Мочеполовая система | Медицинский центр «Верум»Медицинский центр «Верум»

ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТ

 

            1. Соблюдать безбелковую диету. Исключить: сыр, творог, насыщенные мясные отвары, острое, копченое. Ограничить сладкое до 50 г в сутки. Мясо или рыба не более 2-3 раз в неделю.

            Можно: молоко, каши, кефир, овощи, орехи (ягоды и фрукты с осторожностью!).

 

            2.  Чередовать по месяцу прием сборов:

—        Гломерулонефрит

—        Хроническая почечная недостаточность

 

На фоне их приема также по месяцу чередовать прием сборов:

—        Кровоочистительный, кроветворный

—        Иммунная защита № 1

—        Симптоматическое лечение (при отеках – мочегонные, при гипертонии – гипотензивный сбор)

 

Дополнительно вместо воды и чая чередовать по 2 недели прием отвара

овса с календулой и отвара коры пихты.

На область почек – компресс из «Просоленной шерсти».

 

  

ПОЧЕЧНО-КАМЕННАЯ БОЛЕЗНЬ

 

            Принимать сбор «Почечно-каменная болезнь». Курс приема сбора – 6-8 месяцев.

            Данный сбор можно принимать и при желчекаменной болезни.

 

 

 ПРОСТАТИТ, ИМПОТЕНЦИЯ

 

            Чередовать по 1 месяцу прием настоек:

—        Красного корня

—        Молочая Палласа (если АД пониженное или в норме)

 

На фоне их приема при простатите: сбор

«Простатит, аденома», плюс 1 стакан отвара коры осины.

При импотенции – сбор «Импотенция» соответственно состояния нервной системы. Три вида сборов:

—        Импотенция, гипоформа астенического синдрома (сонливость, апатия, безразличие).

—        Импотенция, гиперформа астенического синдрома (бессонница, раздражительность, агрессивность).

—        Импотенция (без нарушений со стороны нервной системы)

 

Дополнительно пить отвар овса с календулой.

 

  

БЕСПЛОДИЕ

 

            Чередовать по 1 месяцу прием настоек:

—        Красного корня

—        Красной щетки

—        Марьина корня (пиона уклоняющегося)

—        Молочая Палласа (если АД пониженное или в норме)

 

На фоне их приема:

—        Если воспалительного характера – чередовать по месяцу прием сборов «Аднексит» и «Бесплодие». При спайках – на низ живота и поясницу компресс из «Просоленной шерсти».

—        Если на фоне опухоли (поликистоз яичников) чередовать прием сборов: «Бесплодие», «Киста, кистомы», затем – противоопухолевые сборы.

—        Если на фоне гормональных нарушений – чередовать прием сборов: «Бесплодие», «Спасение № 1» или

«Спасение № 2» соответственно гормональным нарушениям. Дополнительно сбор «Стимуляция менструации».

—        Если нарушена функция щитовидной железы – провести курс по основному заболеванию.

 

 

 

 

Прайс-лист:

 

Аднексит (300 г)	350,00
Кисты, кистомы (300 г)	350,00
Мастопатия  (300 г)	350,00
Миома  (300 г)	350,00
Пиелонефрит  (350 г)	350,00
Почечно-каменная болезнь (350 г)	350,00
Приливы в климактерический период (300 г)	350,00
Простатит+кора осины  (300 г + 200 г)	400,00
Цистит (400 г)	350,00
Эндометриоз  (300 г)	350,00
энурез  (300 г)	350,00
Эрозия шейки матки  (350 г)	350,00

 

 

 

 

 

 

 

 

ИМЕЮТСЯ ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ.

 НЕОБХОДИМА КОНСУЛЬТАЦИЯ СПЕЦИАЛИСТОВ.

Китайский биологический противораковый препарат Канглайт получил разрешение на проведение 3-й фазы клинических испытаний в США

Пекин, 27 июня /Синьхуа/ — Китайская фармацевтическая компания «Чжэцзян Канглайт Групп» сегодня объявила, что она получила разрешение на проведение в США 3-й фазы клинических исследований натурального растительного противоопухолевого препарата Канглайт /Kanglaite/.

Таким образом, в случае успешного завершения третьей фазы испытаний эмульсия для инъекций Канглайт поступит в продажу в США, сообщил производитель препарата на состоявшейся в субботу в Пекине пресс-конференции.

Канглайт для инъекций изготавливается путем экстракции натуральных компонентов из семян травянистого растения коикс с помощью современной технологии.

Данное противоопухолевое средство стало первым препаратом традиционной китайской медицины, допущенным Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США /USFDA/ к проведению 3-й фазы клинических исследований в этой стране.

«Это ключевой шаг к интернационализации традиционной китайской медицины, который имеет существенное значение для инноваций и разработки лекарств традиционной китайской медицины», — отметил глава Китайской академии традиционной китайской медицины Чжан Боли.

3-я фаза клинических исследований — это рандомизированные контролируемые мультицентровые исследования с участием большой популяции пациентов для подтверждения эффективности и безопасности препарата.

Член Инженерной академии Китая /ИАК/ Ли Дапэн, который является основателем «Чжэцзян Канглайт Групп» и изобретателем нового препарата Канглайт, сообщил, что данное лекарство против рака ингибирует и убивает раковые клетки, повышая иммунитет организма.

По его словам, после строгого рассмотрения USFDA 9 марта 2001 года было разрешено проведение клинических исследований Канглайта в США. Благодаря более чем десятилетним усилиям в мае этого года USFDA разрешило проведение 3-й фазы клинических испытаний Канглайта против рака поджелудочной железы.

Ли Дапэн сказал, что после применения пациентами препарата Канглайт не было выявлено никаких токсичных побочных действий, и препарат показал хорошую эффективность при лечении различных видов злокачественных опухолей, таких как карциномы легких, печени, желудка и поджелудочной железы.

Китайский онколог выразил желание сотрудничать со стратегическими партнерами для скорейшего завершения третьей фазы клинических испытаний Канглайта в США.

Ли Дапэн также отметил продуктивное сотрудничество с российскими коллегами, подчеркнув, что это сертифицированное противоопухолевое средство разрабатывалось в Китае в течение более 20 лет и к настоящему моменту одобрено Министерством здравоохранения РФ.

В 2001 году профессору Ли Дапэну было присвоено звание иностранного члена Российской академии медицинских наук /РАМН/. -0-

COVID-19 Resources for People With Cancer

ASCO has compiled a number of resources to help people with cancer navigate COVID-19.

Coronavirus and COVID-19: What People With Cancer Need to Know

Cases of coronavirus disease 2019 have arisen all over the world. Here’s what people with cancer and cancer survivors need to know about the disease.

Available in English, Spanish (Español), Portuguese (Português), Russian (Pусский), Arabic (العربية) (PDF)

Answers to Your Questions About the COVID-19 Vaccine

Dr. Julie Gralow, Chief Medical Officer of ASCO, answers common questions and concerns people with cancer have about the COVID-19 vaccines available in the United States.

Available in English and Spanish (Español).

Download a printable PDF of this infographic in English and Spanish (Español). 

Common Questions About COVID-19 and Cancer: Answers for Patients and Survivors

The American Society of Clinical Oncology (ASCO) and the National Coalition for Cancer Survivorship (NCCS) answered questions about how coronavirus 2019 (COVID-19) could potentially affect the health and cancer care of people diagnosed with cancer.

Available in English, Spanish (Español), Portuguese (Português), Russian (Pусский), Arabic (العربية) (PDF)

Resources for Managing Your Care During COVID-19

COVID-19 Financial Resources for People With Cancer

A list of organizations that offer financial assistance for people with cancer who are affected by COVID-19.

Managing Your Cancer Care During an Emergency

Information on how to prepare for and what to do during an emergency or natural disaster, including special considerations during the COVID-19 pandemic. Available in English and Spanish (Español).

When to Call the Doctor During Cancer Treatment

Information on preventing and identifying certain serious side effects of cancer treatment, including COVID-19 infection.  

How to Safely Keep Up With Your Cancer Screening and Care During COVID-19

Dr. Abenaa Brewster discusses why attending your scheduled cancer care and screening appointments during the COVID-19 pandemic is so important and how to do so safely.  

How People With Cancer Can Make the Most of Televisits

Dr. Carolyn Hendricks discusses the benefits of the new shift to televisits, and how people with cancer can make the most out of their time with their doctor during these appointments. 

Managing Side Effects of Cancer Treatment During Social Distancing

A downloadable PDF to help people with cancer identify, track, and manage side effects at home during the COVID-19 pandemic, including links to more information. Developed by the Center for Business Models in Healthcare and the 4R Collaborative.

 

Coping With COVID-19 and Social Distancing

The Real-Life Impacts of COVID-19 on People With Cancer

Dr. Lidia Schapira, 2015–2021 Cancer.Net Editor in Chief, talks about the real-life impacts COVID-19 has on people who are living with, being treated for, or have survived cancer. 

COVID-19, Cancer, and Uncertainty: An Oncologist’s Perspective on Coping

Dr. Anthony Provenzano discusses how he’s seen COVID-19 impact people with cancer, including the uncertainty and fear the pandemic has caused and how people can cope.

Job Loss During Cancer: How to Cope and Continue Treatment

People with cancer who have lost their job or have had a close family member lose vital income face tough decisions. Here are tips to deal with the uncertainty that comes with a job loss and steps to take to continue cancer treatment. 

How to Provide Support as a Long-Distance Cancer Caregiver

Dr. Ranak Trivedi describes the unique challenges long-distance caregivers face and offers suggestions on how best to support their loved one with cancer.

Coping With the Holidays During COVID-19 and Cancer

Dr. Lidia Schapira discusses how the holiday season will differ this year for people with cancer and their loved ones, and how they can best cope with those changes.

 

Research on COVID-19 and Cancer

ASCO20 Virtual Scientific Program: The Global Impact of COVID-19 on People With Cancer

The ASCO20 Virtual Scientific Program was held May 29 to May 31, 2020. Read highlights of 2 studies addressing how the coronavirus pandemic is affecting people with cancer in English and Spanish (Español).

2020 National Cancer Opinion Survey: Cancer Screening and Mental Health During COVID-19, Racism and Cancer Care, and Misperceptions Around Cancer Clinical Trials

The 2020 National Cancer Opinion Survey reveals the COVID-19 pandemic’s effects on cancer screening and mental health, racism’s impact on health care, and widely held misperceptions about cancer clinical trials. 

