G., et al. (2001б). Гем является мощным индуктором воспаления у мышей, и ему противодействует гемоксигеназа. Кровь 98, 1802–1811. doi: 10.1182/кровь.V98.6.1802

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вакуи Х. , Имаи Х., Кобаяши Р., Ито Х., Нотоя Т., Йошида К. и др. (1988). Аутоантитела к эритроцитарному белку 4.1 у больного с аутоиммунной гемолитической анемией. Кровь 72, 408–412.

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Академия Google

Ван, Д., Сан, Дж., Соломон, С.Б., Кляйн, Х.Г., и Натансон, К. (2012). В ответ на переливание старой крови и риск смерти: вопросы без ответов. Переливание 52, 2724–2725. doi: 10.1111/j.1537-2995.2012.03913.x

Опубликовано Резюме | Опубликован полный текст | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Повышенный гемоглобин и макроцитоз: забытая ассоциация, чтобы стать диагностическим инструментом (клинический случай) — The Permanente Journal

Повышенный гемоглобин и макроцитоз: забытая ассоциация, которая может стать диагностическим инструментом (клинический случай)

 

Яворковский Леонид Львович, д.м.н., PhD1

Пермь J 2021;25:20. 262

https://doi.org/10.7812/TPP/20.262
Электронный паб: 12.05.2021

Введение: Ориентировочное значение среднего корпускулярного объема (MCV) в диагностике и классификации анемий было установлено более века назад. Напротив, важность оценки MCV у пациентов с повышенным гемоглобином и гематокритом оценивается не так высоко.

Представление случая: В этом случае описан пациент, у которого наблюдался длительный макроцитоз (повышенный MCV), который способствовал повышению уровня гемоглобина и гематокрита, что имитировало диагноз истинной полицитемии.

Заключение: Случай демонстрирует, что игнорирование влияния MCV на уровни гемоглобина/гематокрита может привести к потенциальным ошибкам в интерпретации анализов крови и ошибочному диагнозу.

ВВЕДЕНИЕ

Гемоглобин (Hb), гематокрит (Hct) и эритроциты (эритроциты) исторически играли важную роль в морфологической классификации и диагностике анемий. Аналогично, индексы RBC (RBCI), такие как средний корпускулярный Hb (MCH, пикограммы на клетку), концентрация MCH (MCHC, граммы Hb на децилитр) и, особенно, средний корпускулярный объем (MCV), который определяет размер (объем) Не менее важны эритроциты в оценке анемии. 1 В то время как MCV представляет собой, возможно, наиболее ценный показатель в гематологической практике, 2 его точное влияние на уровни Hct и Hb, особенно в случаях полицитемии, долгое время недооценивалось и полностью игнорировалось в клинической практике. Представлен показательный случай. Этот клинический случай соответствует рекомендациям CARE. 3

ОТЧЕТ О ДЕЛЕ

79-летний мужчина с застойной сердечной недостаточностью, фибрилляцией предсердий, раком мочевого пузыря, поясничным спондилезом, подагрой и депрессией был направлен для оценки повышенного уровня Hb и Hct (таблица 1).Его уровни Hb и Hct колебались за 2-летний период от 17,4 до 18,1 г/дл (референтный диапазон 13,0-17,0 г/дл) и от 52,7% до 54,4% (референтный диапазон 39%-51%), соответственно. . Количество эритроцитов варьировало от 4,28 до 5,03 × 10 12 на литр (референсный диапазон 4,10–5,70 × 10 12 на литр). На момент оценки ширина распределения эритроцитов у пациента составляла 12,8% (референтный диапазон 12,0–16,5%), а средний объем эритроцитов (MCV) был повышен до 110 фл (референтный диапазон 80–100 фл).MCH составлял 36,3 пг Hb на клетку (референтный диапазон 27–31 пг на клетку), а MCHC составлял 33 г Hb на децилитр (референтный диапазон 31–37 г Hb на децилитр). У него было нормальное количество лейкоцитов 4,5 × 10 9 на литр (референтный диапазон, 3,7-11,1 × 10 9 на литр), нормальный дифференциал и количество тромбоцитов 124 × 10 9 на литр (референсный диапазон). , 140-400 × 10 9 на литр). Количество ретикулоцитов составило 1,72% (референсный диапазон 0,70%-2,40%), абсолютное количество 80 × 10 9 на литр (референтный диапазон 25–115 × 10 9 на литр).Пациент никогда не курил, у него было нормальное насыщение кислородом и не было признаков заболевания легких или апноэ во сне. Были проведены дополнительные тесты, но они не подтвердили диагноз истинной полицитемии (ИП). Спленомегалии не было, уровень эритропоэтина был нормальным, а ген JAK2 V617F не мутировал. Лечение пациента состояло из метопролола, клоназепама, гидрокодона, венлафаксина, тразодона, аллопуринола, тамсулозина и фуросемида.

Таблица 1. Хронология дела

79-летний мужчина с застойной сердечной недостаточностью, мерцательной аритмией, раком мочевого пузыря, поясничным спондилезом, подагрой и депрессией, без особенностей семейного и психосоциального анамнеза обследован на предмет длительного макроцитоза и временного повышение уровня гемоглобина и гематокрита свидетельствует о подозрении на истинную полицитемию.
Дата Резюме первичных и последующих посещений Диагностическое тестирование (включая даты) Вмешательства
2000 У пациента с множественными медицинскими проблемами отмечены пограничный макроцитоз (MCV, 100 фл) и транзиторная тромбоцитопения (136 × 10 9 на литр). Оценка макроцитоза при биопсии костного мозга (19.01.01) не выявила явных признаков миелодисплазии, нормальная цитогенетика и проточная цитометрия. Рекомендован полный мониторинг количества клеток крови без дальнейшего диагностического вмешательства.
2001-2015 Отмечено постепенное увеличение MCV без изменения других параметров эритроцитов: 102 фл в 2006 г., 104 фл в 2009 г., 106 фл в 2013 г. и 110 фл в 2015 г. Несколько оценок, проведенных за несколько лет, не смогли выяснить причину повышенного MCV (см. текст). Параметры эритроцитов пациента наблюдались без лечения или каких-либо изменений в питании или образе жизни.
Лечение диуретиками ХСН начато в 2015 г.
Март 2016 г. – ноябрь 2017 г. Выявлено бессимптомное повышение Hb и Hct в дополнение к макроцитозу. Тщательное обследование с множественными анализами крови и УЗИ селезенки (см. текст) не смогло установить причину повышенных Hb и Hct. Консультация гематолога была запрошена по поводу неустановленной причины повышения Hb/Hct.
Ноябрь 2017 г. Первоначальная оценка медицинского, семейного и социального анамнеза пациента, прием лекарств и физикальное обследование гематологом не выявили очевидной причины повышения уровня Hb/Hct. Был проведен всесторонний продольный и сравнительный обзор количества эритроцитов и индексов эритроцитов. Причина повышенного уровня Hb/Hct была идентифицирована как комбинированный эффект относительного повышения эритроцитов из-за применения диуретиков и повышенного MCV.Было рекомендовано прекращение приема диуретиков.
2017-2019 После прекращения приема диуретика количество эритроцитов у пациента вернулось к исходному уровню с сопутствующей нормализацией Hb/Hct. Дальнейшее тестирование не рекомендуется. Никаких дальнейших вмешательств не рекомендовалось.

ЗСН = застойная сердечная недостаточность; Hb = гемоглобин; Hct = гематокрит; MCV = средний корпускулярный объем; RBC = эритроцит.

Записи пациента показали, что его MCV медленно повышался в течение 20 лет. Следует отметить, что в то время как MCV был повышен в течение всего периода наблюдения (таблица 2), увеличение общего Hb/Hct наблюдалось только в течение 2 лет, предшествующих оценке. В течение этого времени пациент получал петлевой диуретик, который, при тщательном рассмотрении, вызвал увеличение количества эритроцитов со среднего исходного уровня 4,54 × 10 12 на литр до применения диуретика до 4,79 × 10 12 на литр. во время лечения.Больной наблюдался в течение 18 мес. После прекращения приема диуретиков количество эритроцитов, хотя и оставалось нормальным, снизилось до исходного уровня пациента с сопутствующей нормализацией Hb/Hct.

Таблица 2. Лабораторные показатели пациента

Лабораторный анализ Значения Базовый диапазон
3,5 года до презентации (13.10.14) На момент регистрации аномального RBCI (15.09.16) На презентации (20.03.18) 1 год после презентации (19.03.19)
Эритроциты, × 10 12 4.45 4,85 4,80 4,68 4.10-5.70
Hb, г/дл 15,9 17,8 17,4 16,6 13,0-17,0
Hct, % 46,7 53,3 52,7 50,7 39-51
MCV, фЛ 105 110 110 108 80-100
МЧ, пг/кл 35. 7 36,7 36,3 35,4 27-31
MCHC, г Hb/дл 34,0 33,3 33,0 32,7 31-37
Лейкоциты, × 10 9 4,8 4,4 4,5 5,3 3,7-11,1
Тромбоциты, × 10 9 161 137 124 141 140-400

Hb = гемоглобин; Hct = гематокрит; MCH = средний корпускулярный гемоглобин; MCHC = средняя концентрация корпускулярного гемоглобина; MCV = средний корпускулярный объем; эритроциты = эритроциты; RBCI = индексы эритроцитов.