The Impact of COVID-19 on Black and Hispanic People with Cancer: Research from the 2020 Quality Care Symposium

Research from the 2020 Quality Care Symposium underscores the effect the COVID-19 pandemic has on Black and Hispanic people with cancer. 

Систематический обзор анализа влияния на бюджет противоопухолевых препаратов рака легкого | Экономическая эффективность и распределение ресурсов

На рис. 1 представлена ​​сводная информация о стратегии поиска и ее результатах. Первоначально было найдено 1490 статей по выявленным ключевым словам об анализе влияния противоопухолевых препаратов на бюджет. После дедупликации (n = 117), проверки заголовка и реферата (n = 1228) и полного текста оставшихся исследований (n = 131) 14 пунктов были окончательно включены в BIA исследований противоопухолевых препаратов для лечения рака легких.Половина из 14 исследований были из Европы и Америки, среди которых шесть исследований были проведены для населения США [31,32,33,34,35,36] и одно для Норвегии [28]. В другой половине есть 3 исследования из Таиланда [21, 22, 26] и 3 исследования из Китая [25, 37, 38] и 1 исследование из стран Южной Америки [29].

Рис. 1

Блок-схема стратегии поиска литературы

В таблице 1 обобщена общая информация по 14 выбранным исследованиям BIA [31,32,33,34,35,36, 39,40,41,42,43, 44,45,46].Тринадцать статей были изучены на основе моделей [31,32,33,34,35,36, 39,40,41,42,43, 45, 46] и одна статья была изучена на основе популяционных рандомизированных контролируемых исследований [44]. Подходящие группы населения выбирались в основном в соответствии с охватом плана плательщика [31, 32, 33, 34, 35, 36, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46]. В тринадцати исследованиях целевая популяция была ограничена в зависимости от типа и степени рака легкого [31, 32, 33, 34, 35, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46]. Половина из 14 статей были из развитых стран, из них 6 из США [31,32,33,34,35,36], 1 из Норвегии [43]; остальные 3 были из Таиланда [39, 40, 42], 3 из Китая [41, 45, 46] и 1 из развивающихся стран Южной Америки [44].

Таблица 1 Общая информация о выбранных BIA

В таблице 2 обобщен метод анализа влияния на бюджет и результаты исследований рассмотренных исследований. Мы усовершенствовали ключевые элементы, такие как модель приложения, перспектива исследования, сроки бюджета, план лечения, прямые затраты, косвенные затраты, источники клинических данных и данных о затратах, а также методы анализа чувствительности. В 14 исследованиях 13 исследований проводились с позиции плательщика и больницы, только одно исследование проводилось с позиции частных страховых компаний [32]. Четыре исследования рассматривали гипотетическую популяцию с точки зрения коммерческого планирования здравоохранения [31, 32, 35, 36], которые были проведены для населения США. Было проведено 13 исследований, в которых определялась исследовательская модель, в большинстве из которых использовалась модель расчета стоимости BIA (также называемая моделью принятия решения о стоимости) [31, 32, 33, 35, 36, 39, 41, 42, 45, 46], и только два из которых использовали модель Маркова [40] и модель Монте-Карло [34] для моделирования болезненного процесса.

Таблица 2 Методология и бюджетные результаты BIA

Временной горизонт бюджета, определенный для модели, основан на требованиях держателя бюджета.Бюджетный временной горизонт включенных исследований был сосредоточен в пределах 1–5 лет, и было 6 исследований с более короткими бюджетными периодами, всего 1 год [31,32,33,34, 43, 44]. В большинстве исследований временной горизонт бюджета представлен в 3 года или более, в 3 исследованиях временной горизонт бюджета представлен в 3 года [35, 42, 46], в 1 исследовании представлен временной горизонт бюджета в 4 года [39]. Четыре исследования представили пятилетний горизонт бюджета [36, 40, 41, 45].

Стратегия лечения в рассматриваемых исследованиях была изложена в 14 исследованиях.В большинстве исследований сравнивали исследуемый препарат между стратегией лечения А и стратегией лечения В при различных сценариях [31,32,33,35,39,40,41,42,43, 45, 46]. В двух исследованиях сравнивали разные дозы одного и того же препарата в базовом анализе [34, 36]. В одном исследовании стратегии лечения не сравнивались, а разделялись по разным методам оплаты, включая разделение затрат, разделение риска, оплату по результатам и скидку [44].

Расчет затрат в рассмотренных исследованиях сводился к прямым затратам и затратам, связанным с состоянием.Прямые затраты, включаемые в отбор хозрасчета, в основном учитывают стоимость лекарственных средств и стоимость генетического тестирования. Стоимость неблагоприятного события и затраты на управление называются затратами, связанными с состоянием. В восьми исследованиях рассчитывались только прямые затраты [32, 33, 34, 39, 41, 44, 45, 46], а в шести исследованиях при расчете затрат были выбраны прямые затраты плюс затраты, связанные с условиями [31, 35, 36, 40, 42, 43]. ]; Руководство рабочей группы ISPOR [5] рекомендует, чтобы данные поступали из наилучших доступных источников и тщательно цитировались для обеспечения прозрачности и воспроизводимости.Во всех 14 исследованиях, включенных в исследование, был четко указан источник клинических данных и данных о затратах [31,32,33,34,35,36, 39,40,41,42,43,44,45,46], как правило, из опросов. , официальные национальные данные, опубликованную литературу и некоторые из рандомизированных контролируемых испытаний.

Из 14 рассмотренных исследований двенадцать исследований подвергались анализу чувствительности, и все методы проводились с использованием одностороннего анализа чувствительности [31, 32, 34,35,36, 39,40,41,42,43, 45, 46]. Однако выбор параметров анализа чувствительности непостоянен, например, следует ли анализировать цикл лечения.Что касается исследований по анализу воздействия лекарств на бюджет, то руководство ISPOR Task Force не рекомендовало дисконтирование [5], поэтому мы не учитывали дисконтирование.

Что касается индикаторов результатов, мы обнаружили, что все включенные исследования были представлены в виде бюджетных сумм. Шесть исследований показали увеличение бюджетных результатов [31, 32, 35, 36, 39, 42]. В одном из исследований объяснялось, что в основном это было связано с удорожанием лекарств, то есть увеличением стоимости выживаемости без прогрессирования и продления цикла лечения [42].Другое исследование показало, что более высокий прирост бюджета в медицинском страховании был обусловлен более высокой частотой метастатического плоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого среди пожилых пациентов медицинского страхования [35]. Наоборот, бюджет шести исследований уменьшился [40, 41, 43,44,45,46]. В одном из исследований для объяснения результатов анализа воздействия на бюджет использовалась ожидаемая годовая разница между затратами и возмещением [33]. Одно исследование, проведенное в США, показало, что персонализированное дозирование лекарств привело к экономии затрат по сравнению с фиксированным дозированием [34].

В таблице 3 представлены сводные данные об оценке качества в соответствии с рекомендациями рабочей группы ISPOR [5]. Согласованность включенных BIA и руководств рабочей группы ISPOR указывает на то, что общее качество включенных исследований было хорошим, и 9 включенных исследований соответствовали как минимум 8 рекомендациям (≥ 88,9%) [32,33,34,35,36]. , 40, 41, 43, 45], 4 исследования [31, 39, 42, 46] следовали 7 пунктам (77,8%) рекомендаций. Только 1 исследование [44] сопровождалось менее чем 5 пунктами (44,4%). В целом, в большинстве исследований не сообщалось о проверке модели, и только в 14.В 3% исследований проводилась проверка модели.

Таблица 3 Оценка качества BIA

Цены на противораковые препараты и клинические результаты: кросс-секционное исследование в Италии политики во всем мире.1–8 Для решения этой проблемы предлагаются различные решения, из которых ценовые переговоры с фармацевтическими компаниями предлагаются в качестве важной стратегии, особенно в США.

9–11 Поскольку программе Medicare не разрешено договариваться о ценах с компаниями, несмотря на то, что она уполномочена покрывать каждый препарат, одобренный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA), различные эксперты утверждают, что это является причиной высоких цен на лекарства в США. . Действительно, цены на лекарства от рака намного превышают затраты на их разработку12; такие переговоры могли бы помочь снизить цены на лекарства от рака, о чем свидетельствует более низкая стоимость лекарств от рака в других развитых странах по сравнению с США.

Однако мало что известно о том, приведут ли такие переговоры к лучшей корреляции между ценами на лекарства от рака и преимуществами, которые они обеспечивают.Исследования показали, что цены на лекарства не коррелируют с клиническими преимуществами противораковых препаратов, одобренных FDA, даже несмотря на то, что в таких исследованиях не учитывались центральные переговоры о ценах.13 14 Такие страны, как Великобритания и Италия, договариваются о ценах, корреляции могут быть разными.

В Италии согласование цен на лекарства на основе оценки экономической эффективности является обязательным с 2001 г. для всех лекарств, стоимость которых возмещается Национальной службой здравоохранения (NHS).15, 16 Мы проанализировали корреляцию между ценами на противораковые препараты в Италии и их клиническими результатами. проверить гипотезу о том, что центральные переговоры о ценах приводят к лучшему согласованию цен и выгод.

Методы

Идентификация исследуемого образца

Все новые препараты, одобренные Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA) в рамках централизованной процедуры в период с января 2010 г. по июнь 2016 г. для лечения солидного или гематологического рака, были изначально идентифицированы. Генерики, биоаналоги, интерфероны и гранулоцитарно-колониестимулирующие факторы были исключены. В когорту для анализа были включены только противоопухолевые препараты с опорными испытаниями, основанными на общей выживаемости (ОВ), выживаемости без прогрессирования (ВБП) или частоте объективных ответов (ЧОО) и с ценами, которые были официально согласованы в Италии к 31 декабря 2016 года.

Извлечение данных

Информация о клинических исходах (с точки зрения медианы ОВ, медианы ВБП и ЧОО) была извлечена двумя соисследователями (FB-A и RP) из основных исследований, которые сравнивали новые методы лечения с контролем, как сообщалось в European Public Отчеты об оценке (EPAR) (сводная таблица основного исследования, раздел 2.5.2), общедоступные на веб-сайте EMA (www.ema.europa.eu). Время выживания выражали в неделях, а сообщаемые ОВ и ВБП при необходимости преобразовывали.Также была получена информация о терапевтических показаниях и типе опухоли.