Причина увеличения MCV, хотя и не относящаяся к обсуждаемому вопросу, была устранена с помощью обширных и повторяющихся диагностических процедур на протяжении многих лет. За семнадцать лет до обращения пациента исследование костного мозга показало нормальное трехлинейное кроветворение с умеренным относительным преобладанием эритроидного ряда и очаговым умеренным повышением окрашивания ретикулином. Цитогенетические исследования были нормальными, а проточное иммунофенотипирование не выявило аномальных клеточных популяций. У пациента не было известной истории злоупотребления наркотиками или алкоголем, а также заболеваний почек, щитовидной железы или печени.У него был нормальный уровень тестостерона и липидный профиль [холестерин 4,73 ммоль на литр (референсный диапазон < 5,17 ммоль на литр), триглицериды 1,74 ммоль на литр (референтный диапазон < 5,63 ммоль на литр)], и он не принимал никаких лекарств, которые, как известно, вызывают макроцитоз. Он не продемонстрировал состояний, которые могут вызвать ложный макроцитоз, таких как холодовые агглютинины, моноклональные белки, гипергликемия или гиперлейкоцитоз. Диагноз пернициозной анемии неоднократно отклонялся на основании нормального уровня витамина B12 (и фолиевой кислоты), отсутствия анемии и сохраняющегося макроцитоза в течение 20 лет.

ОБСУЖДЕНИЕ

Причина повышенного уровня Hb/Hct, рассматриваемого лабораторного признака, в данном случае была явно нетривиальной и требовала нетрадиционного подхода. Как отмечалось выше, повышение уровня Hb/Hct у пациента происходило одновременно с макроцитозом (табл. 2). Когда они присутствуют вместе, эти аномалии могут представлять клиническую проблему. Обычной причиной высокого Hct является повышенное количество эритроцитов. 4 Поскольку это было нормальным, продолжительное увеличение MCV было связано с повышением Hct у пациента.Действительно, высокий Hct следует отнести к большому размеру RBC , поскольку классическая формула Hct = RBC × MCV открыто демонстрирует: чем выше MCV (чем больше размер RBC), тем выше Hct (и наоборот).

Любопытно, что этот факт, хотя и очевидный и правильно подчеркнутый ранее, 5 на практике совершенно не учитывался и не принимался во внимание. Также важно отметить, что MCV влияет не только на Hct, но и на Hb. Фундаментальная связь между MCV и Hb была установлена ​​почти столетие назад 6 , но оставалась полностью скрытой.Эта связь была подтверждена в более позднем исследовании, где было показано, что MCV изменяется в строгой линейной зависимости от среднего содержания Hb в эритроцитах (MCH). 7 В результате макроциты вмещают большее количество гемоглобина по сравнению с нормоцитами или микроцитами. Такая конгруэнтность MCV с содержанием Hb в эритроцитах (MCH) устойчива благодаря практически постоянной концентрации Hb на RBC (MCHC) 7 (табл. 2). Хотя эти результаты оказались важными для оценки анемии, ранее не признавалось, что, внося свой вклад в общий уровень Hb/Hct, MCV может быть клинически значимым в случаях повышенного уровня Hb/Hct.

В данном случае повышение MCV было не единственным фактором, вызвавшим повышение Hb/Hct. Считалось, что лечение петлевыми диуретиками в течение 2 лет вызвало хроническую дегидратацию, приводящую к относительному повышению эритроцитов. Последнее в сочетании с повышенным MCV повышало уровни Hb/Hct выше нормы и маскировало истинную полицитемию (ИП). Стоит отметить, что хотя классификация PV Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) идентифицирует эритроцитоз с высокими уровнями Hb/Hct, 8 этот случай подтверждает, что последний не может быть надежным суррогатным маркером абсолютного эритроцитоза. 9

Хотя этиология повышенного MCV представляет собой отдельный вопрос и не имеет отношения к его влиянию на Hb/Hct, в данном случае она представляла особый интерес. Макроцитоз такой продолжительности наблюдается редко. Кроме того, его причину по-прежнему трудно определить, несмотря на обширные и повторяющиеся диагностические процедуры на протяжении многих лет. Вероятность нормального варианта или генетической предрасположенности 10,11 оказалась низкой, поскольку макроцитоз развивался с течением времени. Однако приобретенный миелодиспластический синдром оставался вероятной причиной макроцитоза, несмотря на его удивительно длительный период времени. 10

Настоящий случай иллюстрирует распространенный сценарий того, как повышенный MCV может способствовать повышению уровня Hb/Hct, но для разрешения этого требуется осведомленность и клиническая проницательность. В то время как описанный модифицирующий эффект MCV может иметь небольшое клиническое значение, когда он длится недолго, в данном случае он вызвал длительную диагностическую дилемму. Такая тонкая динамика параметров эритроцитов может обычно не восприниматься как важная, но она распространена и сильно недооценивается. Поскольку на практике часто встречается макроцитоз, а количество эритроцитов имеет тенденцию колебаться по разным причинам, их совместное влияние на Hb/Hct клинически более заметно, чем обычно считается.На самом деле, даже незначительные повышательные или понижательные тенденции в показателях MCV могут оказывать клинически значимое влияние на Hb/Hct.

Поскольку RBCI стали легко доступны с автоматическими счетчиками клеток, их точная оценка имеет первостепенное значение, особенно в подобных случаях, и требует исключения ложных показаний из-за ложного макроцитоза (SM) и/или ложного эритроцитоза. Как упоминалось ранее, потенциальные причины СМ, такие как слипание эритроцитов (холодовые агглютинины или моноклональные белки), набухание эритроцитов (разведение образца крови из-за гипергликемии), 12 и повышенная мутность крови (гиперлейкоцитоз) 13 , были исключены.В большинстве случаев простой обзор мазка периферической крови может достоверно идентифицировать СМ. Ложный эритроцитоз может быть вызван сгущением крови из-за ожогов, рвоты, диареи или приема диуретиков, как в данном случае. Подробный анамнез обычно позволяет определить причину ложного эритроцитоза, что устраняет необходимость в дорогостоящем измерении массы эритроцитов с помощью радиоизотопных исследований. Одним из ограничений представления этого случая является то, что макроцитоз оставался не полностью объясненным даже после исключения всех мыслимых причин.С другой стороны, если бы не стойкий макроцитоз, давно скрытая причина повышения Hb/Hct могла бы остаться незамеченной.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Существенная связь между размером (объемом) эритроцитов и содержанием гемоглобина в клетках эритроцитов, несмотря на широкое клиническое применение, не принималась во внимание почти столетие. Этот случай своевременно подчеркивает тот факт, что макроциты, благодаря их большему объему, демонстрируют более высокое содержание Hb на клетку, чем нормоциты, и, как результат, способствуют более высоким показателям Hb/Hct в целом.Кроме того, этот случай демонстрирует, что макроцитоз способен повышать уровень Hb/Hct выше нормы даже при отсутствии эритроцитоза (повышенное количество эритроцитов). Поскольку описанный эффект имеет огромное значение в клинической практике, врачи общей практики и гематологи должны помнить о MCV в каждом случае аномально высокого уровня Hb/Hct, который может привести к потенциальным ошибкам в интерпретации анализов крови, неправильной диагностике ИП и необоснованным и дорогостоящим вмешательствам. проработка.

Заявление о раскрытии информации

У авторов нет конфликтов интересов, о которых следует сообщать.

Финансирование

Финансирование данного исследования не предоставлялось.

Благодарности

Кэтлин Лоуден, ELS, из Louden Health Communications выполнила редактирование первичной копии.

Принадлежность авторов

1 Отделение онкологии, Медицинский центр Kaiser Permanente в Сан-Хосе, Сан-Хосе, Калифорния

Автор, ответственный за переписку

Яворковский Леонид Львович, доктор медицинских наук (Leonid.yavorkovsky@kp.орг)

Вклад авторов

Леонид Л. Яворковский, доктор медицинских наук, полностью внес свой вклад в это исследование, включая выявление случая и написание рукописи.

Заявление об этике

Пациент дал письменное информированное согласие на публикацию своего случая.

Сокращения

Hb, гемоглобин; Hct, гематокрит; JAK2, Янус-киназа 2, тирозинкиназа; MCH, средний корпускулярный гемоглобин; MCHC, средняя концентрация корпускулярного гемоглобина; MCV, средний корпускулярный объем; ИП, истинная полицитемия; RBC, эритроцит; RBCI, индексы эритроцитов; СМ, ложный макроцитоз

Каталожные номера

1. Винтроуб ММ. Классификация анемий на основе различий в размере и содержании гемоглобина в красных кровяных тельцах (Proc Soc Exp Biol Med) 1930 Jun; 27(9):1071-3. DOI: https://doi.org/10.3181/00379727-27-5119

2. Дэвидсон Р.Дж., Гамильтон П.Дж. Высокий средний объем эритроцитов: его частота и значение в рутинной гематологии. Дж. Клин Патол, 1978 г., май; 31 (5): 493-8. DOI: https://doi.org/10.1136/jcp.31.5.493, PMID: 649776

3. Райли Д.С., Барбер М.С., Кинле Г.С. и соавт. Рекомендации CARE для отчетов о случаях заболевания: документ с пояснениями и уточнениями.J Clin Epidemiol 2017 Sep; 89: 218-35. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jclinepi.2017.04.026

4. Заготовка HH. Гемоглобин и гематокрит. В кн.: Клинические методы: анамнез, физические и лабораторные исследования. Уокер Х.К., Холл В.Д., Херст Дж.В., редакторы. 3-е изд. Бостон: Баттервортс; 1990 г.; Глава 151. PMID: 21250102.