Цены на лекарства

Стоимость полного курса или годичного лечения была оценена двумя соисследователями (Н.М. и И.Е.) на основе согласованной официальной цены на франко-завод (в евро) упаковок лекарств, опубликованной в Официальный вестник Итальянской Республики (www.gazzettaufficiale.it) и с учетом дозировки, указанной в сводке характеристик продукта (SPC). Чтобы сравнить цены на препараты с разными графиками, в тексте мы ссылаемся на цены на препараты как на стоимость полного курса или 1-летнего лечения. Дальнейшая оценка учитывала дополнительные обязательные скидки17 или экстраскидки, которые были согласованы с фармацевтическими компаниями; эта информация является конфиденциальной для общественности, но передается в отделы закупок итальянской NHS (например, в регионы, больницы и местные медицинские учреждения).

Статистический анализ

Следующие переменные были извлечены и описательно проанализированы: год утверждения, терапевтические показания, тип лечения и контрольные группы, данные о результатах, официальные и конфиденциальные затраты на лечение (1 год или полный курс) и нормативная информация ( условное/при исключительных обстоятельствах одобрение или статус орфанного препарата).

Взаимосвязь между клиническими исходами и стоимостью противоопухолевых препаратов была установлена ​​с помощью простой модели линейной регрессии. Клинический исход, который был зависимой переменной, выражали как абсолютные или процентные различия исходов между лечебной и контрольной группами. Для каждой модели приводили коэффициенты регрессии β, их уровни значимости p и коэффициенты детерминации R ² .

Мы также провели несколько анализов чувствительности, чтобы проверить надежность результатов.В частности, мы выполнили множественную линейную регрессию с типом опухоли в качестве независимой переменной, чтобы учесть потенциальные различия, связанные с характеристиками опухоли. Кроме того, мы также повторили анализ после исключения различий в отрицательных исходах (в двух случаях один из исходов в группе, получавшей новый препарат, был хуже, чем в группе сравнения) и активно контролируемых испытаний (с учетом только плацебо-контролируемых испытаний). Анализ подгрупп по типу опухоли также был предпринят в качестве исследовательского анализа, когда наблюдалось минимальное количество двух противоопухолевых препаратов в условиях одного и того же типа опухоли.Выбросы не исключались из анализа, но их влияние оценивалось и сообщалось, когда это уместно, в виде отдельного анализа. Все статистические анализы были выполнены с использованием STATA (StataCorp, V.14.0)

Участие пациентов и общественности

Пациенты не участвовали в разработке исследовательского вопроса или дизайна этого исследования. Тем не менее, результаты этого анализа будут распространяться на публичных конференциях с заявлениями, обобщающими наши результаты, и с открытым доступом к опубликованному отчету, размещенному на наших институциональных веб-сайтах.

Результаты

EMA одобрило 56 различных показаний к онкологическим заболеваниям посредством централизованных процедур.Для 40 новых противоопухолевых препаратов (47 показаний) основанием для одобрения послужило опорное исследование, в котором в качестве основного исхода принималась ОВ, ВБП или ЧОО; переговоры о цене были завершены к декабрю 2016 г. только для 30 новых противоопухолевых препаратов (35 показаний), которые включены в наш анализ (таблица 1). Семь препаратов получили статус орфанных препаратов EMA, а два (вандетаниб и кризотиниб) получили условное одобрение. Из 35 онкологических показаний, протестированных в 35 различных опорных исследованиях, которые все были контролируемыми клиническими испытаниями, наиболее частыми показаниями были меланома (7 из 35), затем гематологический рак (6 из 35) и немелкоклеточный рак легкого ( 4 из 35).В 15 таких исследованиях (43%) в качестве контрольной группы использовалось плацебо. Из 35 показаний данные по ОВ, ВБП и ЧОО были доступны для 17, 29 и 29 показаний соответственно. Каждая пара «препарат-показания» участвовала в одном или нескольких таких анализах, в зависимости от того, какие исходы были зарегистрированы в EPAR.

Таблица 1

Характеристики 30 противоопухолевых препаратов, включенных в анализ

В группах лечения медиана улучшения ОВ и ВБП составила 11,4 недели (МКР 8,8–17,2; мин. 13,4 недели).2; макс 23,5) и 12,8 нед (межквартильный интервал 6,4–17; мин -7,48; макс 58,8) соответственно; среднее улучшение ORR в группе лечения составило 21,8% (IQR 10–34,6; мин. -3; макс. 63,3). Приведенные диапазоны имеют отрицательные минимальные значения, поскольку в двух случаях — ниволумаб для НМРЛ и регорафениб для стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта — экспериментальное лечение оказало отрицательное влияние на один из исходов по сравнению с контрольной группой (с точки зрения ВБП для ниволумаба и ЧОО для регорафениба). ). Средняя договорная цена за годовое лечение составила 72 392 евро (53 819–85 800 иракских рупий; минимум 4 942; максимум 142 785), которая была дополнительно снижена на 25% (в среднем) после применения конфиденциальных скидок.Для всех противоопухолевых препаратов, кроме ипилимумаба, цена была рассчитана как курс лечения в течение 1 года, поскольку дозировка, указанная в SPC, указывала на то, что лечение следует продолжать до тех пор, пока наблюдается клиническая польза или пока не возникает неприемлемая токсичность. В случае ипилимумаба цена была рассчитана как курс из четырех доз, как указано в SPC.

Официальная (фабричная) цена новых противоопухолевых препаратов и абсолютные клинические результаты не коррелировали (рис. 1А–С). Взаимосвязь между улучшением медианы ОВ (в неделях) и договорной ценой оценивалась для 16 препаратов (17 показаний), корреляции не наблюдалось (R ² =0.067). Когда клинические исходы выражали как абсолютное преимущество по медиане ВБП или ЧОО, для анализа были доступны 25 препаратов (29 показаний), и в этих случаях корреляции не наблюдалось (R ² = 0,004  и 0,006 соответственно).

Рисунок 1

Корреляция между ценами на противораковые препараты (официально согласованные) и пользой для здоровья. (A) Официальная договорная цена (заводская) по сравнению с разницей в медианной ОВ (в анализ включены 16 препаратов: 15 с одним показанием и 1 с двумя показаниями).(B) Официальная договорная цена (заводская) по сравнению с разницей в медиане ВБП (в анализ включены 25 препаратов: 22 с одним показанием, 2 с двумя показаниями и 1 с тремя показаниями). (C) Официальная договорная цена (заводская) по сравнению с долей ORR (24 препарата включены в анализ: 20 с одним показанием, 3 с двумя показаниями и 1 с тремя показаниями). ОС, общая выживаемость; ORR, частота объективных ответов; ВБП, выживаемость без прогрессирования.

Повторяя анализы и принимая во внимание дополнительные конфиденциальные скидки, которые являются обязательными для больничных закупок, не было выявлено улучшения соотношения выгоды/цены (рис. 2A–C).Эти результаты также оставались неизменными, когда анализы повторялись с поправкой на тип опухоли (дополнительная онлайн-таблица 1) или когда клинический результат выражался в процентах улучшения, а не как абсолютная разница (онлайн-дополнительная рис. 1a–c). Анализы чувствительности, которые исключали отрицательные улучшения исходов по сравнению с контрольной группой (дополнительный онлайн-рисунок 2) и учитывали только данные плацебо-контролируемых испытаний (дополнительный онлайн-рисунок 3a,b), подтвердили основной анализ.Исследовательский анализ подгрупп по типу опухоли не выявил специфических положительных закономерностей корреляции в зависимости от расположения опухоли (онлайн-дополнительная фигура 4A, B).

Рисунок 2

Корреляция между ценами на противораковые препараты (со скидкой) и пользой для здоровья. (A) Цена со скидкой с дополнительными обязательными скидками по сравнению с разницей в медиане ОВ (в анализ включены 16 препаратов, относящихся к одному показанию). (B) Цена со скидкой с дополнительными обязательными скидками по сравнению с разницей в медиане ВБП (в анализ включены 25 препаратов: 22 с одним показанием и 3 с двумя показаниями).(C) Цена со скидкой с дополнительными обязательными скидками по сравнению с долей ORR (в анализ включены 24 препарата: 20 с одним показанием и 4 с двумя показаниями). ОС, общая выживаемость; ORR, частота объективных ответов; ВБП, выживаемость без прогрессирования.

Обсуждение

Это исследование является первой попыткой оценить, была ли лучшая корреляция между ценами на противораковые препараты и клиническими результатами в условиях, когда центральные переговоры о цене являются обязательными для каждого нового лекарства.Наше исследование дало неожиданные результаты по исследовательскому вопросу, подчеркнув отсутствие связи между стоимостью противораковых препаратов и преимуществами. Более того, все предварительно заданные анализы чувствительности и подгрупп подтвердили основные выводы. Этот вывод будет иметь важные последствия для политики как для таких стран, как США, где переговоры о ценах отсутствуют, так и для других стран, таких как Италия, где переговоры о ценах существуют.

В нашем исследовании корреляция между затратами на лекарства и клиническими результатами была даже ниже, чем те, которые ранее отмечались в контексте США,13 14 показывая, что переговоры не изменили отношения между ценами на лекарства и положительной выгодой. Таким образом, более высокие цены на лекарства остаются, несмотря на итальянское законодательство, где утверждение, основанное на анализе эффективности затрат и переговорах о цене, является обязательным по закону с 2001 года.15 16 Этот вывод может поставить под сомнение роль самих переговоров. Однако важно понимать, что такие страны, как Италия, которые ведут переговоры о ценах на лекарства, ведут такие переговоры только для бинарных решений об одобрении или неутверждении, не принимая во внимание в ходе переговоров четкую корреляцию между ценами и преимуществами.Это понимание важно для принятия политических решений в отношении рака.