5. Doig K, Zhang B. Методический подход к интерпретации параметров эритроцитов в общем анализе крови. Clin Lab Sci 2017 Jul;30(3):173-85. DOI: https://doi.org/10.29074/ascls.30.3.173

6. Хаден Р.Л. Клиническое значение объема и содержания гемоглобина в эритроците. Arch Intern Med 1932 Jun; 49 (6): 1032-57. DOI: https://doi.org/10.1001/archinte.1932.00150130155013

7. Фишер С.Л., Фишер С.П. Средний корпускулярный объем. Arch Intern Med 1983 Feb; 143 (2): 282-3. DOI: https://doi.org/10.1001/archinte.1983.00350020108020

8. Арбер Д.А., Орази А., Хассерджян Р. и соавт. Пересмотренная в 2016 г. классификация миелоидных новообразований и острого лейкоза Всемирной организации здравоохранения.Кровь 2016 Май; 127 (20): 2391-405. DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2016-03-643544, PMID: 27069254

9. Johansson PL, Safai-Kutti S, Kutti J. Повышенная концентрация венозного гемоглобина не может использоваться в качестве суррогатного маркера абсолютного эритроцитоза: исследование пациентов с истинной полицитемией и явной полицитемией. Br J Haematol 2005 Jun;129(5):701-5. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2005.05517.x, PMID:15916693

10. Valent P, Jäger E, Mitterbauer-Hohendanner G, et al.Идиопатическая дисплазия костного мозга неизвестной значимости (IDUS): определение, патогенез, наблюдение и прогноз. Am J Cancer Res 2011;1(4):531-41, PMID:21984971.

11. Sechi LA, De Carli S, Catena C, Zingaro L, Bartoli E. Доброкачественный семейный макроцитоз. Clin Lab Haematol 1996 Mar; 18 (1): 41-3. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2257.1996.tb00736.x, PMID:03

12. van Duijnhoven HL, Treskes M. Заметное вмешательство гипергликемии в измерения среднего объема (красных) клеток с помощью анализаторов Technicon H.Clin Chem 1996 Jan; 42(1):76-80. DOI: https://doi.org/10.1093/clinchem/42.1.76, PMID:8565238

13. Фрэнсис Д.А., Фрэнсис Дж.Л., Роат О.С. Улучшена оценка показателей гемоглобина и эритроцитов в образцах крови с высоким содержанием лейкоцитов. Med Lab Sci 1985 Jul; 42 (3): 285-6, PMID: 4046772.

Ключевые слова: клинический случай, гемоглобин, макроцитоз, средний корпускулярный объем

Насколько полезны концентрация гемоглобина и его вариации для прогнозирования значительного кровотечения на ранней стадии травмы? Многоцентровое когортное исследование | Annals of Intensive Care

Дизайн и условия исследования

Это ретроспективное когортное исследование проводилось в период с ноября 2011 г. по июль 2016 г. в шести французских академических травматологических центрах (уровень 1) в районе Парижа, Франция: Beaujon, Bicetre, Henri Mondor, Georges Pompidou. , больницы Перси и Питье-Сальпетриер.Институциональный наблюдательный совет («Comité de Protection des Personnes Paris Ile-de-France VI», Париж, Франция) дал свое одобрение и отказался от необходимости получения письменного информированного согласия. Исследование проводилось с использованием TraumaBase ® , проспективного реестра травм, который включает всех пациентов с травмами, поступивших в шесть центров, участвующих в этом исследовании. В соответствии с французским законодательством реестр был одобрен Консультативным комитетом по обработке информации в медицинских исследованиях (Comité Consultatif sur le Traitement de l’Information en matière de Recherche dans le domaine de la Santé, N° 11.305 bis) и Французской национальной комиссии по вычислительной технике и свободе (Commission Nationale Informatique et Liberté, № 1). С 2010 года клинические карты всех пациентов с травмами были стандартизированы в каждой участвующей больнице, чтобы обеспечить воспроизводимый и однородный сбор данных, включая догоспитальные и госпитальные данные. Хотя данные были проспективно получены в базе данных TraumaBase ® для исследовательских и эпидемиологических целей, настоящее исследование следует рассматривать как ретроспективное.

Травматологическая служба в парижском регионе Иль-де-Франс

Во Франции экстренные вызовы централизованы по номеру телефона «15». В зависимости от информации, предоставленной этими звонками, врач-диспетчер, работающий круглосуточно и без выходных, решает, следует ли задействовать машину скорой помощи, укомплектованную фельдшером, или мобильное отделение интенсивной терапии, укомплектованное врачом (Service Mobile d’Urgence et de Réanimation [SMUR]). При подозрении на серьезную травму выдвигается автомобиль СМУР. Тяжелую травму обычно подозревают с использованием французских национальных критериев сортировки Виттеля [18, 19], которые обеспечивают догоспитальную пятиступенчатую оценку тяжести травмы, включая физиологические, анатомические и реанимационные параметры, а также общую оценку скорости и механизма. Наличие одного или нескольких из 26 критериев обычно приводит к госпитализации в травматологический центр 1-го уровня. Медицинская бригада на догоспитальном этапе проводит клиническую оценку на месте происшествия, инициирует догоспитальную реанимацию и доставляет пострадавшего в приемную больницу.