Действительно, ни в одной стране нет законодательной политики, позволяющей вести переговоры по разным ценам на препараты, одобренные на основе суррогатных конечных точек, по сравнению с исходами выживания, или на препараты, улучшающие выживаемость за несколько дней, по сравнению с теми, которые улучшают выживаемость за месяцы, или на препараты с незрелой пользой и риском profiles. 18–22 Несмотря на шаги в правильном направлении, в отсутствие такой политики системы ценностей, предложенные такими организациями, как ASCO, ESMO или NCCN, стали не более чем интеллектуальными упражнениями.23–26

Еще одна причина, по которой переговоры о цене не привели к лучшему соотношению цены и стоимости, заключается в том, что из-за глобального рынка лекарств каждая отдельная страна, хотя и большая, представляет лишь небольшую часть потребительского рынка. Таким образом, компании «орудуют палкой», устанавливая максимальную цену, которую выдержит рынок27. Кроме того, в Италии не определено пороговое значение коэффициента приростной эффективности затрат (ICER); таким образом, не существует ограничений, которые можно было бы использовать в качестве правила принятия решений при распределении ресурсов во время переговоров/решений о возмещении.Отсутствие такого рода отсечки могло способствовать получению отрицательных результатов в нашем исследовании. Тем не менее, мы признаем, что даже когда порог для ICER хорошо установлен, как, например, в Великобритании28, в случае противоопухолевых препаратов допускаются постоянные исключения. Например, специальный фонд, созданный в 2010 г. (т. е. Фонд лекарств от рака), был недавно распущен парламентом, поскольку он не приносил значимой пользы пациентам или обществу.29

В контексте ЕС (где более новые противоопухолевые препараты одобрены EMA без учета добавленной стоимости или экономической эффективности) сложность еще больше возрастает, поскольку после выдачи регистрационного удостоверения может стать трудным решить вопрос возмещения расходов в кратчайшие сроки. Национальный уровень.30 Более того, плательщикам (NHS/страховые компании) также трудно защищать тезис от общественного мнения о том, что стоимость противоракового препарата не может быть возмещена из-за его слишком высокой стоимости.30 31 Действительно, как показывает наше исследование, конфиденциальные скидки после переговоров между государство-член и компания не улучшают корреляцию между затратами на лечение и выгодами, даже если они снижают абсолютные цены на лекарства.

Еще одним фактором, негативно влияющим на договорную силу переговоров, является непрозрачная информация о ценах на лекарства в разных странах. Трудности с получением полной информации о ценах уже были выявлены в ходе недавнего исследования, в котором сравнивались цены на противораковые препараты в 16 странах ЕС, Австралии и Новой Зеландии.32 Vogler et al. соглашения об управляемом входе (MEA), призывающие к большей прозрачности. Авторы заявляют, что в интересах политиков удалить положения, ограничивающие раскрытие информации о ценах, поскольку они рискуют переплатить, устанавливая цены с помощью внешних ссылок на цены.Это опасение может иметь значение в итальянском контексте, поскольку процедура переговоров о возмещении расходов принимает во внимание цену в других странах ЕС, а также цену на аналогичные продукты в той же фармакотерапевтической группе.33

Мы считаем, что лица, определяющие политику, могут использовать два частично независимых подхода для достижения лучшего баланса между ценами на противораковые препараты и выгодами. Во-первых, переговоры о цене должны более строго основываться на уровне доказательств, а также на величине выгоды. Показатель ICER (такой как QALY) должен представлять собой порог возмещения, устанавливая, таким образом, отправную точку для переговоров о цене и корректируя порог ICER на основе величины достигнутой относительной выгоды. Если информация об относительной стоимости недоступна на момент утверждения, сравнения могут быть выполнены с использованием косвенных методов, тогда как после выхода на рынок плательщики должны играть основную роль в поддержке процесса получения доказательств.

Второй подход, который может обеспечить более низкие цены, потребует большей прозрачности в отношении затрат на процесс разработки лекарств, включая относительный вклад научных кругов и государственного сектора в разработку лекарства.34–38 Например, исследование, проведенное для оценки процессов разработки лекарств, показало, что около половины наиболее трансформирующих лекарств, одобренных FDA, внесли значительный вклад в их разработку академическими исследователями, поддерживаемыми государственным финансированием34, 35; кроме того, было подсчитано, что затраты на поздние клинические разработки занимают ограниченную часть всего процесса. 36 Вероятно, настало подходящее время должным образом признать вклад финансируемых государством исследований во время переговоров с компаниями о ценах на лекарства.Часто исследования сравнительной эффективности финансируются государственными учреждениями для проверки различных методов лечения в реальной практике на надежные результаты при более длительном наблюдении или в особых популяциях. продукт.

Другие подходы, определенные как возможные решения для обеспечения устойчивости системы здравоохранения, относятся к общему управлению системой, то есть когда цена уже установлена. На самом деле были смоделированы подход «цена-объем»49 или ценообразование на основе показаний40, 41, каждый из которых имеет свои плюсы и минусы.Более того, учитывая, что различные онкологические учреждения олигополистичны, что позволяет воздерживаться от ценовой конкуренции, другим возможным решением являются национальные/региональные тендеры среди терапевтических категорий, когда доступно больше альтернатив. 42

Основные ограничения нашего исследования касаются полноты данных о клинических результатах и ​​цене. В качестве оценки пользы мы использовали данные опорных испытаний, полученные из EPAR. Более того, нам неизвестно, стали ли доступны дополнительные (более надежные) данные на более позднем этапе, когда цена согласовывалась на национальном уровне.Таким образом, мы не можем исключить, что корреляция между ценами на лекарства и терапевтическим эффектом может улучшиться с учетом данных, полученных после выхода на рынок противоопухолевых препаратов.

Еще одним важным ограничением является то, что мы не рассматривали показатели качества жизни как еще один показатель клинической пользы. Кроме того, недавнее исследование показало, что показатели качества жизни обычно не собираются и не публикуются, и что инструменты, используемые для измерения качества жизни, варьируются, чтобы иметь единый показатель для сравнения.43 Хотя мы включили в наш анализ суррогатные показатели, такие как ВБП или ЧОО, в качестве клинических исходов, поскольку они рассматривались в качестве основания для одобрения регулирующим органом, эти суррогатные показатели не всегда коррелируют с истинными клиническими преимуществами с точки зрения улучшения выживаемости или улучшения качество жизни. 43, 44 Что касается оценки стоимости, мы оценили стоимость лечения в течение 1 года или всего курса в случае ипилимумаба, когда курс лечения длится менее 1 года.Однако исключение ипилимумаба не изменит основных результатов.

Другим фактором, который мог повлиять на оценку цены, является скидка, полученная на региональном/местном уровне после тендеров на лекарства. Эта информация не была доступна для анализа и не могла быть обобщена на национальном уровне. Кроме того, ожидалась дополнительная экономия «апостериорно» от действующих в Италии МЭС (информация о которых не является общедоступной) и не учитывалась при анализе.

Наше исследование представляет собой ретроспективное кросс-секционное корреляционное исследование, целью которого является оценка того, приводит ли централизованное согласование цен (обязательное по закону в Италии) к лучшему согласованию цен и преимуществ, известных на момент утверждения препарата. Это означает, что наш анализ не направлен на сравнение затрат и результатов внутри классов препаратов, как обычное исследование рентабельности, и мы никогда не собирались оценивать добавленную стоимость одобренных препаратов в контексте всех других препаратов, имеющих те же показания. Принятый нами «популяционный»/когортный подход имеет внутреннее ограничение, заключающееся в том, что он включает препараты, одобренные для разных показаний или разных типов рака (с различной частотой/распространенностью) на основе разных наборов клинических данных. Последующая неоднородность, возникающая в результате этого подхода, была разрешена путем корректировки корреляционного анализа по типу опухоли или проведения нескольких субанализов. Следуя этому подходу, мы обнаружили, что результаты согласуются с первичными выводами, что подтверждает надежность методов и результатов.

Куркума | Дополнительная и альтернативная терапия

Куркума рекламируется как альтернативное средство от рака. Есть некоторые доказательства того, что куркумин, вещество в куркуме, может убивать раковые клетки при некоторых видах рака. Но нам нужно больше исследований.

Сводка

• Куркума — пряность, выращиваемая во многих азиатских странах.
• Продолжаются исследования куркумина как средства для лечения рака.
• При приеме в больших количествах могут иметь побочные эффекты.

Что такое куркума?

Куркума также известна как индийский шафран, цзян хуан, харидра и халди. Это специя, выращиваемая во многих азиатских странах. Он принадлежит к семейству имбирных и является основным ингредиентом порошка карри.

Основным активным ингредиентом куркумы является куркумин или диферулоилметан. Лабораторные исследования показали, что куркумин оказывает противораковое действие на раковые клетки.

Почему люди, больные раком, используют его

Исследования показали более низкий уровень некоторых видов рака в странах, где люди потребляют больше куркумина.Это при уровне куркумина от 100 до 200 мг в день в течение длительных периодов времени.

Несколько лабораторных исследований раковых клеток показали, что куркумин обладает противораковым действием. Похоже, что он способен убивать раковые клетки и предотвращать рост новых. Лучше всего он влияет на рак молочной железы, рак кишечника, рак желудка и раковые клетки кожи.

В настоящее время нет четких доказательств того, что куркума или куркумин могут предотвращать или лечить рак у людей.

Как есть

Куркуму можно принимать в сыром виде, в виде порошка, пасты или экстракта.Он также доступен в виде масла.

Побочные эффекты куркумы

Важно помнить, что куркума, используемая в кулинарии, очень безопасна. Но мы не знаем, насколько безопасен куркумин при использовании по медицинским показаниям. До сих пор исследования, кажется, показывают, что он вызывает мало побочных эффектов или вообще не вызывает их. Но мы мало знаем о побочных эффектах приема его в больших количествах для лечения или профилактики рака.

Люди сообщали о боли в животе при употреблении слишком большого количества куркумы. Они также сообщали о проблемах с кожей при приеме в течение длительного времени. Итак, если вы используете куркумин по причинам, отличным от приготовления пищи, сначала поговорите со своим врачом.

Агентство по регулированию лекарственных средств и изделий медицинского назначения (MHRA) предупредило об использовании Фортодола (также продаваемого как Мирадин). Это пищевая добавка на основе куркумы.

Фортодол содержит сильный противовоспалительный препарат нимесулид. Нимесулид может вызвать серьезное поражение печени. Знаки включают:

• пожелтение кожи (желтуха)
• потемнение мочи
• плохое самочувствие или недомогание
• необычная усталость
• боль в желудке или животе
• потеря аппетита

У этого лекарства нет лицензии в Великобритании.Агентство по пищевым стандартам (FSA) США заявляет, что продукты с неизвестным количеством нимесулида могут быть очень вредными.

Исследование куркумина как средства для лечения рака

Несколько исследований изучали, может ли куркумин быть средством для лечения рака. Они дали многообещающие результаты.

Одним из таких в 2013 году было международное лабораторное исследование клеток рака кишечника. В нем рассматривались эффекты комбинированного лечения куркумином и химиотерапией. Исследователи пришли к выводу, что комбинированное лечение может быть лучше, чем только химиотерапия.

Проблема, выявленная рядом обзорных исследований, заключается в том, что куркумин плохо усваивается. Это делает его менее эффективным в качестве лечения. Исследователи ищут пути решения этой проблемы.

Нам нужно больше клинических испытаний на людях, прежде чем мы узнаем, насколько хорошо это работает при лечении рака.

Сколько это стоит

Фортодол и Мирадин доступны в Великобритании и в Интернете в качестве пищевых добавок. FSA советует всем, кто принимает эти продукты, немедленно прекратить это делать.Им следует обратиться к врачу, если у них есть какие-либо признаки заболевания печени.

Не верьте информации в интернете, не подкрепленной исследованиями. И не платите за альтернативную терапию рака в Интернете.

Слово предостережения

Понятно, что вы можете попробовать что-нибудь, если вы думаете, что это может помочь в лечении или излечении вашего рака. Только вы можете решить, использовать ли альтернативную терапию рака, такую ​​как куркума.

Вы можете нанести вред своему здоровью, если прекратите лечение рака из-за недоказанного лечения.

Многие веб-сайты рекламируют куркуму как лекарство от рака. Но никакие авторитетные научные онкологические организации не поддерживают ни одно из этих утверждений.

Центральная роль CD4+ Т-клеток в противоопухолевом иммунном ответе | Журнал экспериментальной медицины

Индукция оптимального системного противоопухолевого иммунитета включает примирование как CD4 ⁺ , так и CD8 ⁺ Т-клеток, специфичных к опухолеассоциированным антигенам. Роль CD4 ⁺ Т-хелперных клеток (Th) в этом ответе в значительной степени объясняется обеспечением регуляторных сигналов, необходимых для праймирования цитолитических Т-лимфоцитов CD8 ⁺ , ограниченных классом I главного комплекса гистосовместимости, которые, как считается, служат доминантные эффекторные клетки, опосредующие уничтожение опухоли. Однако анализ эффекторной фазы отторжения опухоли, индуцированного вакцинацией облученными опухолевыми клетками, трансдуцированными для секреции гранулоцитарного/макрофагального колониестимулирующего фактора, указывает на гораздо более широкую роль CD4 ⁺ Т-клеток в организации ответа хозяина на опухоль. Эта форма иммунизации приводит к одновременной индукции Th2- и Th3-ответов, оба из которых необходимы для максимального системного противоопухолевого иммунитета. Цитокины, продуцируемые этими CD4 ⁺ Т-клетками, активируют эозинофилы, а также макрофаги, которые продуцируют как супероксид, так и оксид азота.Оба этих типа клеток затем сотрудничают в месте заражения опухолью, вызывая ее разрушение.

Исключительная специфичность распознавания антигена Т-клетками иммунного ответа обеспечивает важную основу для иммунотерапии рака. Способность отличать опухолевые клетки от нормальных тканей имеет решающее значение для обеспечения эффективного разрушения опухоли при минимизации токсичности. Действительно, выделение опухолеспецифических Т-клеток у больных раком стимулировало поиск антигенов, ассоциированных с опухолью.Молекулярная идентификация нескольких таких антигенов, особенно в случае меланомы человека, позволила разработать стратегии вакцинации, нацеленные конкретно на определенные опухолевые антигены (1–3).

В условиях, когда соответствующие антигены отторжения опухоли еще предстоит определить, вакцинация модифицированными цельными опухолевыми клетками в качестве источника антигена была изучена как средство запуска системного противоопухолевого иммунитета. Было показано, что ответ хозяина на эту форму вакцинации значительно усиливается, когда иммунизирующие опухолевые клетки трансдуцируются генами, кодирующими цитокины или другие молекулы, участвующие в регуляции иммунных ответов (4).Как для стратегий, основанных на опухолевых клетках, так и для стратегий вакцинации с определенным антигеном, исследования истощения субпопуляции Т-клеток обычно демонстрировали потребность как в CD4 ⁺ , так и в CD8 ⁺ Т-клетках для системного отторжения опухоли.

Учитывая, что большинство некроветворных опухолей экспрессируют молекулы МНС класса I, которые служат ограничивающим элементом для распознавания Т-клеток CD8 ⁺ , но не экспрессируют молекулы МНС класса II, которые необходимы для распознавания Т-клеток CD4 ⁺ , предполагалось, что преобладающим эффекторным механизмом тумороцидного действия является уничтожение CD8 ⁺ CTL.Потребность в CD4 ⁺ Т-клетках в этих ответах была приписана оказанию помощи во время прайминга для достижения полной активации и эффекторной функции опухолеспецифических ЦТЛ. Действительно, рестриктированные Т-клетки MHC класса I CD8 ⁺ , которые специфически лизируют опухолевые клетки in vitro, часто измеряют для подтверждения эффективности вакцины и служат суррогатной конечной точкой в ​​​​клинических испытаниях противоопухолевой вакцины.

Однако несколько линий доказательств указывают на более широкую роль CD4 ⁺ Т-клеток в опосредовании других важных противоопухолевых эффекторных функций. Во-первых, исследования, в которых мышей вакцинировали за несколько недель до заражения живой опухолью, показали, что, хотя иммунологически интактные мыши были способны отторгать опухоль, истощение Т-клеток CD4 ⁺ с помощью mAb непосредственно перед заражением опухолью приводило к полной потере отторжение опухоли (5). В этих экспериментах помощь Т-клеток для примирования ЦТЛ была полностью доступна во время вакцинации. Этот результат предполагает, что Т-клетки CD4 ⁺ играют более непосредственную роль в эффекторной фазе отторжения опухоли.Во-вторых, ранее мы продемонстрировали, что вакцинация против опухолевых клеток, полностью лишенных экспрессии МНС класса I, приводила к отторжению опухоли, которое было сравнимо с отторжением, наблюдаемым при заражении МНС класса I положительным вариантом той же опухоли (6). Истощение либо CD4 ⁺ Т-клеток, либо NK-клеток, но не CD8 ⁺ Т-клеток, привело к невозможности отклонить отрицательный вариант MHC класса I, предполагая, что CD4 ⁺ Т-клетки могут оказывать помощь, а также мера антигенной специфичности к эффекторным клеткам иммунного ответа, которые сами по себе не обладают способностью к антигенспецифическому распознаванию.

Чтобы проанализировать механизм эффекторной функции CD4 ⁺ Т-клеток при отторжении опухоли, мы изучили иммунные ответы, индуцированные генетически модифицированной цельноклеточной вакциной. Сравнение генетически модифицированных цельноклеточных вакцин с использованием меланомы В16 (7), трансдуцированной большим набором отдельных генов цитокинов, показало, что вакцины, трансдуцированные ГМ-КСФ, генерируют сильный и продолжительный системный противоопухолевый иммунитет, который зависит как от CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки (5).Индукция иммунитета против слабоиммуногенной опухоли B16, по-видимому, связана со способностью локально продуцируемого GM-CSF активировать APC, происходящие из костного мозга, во время фазы прайминга для процессинга и представления опухолевых антигенов как CD4 ⁺ , так и CD8 ⁺ Т-клеток (8–10). В следующих исследованиях мы смогли продемонстрировать, что CD4 ⁺ T-клетки не просто оказывают помощь Т-клеткам CD8 ⁺ , они экспрессируют цитокины Th2 и Th3 и привлекают другие противоопухолевые эффекторные клетки в дополнение к CD8 ⁺ T. клетки.

Самки мышей C57BL/6 в возрасте 6–8 недель были получены из Национального института рака (Bethesda, MD) и размещены в Центре онкологии Джона Хопкинса для животных. В том же учреждении CD4 ^-/- , CD8 ^-/- , γ-IFN ^-/- , IL-4 ^-/- , IL-5 ^-/- , X-CGD, и индуцибельная синтазы оксида азота (iNOS ^-/- ) ¹ мышей, которые были подвергнуты обратному скрещиванию с фоном C57BL/6 в течение более чем семи поколений, были выведены, и потомство самок использовалось для экспериментов, начиная с возраста 6-8 недель .Мыши CD4 ^-/- и CD8 ^-/- были подарены доктором Так Маком (Институт рака Онтарио, Университет Торонто, Торонто, Канада). IL-4 ^-/- , γ-IFN ^-/- и iNOS ^-/- мышей получали от The Jackson Laboratories (Бар-Харбор, Мэн). Мыши IL-5 ^-/- и X-CGD были подарены доктором Эриком Перлманом (Case Western Reserve, Кливленд, Огайо) и доктором Мэри Динауэр (Медицинская школа Университета Индианы, Индианаполис, Индиана) соответственно. Вкратце, мышам вводили подкожно в левый бок 10 ⁶ облученных (50 Гр) опухолевых клеток B16, трансдуцированных геном GM-CSF (B16-GM-CSF), что приводило к продукции 420 нг GM-CSF/ 10 ⁶ кл/24 ч (5).Через 2 недели мышам заражали правый бок 10 ⁵ живых нетрансдуцированных клеток B16 (B16-WT). Клетки B16-GM-CSF и B16 дикого типа были предоставлены доктором Гленном Драноффом (Институт рака Даны Фарбер, Бостон, Массачусетс). Перед инъекцией клетки собирали в логарифмической фазе роста из культуры клеток in vitro путем трипсинизации и трижды промывали бессывороточным 1× HBSS. Все инъекции были в объеме 0,1 мл. Все экспериментальные группы были сопоставимы как по возрасту, так и по полу. Данные экспериментов по иммунизации представлены в виде графиков Каплана-Мейера, представляющих процент животных без обнаруживаемой опухоли.Мышей контролировали два раза в неделю на предмет роста опухоли. Все отдельные эксперименты включали как минимум 10 мышей в группе, а данные как минимум двух повторных экспериментов объединяли в анализе Каплана-Мейера.