Отбор участников

Все последовательные взрослые пациенты с травмами (18 лет и старше), поступившие непосредственно с места травмы в один из шести вышеупомянутых травматологических центров уровня 1 по подозрению на тяжелую травму, были включены в исследование, если у них было по крайней мере одно догоспитальное измерение гемоглобина с помощью устройства POC HemoCue ® (Hb201, Ангельхольм, Швеция).Это измерение Hb обычно выполняется бригадой SMUR по прибытии на место происшествия и бригадой больницы при поступлении в больницу.

Измерения

Для каждого пациента, поступившего в исследовательский центр, регистрировались следующие данные: возраст, пол, механизм травмы, догоспитальное минимальное систолическое артериальное давление (АД), максимальная частота сердечных сокращений (ЧСС), оценка по шкале комы Глазго, объем введенной жидкости на догоспитальном этапе ( FV prehosp ), время от вызова службы экстренной помощи до прибытия бригады SMUR на место происшествия, время оказания догоспитальной помощи, показатели жизнедеятельности по прибытии, оценка тяжести травмы (ISS), биологические переменные (включая измерения Hb и лактата в сыворотке), трансфузионная терапия в течение первых 24 часов после травмы, гемостатическая терапия (ангиоэмболизация и хирургическое вмешательство) и переменные исхода (смертность, продолжительность пребывания в отделении интенсивной терапии (ОИТ) и продолжительность искусственной вентиляции легких). Уровень лактата в сыворотке ( лактат hosp ) измеряли при поступлении в больницу либо в лаборатории, либо с помощью анализатора газов крови по месту оказания медицинской помощи (ABL 800, Radiometer). Предварительный и больничный индекс шок ( SI Prehosp и SI Hos , соответственно) Значения были рассчитаны с использованием следующих формул соответственно: максимальный HR Prehosp / минимальный систолический BP Prehosp и HR при поступлении в стационар/систолическое АД при поступлении в стационар.

Исход и определения

Первичным интересующим исходом было возникновение значительного кровотечения (SH), определяемого как необходимость переливания не менее 4 единиц эритроцитарной массы в первые 6 ч и/или смерть, связанная с неконтролируемым кровотечение в первые 24 часа после травмы. Пациентов без SH считали контрольными (CL). Решение о переливании принимается лечащим врачом травматологического центра на основании его оценки клинической ситуации пациента (клинические признаки шока, положительный FAST (фокусированная оценка с помощью УЗИ при травме), эхография или явное внешнее кровоизлияние). .

Первое измерение Hb, взятые с использованием устройства POC на сцене, называется POC HB Prehosp и первый, который выполняется в допуске больницы как POC HB HOSH . Разница между больницей и доосвятальными ценностями POC-HB ( POC HB POC POC HB HB Prehosp ) И назван Deltapoc ГБ .Hb, измеренный в лаборатории при поступлении в больницу, обозначается как Hb Lab hosp .

Статистический анализ

Непрерывные данные выражаются как среднее ± стандартное отклонение или медиана [квартиль 1; 3] по их распределению (оценка графического построения). Категориальные данные выражаются в виде количества и процентов. Сравнения проводились с использованием критерия Стьюдента или непараметрического критерия Манна-Уитни U в зависимости от нормальности данных. Сравнение пропорций проводилось с использованием критерия хи-квадрат или точного критерия Фишера, когда это уместно.

Способность POC-Hb prehosp , POC-Hb hosp , DeltaPOC-Hb и Hb-Lab hosp предсказывать SH были впервые протестированы с использованием одномерной логистической регрессии. Кроме того, способность FV prehosp , лактата hosp , SI prehosp и SI hosp прогнозировать SH также была протестирована с использованием одномерной логистической регрессии. Для каждой переменной рассчитывали чувствительность, специфичность, положительные и отрицательные прогностические значения и расчет площади под кривой (AUC и 95% доверительный интервал).Когда AUC превышала 0,5, рассчитывали индекс Юдена (чувствительность + специфичность – 1), и значение максимума индекса Юдена рассматривали как наилучшую точку отсечения.

AUC догоспитальных и госпитальных переменных соответственно сравнивали с соответствующими AUC SI prehosp и SI hosp с использованием теста Хэнли-Макнейла.

Поскольку бинарный подход к анализу ROC-кривой не всегда адекватно отражает клиническую реальность, был выполнен подход с серой зоной, как описано в другом месте [21, 22].Во-первых, ROC-кривые были получены путем усреднения 2000 популяций, бутстрэпированных (выборка с заменой) из исходной исследуемой популяции, чтобы определить 95% ДИ лучших порогов бутстрепной популяции для каждой переменной. Второй шаг был выполнен для определения порога, связанного с чувствительностью 90%, и другого порога, связанного со специфичностью 90%, с использованием 2000 популяций. В соответствии с оригинальной публикацией метода серой зоны [21] в качестве окончательной серой зоны был выбран самый широкий интервал серой зоны, полученный одним из этих методов.