TRIZOL (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) использовали для экстракции тотальной РНК из лимфоцитов, дренирующих место п/к. вакцинация облученным B16-GM-CSF и из места подкожного введения. провокация живыми клетками B16-WT.Систему предварительной амплификации SUPERSCRIPT (GIBCO BRL) использовали для обратной транскрипции тотальной РНК в кДНК. кДНК и конкурент цитокина (подарок доктора Ричарда Локсли, Калифорнийский университет в Сан-Франциско, Сан-Франциско, Калифорния) затем амплифицировали с помощью ПЦР для γ-IFN (прямой: 5′-CATTGAAAGCCTAGAAAGTCTG-3′; обратный: 5′-CTCATGAATGCATCCTTTTTCG -3′), давая фрагменты длиной 267 и 320 п.н. соответственно. кДНК и конкурент цитокина также подвергали ПЦР-амплификации для IL-4 (прямой: 5′-CATCGGCATTTTGAACGAGGTCA-3′; обратный: 5′-CTTATCGATGAATCCAGGCATCG-3′), давая фрагменты длиной 240 и 360 п.н. соответственно.Использовали следующие условия циклирования: 94°С в течение 3 мин, затем 35 циклов при 94°С в течение 40 с, 60°С в течение 20 с и 72°С в течение 40 с, с последующим окончательным удлинением при 72°С в течение 10 минут. Во всех реакциях использовали PCR Gem 100 (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT) для горячего запуска и ³² P-меченые праймеры для последующего определения выхода конечного продукта. Затем продукты разделяли на 6% полиакриламидном геле, сушили на гелевой сушилке Bio-Rad (Bio-Rad Lab., Hercules, CA) и определяли выход конечного продукта на сканере PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). ).Цитокиновую кДНК поддерживали постоянной, а концентрацию конкурента варьировали до тех пор, пока выход двух продуктов не отличался по меньшей мере в три раза друг от друга. Затем исходную концентрацию цитокина в реакции ПЦР рассчитывали по следующей формуле: начальный уровень цитокина = ( сигнал продукта цитокина / сигнал продукта конкурента ) × ( начальная концентрация конкурента ). Затем рассчитывали количество копий на микрограмм тотальной РНК.

Биопсия места заражения опухолью была удалена и мгновенно заморожена в ОКТ. соединение (Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA) и изопентан, охлаждаемый сухим льдом. Срезы ткани толщиной 5 мкм фиксировали в течение 10 мин в ацетоне и промывали TBS. Срезы гасили раствором 0,05% H ₂ O ₂ , 1% нормальной козьей сыворотки и 0,5% молока в течение 30 минут, а затем блокировали смесью TBS/молоко/1% нормальной козьей сыворотки в течение 10 минут.Затем срезы инкубировали либо с антителом α-iNOS (11), либо с антителом Mac-3 (Американская коллекция типовых культур, Роквилл, Мэриленд) в течение 60 мин. После промывки срезы инкубировали с биотинилированными вторичными антителами, козьим α-кроличьим IgG Fc для α-iNOS-антитела (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc., Вест-Гроув, Пенсильвания) и кроличьим α-крысиным IgG (Vector Labs, Inc., Burlingame). , CA) для антитела Mac-3, в течение 30 мин. После промывки срезы инкубировали с щелочной фосфатазой ExtAvidin (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури) в течение 60 мин. Предметные стекла промывали, а затем для обнаружения использовали субстрат Fast Red.

Наиболее хорошо охарактеризованной функцией CD4 ⁺ Т-клеток является выработка цитокинов, которые регулируют нижестоящую эффекторную функцию как клеточного, так и гуморального иммунитета. Разделение CD4 ⁺ Т-клеток или функции Th на фенотипы Th2 и Th3 первоначально было основано на наблюдении, что мышиные Т-хелперные клоны продуцируют определенные цитокины взаимоисключающим образом (14-16).Последующие исследования показали, что цитокины Th2, такие как γ-IFN, а также цитокины, способствующие дифференцировке Th2, такие как IL-12, ингибируют развитие Th3 (17–19), тогда как цитокины Th3, такие как IL-4 и IL-10 , подавляют развитие Th2 (20–22). Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что продуктивные Th-ответы in vivo будут развиваться однозначно либо по Th2-, либо по Th3-пути, и что последующие иммунологические эффекторные механизмы будут отражать четкий паттерн продукции цитокинов, связанный с конкретным путем дифференцировки Th.

Мы использовали систему вакцинации-провокации B16 для оценки экспрессии γ-IFN, прототипа цитокина Th2, и IL-4, прототипа цитокина Th3, в месте заражения опухолью. Конкурентный количественный ПЦР-анализ мРНК γ-IFN и IL-4 в месте заражения опухолью продемонстрировал, что оба этих сообщения были значительно повышены по сравнению с мышами, не подвергавшимися лечению (рис. 2  A ). Увеличение γ-IFN и мРНК IL-4 у вакцинированных мышей CD8 ^-/- было сходно с наблюдаемым у мышей дикого типа.Напротив, мРНК γ-IFN и IL-4 не увеличивалась в месте заражения опухолью у вакцинированных мышей CD4 ^-/- , что указывает на то, что продукция как γ-IFN, так и IL-4 зависит от активированных CD4 ⁺ Т-клеток. . Эти результаты контрастируют с результатами других исследований иммунного ответа на паразитов и внутриклеточных бактерий, которые показали, что продукция того или иного цитокина в конечном счете доминирует в эффекторной фазе ответа, что приводит к поляризованному характеру секреции цитокинов Th, связанному с способность устранять инфекцию (23–29).

Чтобы определить, требуется ли цитокин Th2, γ-IFN, или цитокин Th3, IL-4, для индукции системного противоопухолевого иммунитета с помощью B16-GM-CSF, были проведены эксперименты по вакцинации с стимуляцией γ-IFN ^{−/ —} и IL-4 ^-/- мышей (30, 31). Как показано на фиг. 2, B , защитный иммунитет против заражения меланомой B16 был значительно снижен в обеих группах мышей с нокаутом гена цитокина.В случае мышей γ-IFN ^-/- защита от заражения опухолью была полностью устранена, тогда как у мышей IL-4 ^-/- защита была снижена примерно на 50% по сравнению с вакцинированными мышами дикого типа. Таким образом, в соответствии с результатами ПЦР на рис. 2 A и в отличие от иммунного ответа в предыдущих инфекционных моделях индукция максимального системного противоопухолевого иммунитета зависела как от Th2, так и от Th3 компонентов иммунного ответа.

Для дальнейшего определения потенциальных нижестоящих эффекторных механизмов, опосредующих отторжение опухоли, была исследована ткань из места заражения опухолью.Как видно на рис. 3, эозинофилы являются одним из наиболее заметных типов инфильтрирующих клеток в месте заражения опухолью у вакцинированных мышей (в дополнение к макрофагам и лимфоцитам). Эозинофилы представляют собой потенциальную Th3-зависимую противоопухолевую эффекторную клетку. Для их дифференцировки от миелоидных предшественников необходим цитокин Th3 IL-5 (32), а их рекрутирование из крови в ткани частично зависит от IL-4 (33). Действительно, плотный эозинофильный инфильтрат в месте заражения опухолью напоминает таковой, наблюдаемый в опухолевых клетках, трансдуцированных IL-4, после инъекции in vivo (34, 35).Эозинофилы полностью отсутствуют в месте заражения опухолью у вакцинированных мышей CD4 ^-/- и примерно на 80% снижены у вакцинированных мышей IL-4 ^-/- , что указывает на то, что IL-4 CD4 ⁺ Т-клеточного происхождения является критично для их найма. Напротив, в месте заражения вакцинированных мышей CD8 ^-/- и γ-IFN ^-/- был обнаружен эозинофильный инфильтрат, сходный с таковым у мышей дикого типа.

Несколько линий доказательств поддерживают представление о том, что инфильтрирующие эозинофилы являются важными Th3-зависимыми противоопухолевыми эффекторами, а не просто неактивными наблюдателями.Во-первых, у мышей, вакцинированных IL-5 ^-/- , защита от заражения опухолью была значительно снижена (рис. 2, B ) (36). Поскольку IL-5 имеет решающее значение для дифференцировки предшественников костного мозга в эозинофилы, зрелые эозинофилы не развиваются у мышей IL-5 ^-/- . Во-вторых, и это наиболее важно, потеря системного противоопухолевого иммунитета была связана с отсутствием эозинофилов в местах заражения опухолью у мышей IL-5 ^-/- (фиг. 3). В-третьих, более ранние исследования как мышиных, так и человеческих тканей выявили дегрануляцию эозинофилов в месте опухоли, о чем свидетельствует присутствие в интерстициальном пространстве специфического основного белка эозинофилов (37). Эта дегрануляция является характерной чертой активированных эозинофилов (38).

Другим потенциальным эффекторным механизмом Th2 является продукция NO iNOS в активированных макрофагах. Было показано, что продукция NO макрофагами обладает противоопухолевой активностью как in vitro, так и in vivo (43–54). Действительно, иммуногистохимическое окрашивание в месте заражения мышей дикого типа, вакцинированных B16-GM-CSF, показало обильную инфильтрацию макрофагов (фиг.5, B ). Этот инфильтрат все еще был очевиден у мышей с нокаутом гена цитокина, но отсутствовал у мышей CD4 ^-/- (фиг. 5, C ). Инфильтрирующие макрофаги окрашивались сильно положительно на iNOS у вакцинированных мышей дикого типа (фиг. 5, H ). Напротив, несмотря на присутствие большого количества макрофагов у мышей, вакцинированных B16-GM-CSF γ-IFN ^-/- (рис. 5, E ), iNOS практически отсутствовала в месте заражения у γ-IFN ^{. -/-} мышей (фиг.5, К ). Экспрессия iNOS присутствовала в месте заражения мышей IL-4 ^-/- (фиг. 5 L ), хотя уровни были снижены по сравнению с мышами дикого типа. Снижение уровней iNOS у мышей IL-4 ^-/- было несколько неожиданным, учитывая, что IL-4 ингибирует экспрессию iNOS в макрофагах (55-57). Одним из возможных объяснений этого снижения у мышей IL-4 ^-/- может быть компенсаторная гиперэкспрессия других цитокинов, таких как IL-10, которые косвенно ингибируют экспрессию iNOS посредством ингибирования экспрессии TNF-α, костимулятора для индукции iNOS. (21, 22, 58–60).Также возможно, что снижение экспрессии iNOS является вторичным по отношению к снижению тканевой эозинофилии, поскольку известно, что сами эозинофилы экспрессируют TNF-α (61, 62). Кроме того, эозинофилы также экспрессируют пероксидазу эозинофилов и воспалительный белок макрофагов-1, оба из которых индуцируют высвобождение TNF-α из макрофагов (63, 64). Следовательно, возможно, что эозинофилы функционируют как положительный модулятор высвобождения iNOS макрофагами. Кроме того, резкое отсутствие экспрессии iNOS у мышей γ-IFN ^-/- , у которых опухоль не отторгается в ответ на вакцинацию, предполагает, что продукция NO макрофагами, проникающими в опухоль, может представлять собой важный противоопухолевый эффекторный механизм in vivo.

Прямые функциональные доказательства роли iNOS в отторжении опухоли были получены в экспериментах по вакцинации на мышах iNOS ^-/- . В соответствии с предыдущим иммуногистохимическим окрашиванием вакцинированные мыши iNOS ^-/- демонстрируют существенное снижение защиты от заражения опухолью (таблица 1), тем самым демонстрируя критическую роль NO в противоопухолевом уничтожении.

Активированные фагоциты также могут опосредовать уничтожение за счет продукции супероксида, который вырабатывается комплексом НАДФН-оксидаза-фермент. Мутации в гене CYBB, кодирующем 91-кДа гликопротеиновый компонент оксидазы (gp91phox), объясняют Х-сцепленную форму хронической гранулематозной болезни, синдрома иммунодефицита, характеризующегося рецидивирующими инфекциями каталазоположительными микроорганизмами. Фагоциты пациентов с хронической гранулематозной болезнью или мышей с генетическим нокаутом gp91phox (мыши X-CGD) (65) вызывают тяжело дефектный респираторный взрыв с небольшим образованием супероксида или перекиси водорода или без него. Мыши X-CGD, иммунизированные B16-GM-CSF, показали существенное снижение защиты от заражения опухолью B16 (таблица 1), тем самым вовлекая супероксид в противоопухолевый ответ.Потеря защиты от опухоли как у мышей iNOS ^-/- , так и у мышей X-CGD указывает на то, что как NO, так и супероксид, участвующие в фагоцитарном уничтожении, играют основную роль в противоопухолевом эффекте, индуцированном B16-GM-CSF.

В совокупности представленные здесь эксперименты демонстрируют, что эффективный противоопухолевый иммунитет критически зависит от Т-клеток CD4 ⁺ , которые отвечают за организацию множественных иммунологических эффекторных ветвей, зависящих как от цитокинов Th2, так и от Th3. Ранее мы продемонстрировали, что фаза прайминга иммунного ответа на опухолевые клетки, секретирующие GM-CSF, включает рекрутирование APC, происходящих из костного мозга, которые процессируют и представляют опухолевые антигены как CD4 ⁺ , так и CD8 ⁺ Т-лимфоцитам (10 ). В этом исследовании мы изучили эффекторные механизмы, необходимые для успешного отторжения опухоли, обнаруженной в отдаленных местах. Поскольку контрольная опухоль, используемая в этих исследованиях, является отрицательной по MHC класса II, эффекторная фаза ответа также требует процессинга опухолевых антигенов путем инфильтрации APC для представления CD4 ⁺ Т-лимфоцитам.Эти наблюдения подчеркивают критическую роль АПК, происходящих из костного мозга, в двух фазах противоопухолевого иммунного ответа — примировании ответов Т-клеток de novo (считается, что они в значительной степени опосредованы активированными дендритными клетками) и амплификации эффекторной фазы посредством процессинга и презентации. опухолевого антигена к памяти CD4 ⁺ Т-клеток. Благодаря локальному высвобождению цитокинов эти клетки направляют эффекторный ответ, рекрутируя и активируя тумороцидные макрофаги, эозинофилы и другие популяции, наблюдаемые гистологически.Это кооперативное взаимодействие между APC и памятью CD4 ⁺ Т-клетками является отличительной чертой классической реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Потребность в CD4 ⁺ Т-клетках в эффекторной фазе иммунного ответа на опухоли, которые сами по себе не экспрессируют МНС класса II, согласуется с более ранними результатами в системах адоптивного переноса. Было показано, что инфузия опухолеспецифических Т-клеток CD4 ⁺ способна эрадикировать линию мышиного лейкоза FBL-3, отрицательную по MHC класса II (66).Было обнаружено, что позитивные макрофаги класса II необходимы для представления процессированных опухолевых антигенов Т-клеткам CD4 ⁺ (67). Кроме того, было показано, что несколько стратегий вакцинации, которые непосредственно усиливают праймирование опухолеспецифических CD4 ⁺ Т-клеток, усиливают системное отторжение MHC класса II негативных опухолей (68–71).

Предыдущие исследования в области иммунологии рака были сосредоточены в основном на эффекторных механизмах Th2, и особенно на образовании ЦТЛ.Интересно, что ЦТЛ могут играть меньшую роль в эрадикации вызванной В16 опухоли, чем в других противораковых вакцинных системах, из-за экспрессии Fas-лиганда В16 (а также многими меланомами человека), что может защищать опухоль от прямого ЦТЛ-опосредованного воздействия. убийство (72). Вместо этого оказалось, что и макрофаги, и эозинофилы играют важную роль в иммунном ответе против B16 и, вероятно, действуют вместе для достижения более эффективного уничтожения опухоли. Это подтверждается предыдущими исследованиями, показывающими, что пероксидаза эозинофилов ( a ) может взаимодействовать с макрофагами, активными промежуточными продуктами кислорода, для уничтожения опухолевых клеток (73) и ( b ) пероксидазы могут катализировать окисление нитрита с образованием дополнительных цитотоксических радикалов (74). .Однако ни макрофаги, ни эозинофилы не обладают внутренней способностью к опухолевой специфичности. Вместо этого опухолеспецифичность этих эффекторов основана на их активации соседними опухолеспецифическими Th-клетками.

На сегодняшний день основные усилия по идентификации опухолевых антигенов сосредоточены почти исключительно на антигенах, распознаваемых опухолеспецифическими рестриктированными ЦТЛ MHC класса I. Несколько антиген-специфических вакцинных стратегий, включающих рестриктированные опухолевые антигены класса I, выявленные в результате этих усилий, в настоящее время изучаются на животных моделях и в клинических испытаниях ранней фазы.В отсутствие известных рестриктированных опухолевых антигенов МНС класса II такие стратегии основаны на эффектах адъювантов или включают суррогатные антигены класса II из инфекционных патогенов, чтобы способствовать индукции ЦТЛ. Представленные здесь исследования предполагают, что, хотя ответы Th, генерируемые этим типом вакцинации, могут усиливать индукцию ЦТЛ во время праймирования, они вряд ли будут участвовать в эффекторной фазе, которая требует помощи опухолеспецифических CD4 ⁺ Т-клеток. В конечном счете, оптимальная вакцина, специфичная к опухолевому антигену, в идеале будет включать панель доминирующих опухолевых антигенов, распознаваемых как CD4 ⁺ , так и CD8 ⁺ Т-клетками.

Вывод о том, что цельноклеточные вакцины, трансдуцированные GM-CSF, одновременно индуцируют дифференцировку Th2 и Th3, контрастирует с предыдущими выводами об иммунных реакциях in vivo как на внутриклеточные бактерии, так и на паразитов. У резистентных линий мышей, таких как C3H или C57BL/6, заражение внутриклеточным паразитом Leishmania major вызывает исключительно Th2-ответ, характеризующийся высоким уровнем γ-IFN и низким уровнем продукции IL-4 (23–25).Кроме того, было показано, что эрадикация L. major зависит от γ-IFN-зависимой стимуляции iNOS в макрофагах (75–84). И наоборот, у восприимчивых линий мышей, таких как BALB/c, инфекция L. major индуцирует исключительно иммунный ответ Th3, характеризующийся высоким уровнем IL-4 и низким уровнем γ-IFN (23–25, 28, 85). Основываясь на этом измененном характере дифференцировки Th и прямом ингибировании активации макрофагов IL-4 и IL-10 (22, 56, 60, 86–88), мыши BALB/c не могут выработать эффективный иммунитет против L.главная задача . Напротив, защитный иммунитет против гельминтозов, таких как Schistosoma mansoni и Nippostrogylus brasiliensis , связан с развитием Th3 и индукцией IL-4 (26, 27, 89).

В каждой из этих моделей убедительная демонстрация того, что определенные цитокины Th2 или Th3 играют решающую роль в управлении соответствующими иммунными реакциями, основана на обнаружении того, что элиминация данного цитокина либо путем истощения антител in vivo, либо путем генетического нокаута приводит к потере защиту от конкретного возбудителя.Например, блокада γ-IFN делает ранее резистентных мышей восприимчивыми к инфекции L. major (90, 91). Кроме того, введение антител против IL-4 мышам BALB/c делает их устойчивыми к инфекции L. major (92). И наоборот, блокада IL-4 или введение IL-12 делают мышей резистентными к гельминтозам Trichuris muris , Heligmosomoides polygyrus и N. brasiliensis (29, 93, 94).

В этих моделях вначале часто наблюдается ответ Th0, характеризующийся смесью цитокинов Th2 и Th3.Однако иммунный ответ в этих моделях обычно развивается по линиям Th2 или Th3 через 1–2 недели после инфекционного заражения (90, 92, 95–97). До сих пор неизвестно, продуцируется ли двойной фенотип Th2/Th3 в этом противоопухолевом ответе одной или двумя разными популяциями Th-клеток. Однако, поскольку данные ОТ-ПЦР о цитокинах в месте заражения были получены через 18 дней после вакцинации, мыши, скорее всего, уже дифференцировались после стадии Th0. Кроме того, обнаружение того, что полное отторжение контрольных опухолей, введенных через 2 недели после вакцинации, требует ответа, зависящего как от IL-4, так и от γ-IFN, предполагает, что двойной ответ Th2/Th3 сохраняется в течение длительного периода времени.

Также еще предстоит определить, является ли двойной эффекторный ответ Th2/Th3, наблюдаемый здесь, общей характеристикой других противоопухолевых вакцин на клеточной основе или же он уникален для механизма, с помощью которого паракринная продукция GM-CSF инициирует иммунные ответы. Интересно, что аналогичная картина Th2/Th3 наблюдалась в ответ на определенный опухолевый антиген, то есть белок идиотипа В-клеточной лимфомы, после иммунизации клетками лимфомы, продуцирующими GM-CSF (98).Дальнейшая характеристика Th-ответа, создаваемого антиген-специфическими Т-клетками в ответ на противоопухолевую вакцинацию, в настоящее время проводится с использованием трансгенных мышей TCR, специфичных к определенному опухолевому антигену. Вполне вероятно, что одна из причин превосходства паракринных GM-CSF вакцин по сравнению с другими вакцинами, трансдуцированными цитокинами, связана с центральной ролью GM-CSF в индукции дифференцировки предшественников костного мозга в дендритные клетки. В настоящее время мы пытаемся определить, обладают ли дендритные клетки, которые дифференцируются под контролем GM-CSF, уникальной способностью индуцировать и поддерживать дифференцировку Th2 и Th3 одновременно.