Поскольку исходные уровни гемоглобина у женщин и мужчин различаются [20], для каждой переменной, связанной с гемоглобином, был проведен гендерный анализ (POC-Hb prehosp , POC-Hb hosp , DeltaPOC-Hb и Hb-Lab hosp ) для более точного определения AUC и/или наилучших пороговых значений этих переменных у пациентов женского и мужского пола.

Многофакторная логистическая регрессия, в которой были собраны все прогностические переменные, доступные на догоспитальном и госпитальном периодах, была проведена для оценки полезности каждой переменной в прогнозировании тяжелого кровотечения.

Кроме того, взаимосвязь между DeltaPOC-Hb и объемом догоспитальной жидкости, вводимой пациентам со значительным кровотечением и контрольной группе, была проанализирована с использованием множественной линейной модели (с проверкой остатков) для специальной проверки гипотезы о том, что наличие значительного кровотечения может повлиять на влияние объема догоспитальной жидкости на падение уровня гемоглобина между догоспитальным и госпитальным этапами. Также оценивался срок взаимодействия (FV prehosp * SH).

Все значения p были двусторонними, и значение p  < 0,05 считалось значимым. Анализы проводились с использованием JMP ® , версия 9 (SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина), программного обеспечения MedCalc 7. 3.0.1 (Мариакерке, Бельгия) и R 3.3.3 (http://www.R-project.org/). ) пакеты.

Гемоглобин Ямайская равнина — серповидный гемоглобин с пониженным сродством к кислороду

Рисунок 1. Рисунок 1. Генетическое секвенирование и анализ белков гемоглобина пациента.

На панели А показаны хроматограммы секвенирования, показывающие два типа клонов, полученных из ДНК пациента. Клон типа 1 содержал серповидную мутацию β20A→T в кодоне 6 и спонтанно возникающую мутацию β335C→T в кодоне 68, что указывает на то, что обе мутации у пациента находились на одной и той же хромосоме. Клон типа 2 был диким типом. Оба положения отмечены стрелками, а кодируемые аминокислоты (дикого типа) показаны под хроматограммами, а мутировавший нуклеотид и аминокислота подчеркнуты.Анализ системы мутаций, рефрактерных к амплификации, показанный на панели B, подтвердил наличие как аллеля дикого типа (βC335), так и мутации β335C→T, что указывает на то, что пациент был гетерозиготным по этой мутации. Изоэлектрическое фокусирование гемолизата пациента (панель C) выявило HbA, HbF и полосу, мигрирующую вместе с HbS. След HbA 2 также присутствовал на исходном пятне, хотя он не виден на рисунке. Слева стандартная лестница гемоглобина. Hb JP очищали хроматографией на колонке с карбоксиметилцеллюлозой СМ52 (панель D).Точки на кривой представляют собой оптическую плотность каждой собранной фракции. Полученный гемоглобин имел чистоту 93% по данным быстрой белковой жидкостной хроматографии (данные не показаны).

Последовательности ДНК 7 из 10 независимых ПЦР-клонов геномной ДНК пациента были полностью нормальными. В трех клонах обнаружена трансверсия аденина в тимин в положении 20 (β20A→T) в экзоне 1 (соответствует β Glu6Val , который является стандартным HbS). Те же три клона также выявили мутацию β335C→T в экзоне 2 (рис. 1А).Экзон 3, амплифицированный отдельно, был нормальным во всех клонах (данные не показаны). Расщепление Xmn I амплифицированной ДНК, содержащей экзон 2, привело к трем фрагментам размером 594, 410 и 184 п.н., что согласуется с гетерозиготностью по мутации β335C→T, которая создает последовательность распознавания Xmn I (5’GAANNNN T TC3′, где мутантный нуклеотид подчеркнут), который отсутствует в последовательности дикого типа. Анализ ARMS подтвердил, что пациент был гетерозиготным по β335C→T (рис. 1B).ДНК дикого типа не амплифицируется с мутантным праймером (данные не показаны). Согласно анализу ДНК, ген β-глобина матери был дикого типа, а ген β-глобина отца содержал только мутацию β20A→T (признак S), а не мутацию β335C→T. Об этой мутации β335C→T, кодирующей β Leu68Phe , ранее сообщалось как об изолированной находке, Hb Rockford, 6 , также известной как Hb Loves Park. 7 Гетерозиготная мутация также присутствовала в ДНК буккального мазка пациента, подтверждая, что это мутация зародышевой линии.Мы интерпретируем эти результаты как означающие, что пациент приобрел новую мутацию на ее отцовском аллеле HbS и унаследовал нормальный аллель β-глобина от своей матери и, таким образом, является гетерозиготным по двойному мутантному гемоглобину, Hb JP (β Glu6Val, Leu68Phe ).

Рисунок 2. Рисунок 2. Функциональный анализ Hb JP.

Диализованный гемолизат, приготовленный из крови пациента, имел более высокое парциальное давление кислорода (PO 2 ) при 50-процентной диссоциации (P 50 ), чем HbA дикого типа (панель A). В то время как P 50 очищенного Hb JP было лишь немного выше, чем у одного HbS, разница увеличивалась в присутствии 3,0 мМ 2,3-дифосфоглицерата (DPG) (панель B). Образование тетрамера для Hb JP было в пределах нормы и существенно не отличалось от такового для HbS (панель C). На вставках показаны данные, нанесенные на график для получения константы диссоциации (kD). T обозначает степень образования тетрамера, выраженную в процентах. На панели D показан предполагаемый механизм снижения сродства Hb JP к кислороду.Замена фенилаланина в положении 68 β-цепи была смоделирована в соответствии с координатами нормального HbA, чтобы оценить, как она повлияет на связывание кислорода (красный шарик). В этой модели остов окси-HbA не изменился, но остаток лейцина в положении 68 был заменен фенилаланином. Боковые цепи, окружающие фрагмент гема (гистидин в положении 63, лизин в положении 66 и валин в положении 67), показаны для справки (фиолетовым цветом). Дополнительные боковые цепи, показанные для справки, включают триптофан в положении 15 (желтый) и лейцин в положениях 110 и 114 (оранжевый). Сплошные красные линии между объемным мутантным остатком фенилаланина в положении 68 (зеленый цвет) и соседними цепями (валин в положениях 20 и 23 и глицин в положении 24 (синий цвет)) представляют крайне неблагоприятные контакты. Вероятно, произошла бы перегруппировка, чтобы компенсировать эти неблагоприятные контакты. Когда тот же анализ замещения фенилаланина проводят с координатами дезокси-HbA (не показаны), неблагоприятные взаимодействия оказываются гораздо менее серьезными. Следовательно, дезоксиструктура будет предпочтительнее, предполагая, что связывание кислорода будет слабее (т.е., будет сдвиг вправо кривой диссоциации гемоглобина). Аминокислотные остатки помечены их однобуквенными кодами. Цвета обозначают альфа-спираль (A, B, E или G) β-глобина, в которой расположены аминокислоты.

Далее были изучены свойства мутантного гемоглобина в гемолизатах эритроцитов больного и в очищенном виде. Изоэлектрическое фокусирование гемолизата выявило HbA, HbF и полосу, идущую рядом с HbS, которая соответствовала двойному мутанту Hb JP с нейтральным зарядом (рис. 1C).Когда пациенту было 22 месяца, FPLC показал 62,6% HbA, 28,5% Hb JP и 8,9% HbF. Выделенный мутантный белок имел чистоту 93% по данным FPLC после разделения с помощью хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе (рис. 1D). Очищенные HbS и Hb JP не могли быть разделены с помощью FPLC или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Диализованный гемолизат пациента имел кривую связывания кислорода, на которой парциальное давление кислорода при 50-процентной диссоциации составляло 48 мм рт. ст., что значительно выше, чем (т.е., сдвинутый далеко вправо), что для HbA (рис. 2А). Этот результат продемонстрировал, что пониженное сродство к кислороду присуще мутантному гемоглобину. Парциальное давление кислорода при 50-процентной диссоциации было лишь немного выше для одного только очищенного мутантного гемоглобина, чем для HbS (10,0 против 6,5 мм рт. ст.), но разница увеличивалась в присутствии 150 мМ хлорида натрия (22,2 против 13,0 мм рт. ст.). ) и еще более резко в присутствии 3,0 мМ 2,3-дифосфоглицерата (43,0 против 24,0 мм рт. ст.) (рис. 2В).Кооперативность связывания кислорода с гемоглобином, оцениваемая по коэффициенту Хилла, 8 , существенно не отличалась среди Hb JP, HbS и HbA (данные не показаны). Добавление 2,3-дифосфоглицерата или хлорида натрия не изменило этот результат.

В анаэробных условиях серповидный гемоглобин легко осаждается в виде полимера. Средняя (± диапазон) растворимость (C sat , показатель насыщения гемоглобина) в декстране составила 36,14±1,5 мг на миллилитр (среднее значение двух измерений) в отсутствие 2,3-дифосфоглицерата и 22.9±0,3 мг на миллилитр (среднее значение двух измерений) в присутствии трехкратного молярного избытка 2,3-дифосфоглицерата. Hb JP был немного менее растворим в этих условиях с соответствующими средними значениями 28,34 мг на миллилитр и 21,72 мг на миллилитр (оба измерения повторяются). Кроме того, стабильность тетрамера в мутантном гемоглобине находилась в пределах нормы и существенно не отличалась от таковой для HbS (рис. 2С). JP Hb, синтезированный в дрожжах стандартными методами рекомбинантной ДНК, обладал свойствами, идентичными свойствам, описанным выше для очищенного JP Hb, что подтверждает наблюдаемые результаты (данные не показаны).

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.