Эти данные об индукции и поддержании одновременных ответов Th2 и Th3 несколько удивительны, учитывая, что Th2-ассоциированные цитокины, такие как IL-12 и γ-IFN, ингибируют дифференцировку Th3, а Th3-ассоциированные цитокины, такие как IL-4 и IL-10, ингибируют Дифференцировка Th2. В настоящее время мы не знаем, основан ли двойной ответ Th2/Th3 на развитии клеток Th, которые одновременно продуцируют цитокины Th2 и Th3, или на смеси отдельных популяций Th2 и Th3.Тем не менее, открытие того, что эффекторные механизмы Th2 и Th3 могут фактически сотрудничать друг с другом в направлении эффективного противоопухолевого ответа, а не противодействовать друг другу, имеет важное значение для развития иммунотерапии рака в целом. В конечном счете, наиболее эффективной иммунотерапией рака действительно может быть та, которая может одновременно управлять несколькими эффекторными механизмами Th2 и Th3, которые могут сотрудничать в наиболее эффективном уничтожении как первичного рака, так и метастатических опухолевых отложений.

Противоопухолевая активность и безопасность пембролизумаба у пациентов с распространенным рецидивирующим раком яичников: результаты исследования II фазы KEYNOTE-100

https://doi.org/10.1093/annonc/mdz135Get rights and content рак яичников (РПЯ) является ведущей причиной смерти от гинекологического рака в развитых странах, и необходимы новые методы лечения. Предыдущие исследования блокады иммунных контрольных точек показали низкую частоту объективного ответа (ЧОО) при ROC без идентифицированного прогностического биомаркера.

Пациенты и методы

В этом исследовании фазы II пембролизумаба (NCT02674061) изучались две когорты пациентов с ROC: когорта A получала от одной до трех предшествующих линий лечения с интервалом без платины (PFI) или интервалом без лечения (TFI) от 3 до 12 месяцев, а когорта B получила от четырех до шести предыдущих линий с PFI/TFI ≥3 месяцев. Пембролизумаб 200 мг вводили внутривенно каждые 3 недели до прогрессирования рака, токсичности или завершения 2 лет. Первичными конечными точками были ЧОО по критериям оценки ответа в солидных опухолях, версия 1.1 на слепой независимый центральный обзор по когорте и по экспрессии PD-L1, измеренной как комбинированная положительная оценка (CPS). Вторичные конечные точки включали продолжительность ответа (DOR), показатель контроля заболевания (DCR), выживаемость без прогрессирования (PFS), общую выживаемость (OS) и безопасность.

Результаты

В когорту А вошли 285 пациентов; первые 100 служили обучающей выборкой для анализа биомаркеров PD-L1. Когорта B включала 91 пациента. ORR составил 7,4% для когорты A и 9,9% для когорты B. Медиана DOR составила 8.2 месяца для когорты A и не достигнуты для когорты B. DCR составил 37,2% и 37,4% соответственно в когортах A и B. На основе анализа обучающей выборки CPS 1 и 10 были выбраны для оценки в подтверждающей выборке. В наборе для подтверждения ORR составил 4,1% для CPS <1, 5,7% CPS ≥1 и 10,0% для CPS ≥10. ВБП составила 2,1 месяца для обеих когорт. Медиана ОВ не была достигнута для когорты А и составила 17,6 месяца для когорты В. Токсичность соответствовала другим исследованиям монотерапии пембролизумабом.

Выводы

Однокомпонентный пембролизумаб показал умеренную активность у пациентов с ROC.Более высокая экспрессия PD-L1 коррелировала с более высоким ответом.

Клиническое испытание №

ClinicalTrials.gov, NCT02674061

ключевые слова

Рак яичников

PEMBROLIZUMAB

Иммунотерапия

Комбинированный положительный балл

Рекомендуемые статьи со статей (0)

Copyright © 2019 Авторы. Опубликовано Elsevier Ltd. Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Блеомицин оказывает амбивалентное противоопухолевое иммунное действие, вызывая как иммуногенную гибель клеток, так и пролиферацию регуляторных Т-клеток

Abstract

Блеомицин (BLM) представляет собой противораковый препарат, используемый в настоящее время для лечения рака яичка и лимфомы Ходжкина. Этот препарат вызывает гибель раковых клеток благодаря своей способности генерировать радикальные формы кислорода (АФК). Однако предполагаемый вклад противоракового иммунного ответа в эффективность БЛМ не оценивался. Мы делаем здесь наблюдение, что BLM индуцирует иммуногенную гибель клеток. В частности, BLM способен индуцировать опосредованный АФК стресс ретикулума и аутофагию, что приводит к воздействию на поверхность шаперонов, включая кальретикулин и ERp57, и высвобождению HMBG1 и АТФ. BLM индуцирует противоопухолевый иммунитет, который зависит от кальретикулина, CD8 ⁺ Т-клеток и интерферона-γ.Мы также обнаружили, что, в дополнение к своей способности вызывать иммуногенную гибель клеток, BLM индуцирует экспансию регуляторных T-клеток Foxp3+ (Treg) благодаря своей способности индуцировать секрецию бета-трансформирующего фактора роста (TGFβ) опухолевыми клетками. Соответственно, истощение Treg-клеток или TGFβ резко усиливает противоопухолевый эффект BLM. Мы пришли к выводу, что BLM индуцирует как противоопухолевый ответ CD8 ⁺ Т-клеток, так и противодействие пролиферации Treg. В будущем ингибирование TGFβ или Treg во время лечения BLM может значительно повысить противоопухолевую эффективность BLM.

Образец цитирования: Bugaut H, Bruchard M, Berger H, Derangere V, Odoul L, Euvrard R, et al. (2013) Блеомицин оказывает двойственное противоопухолевое иммунное действие, вызывая как иммуногенную гибель клеток, так и пролиферацию регуляторных Т-клеток. ПЛОС ОДИН 8(6): е65181. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065181

Редактор: John W. Glod, Медицинская школа Роберта Вуда Джонсона, Соединенные Штаты Америки

Получено: 10 января 2013 г.; Принято: 23 апреля 2013 г.; Опубликовано: 7 июня 2013 г.

Авторские права: © 2013 Bugaut et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана специальными грантами от Фонда Франции, Ассоциации исследований рака, Национального института здравоохранения и медицинских исследований, Лиги борьбы с раком (регион Бургундия), Фонд медицинских исследований и Национальный институт рака.GM финансировалась Ассоциацией по исследованию рака, а FV — Национальной лигой борьбы с раком. LA была поддержана Национальным агентством по исследованиям [ANR-10-PDOC-014-01]. HB финансируется École de l’Inserm Liliane Bettencourt. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Целью противоопухолевой терапии является эрадикация опухолевых клеток в организме больного, в том числе мельчайших метастазов или одноклеточной локализации, которые невозможно удалить хирургическим путем. Химиотерапия и лучевая терапия в настоящее время используются в дополнение к хирургическому вмешательству для уничтожения остаточной болезни или для лечения метастатического заболевания. Однако опухолевые клетки могут развить некоторую резистентность и избежать цитотоксического лечения, вызывая рецидив опухоли. В этом контексте иммунотерапия рассматривается как одна из окончательных стратегий борьбы с раком, поскольку иммунная система может изменить свои действия против развивающегося злокачественного новообразования и уничтожить опухолевые клетки, устойчивые к химиотерапии. Накапливающиеся данные показывают, что традиционная химиотерапия, в дополнение к их прямому цитотоксическому эффекту, может вызывать противоопухолевый иммунный ответ.В частности, мы показали, что некоторые химиотерапевтические препараты активируют естественные клетки-киллеры (NK) [1], [2], некоторые препараты нацелены на супрессивные клетки, такие как регуляторные Т-клетки (Treg) или супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC) [3]. [4] и некоторые другие препараты также вызывают особый способ гибели раковых клеток, называемый «иммуногенной гибелью клеток» (ICD) [5]. МКБ основывается на способности лекарств индуцировать три основные контрольные точки. Первый – это воздействие сигналов «съешь меня» на клеточную поверхность, таких как кальретикулин (CRT), вызванное стрессом эндоплазматического ретикулума (RE) [6], который способствует фагоцитозу раковых клеток дендритными клетками [7].Во-вторых, это секреция эндогенного лиганда Toll-подобного рецептора 4 (TLR4) High-mobility group box 1 (HMGB1) [8], который необходим для эффективного процессинга опухолевого антигена дендритными клетками. Третьим сигналом является высвобождение АТФ, которое индуцирует продукцию интерлейкина (ИЛ)-1β дендритными клетками и способствует CD8 ⁺ Т-клеточному иммунному ответу [9].

Блеомицин (BLM) представляет собой противоопухолевый антибиотик-гликопептид, продуцируемый бактерией Streptomyces [10]. БЛМ вызывает разрывы в ДНК, аналогичные тем, которые получаются при лучевой терапии [11]. Было показано, что это повреждение ДНК опосредовано индукцией окислительного стресса [12], [13]. BLM показан в сочетании с другими цитотоксическими агентами для лечения рака яичка и болезни Ходжкина [14], [15]. Особенностью этих двух заболеваний является высокая скорость излечения, достигаемая химиотерапией. Поэтому мы предложили протестировать противоопухолевый иммунный ответ, индуцированный БЛМ, чтобы определить, может ли этот механизм участвовать в противоопухолевом действии блеомицина и может ли объяснить высокую способность схем, содержащих БЛМ, излечивать рак.

В этом исследовании мы проанализировали влияние ICD, эффекторных клеток (таких как CD8+ T и NK-клетки), а также клеток-модуляторов (таких как дендритные клетки, MDSC и Treg) на противоопухолевую эффективность BLM. Мы описываем, как лечение BLM вызывает иммуногенный апоптоз опухолевых клеток, противоопухолевый ответ CD8 ⁺ Т-клеток и выработку опухолевыми клетками толерогенного фактора роста, трансформирующего цитокин бета (TGFβ), который опосредует накопление регуляторных Т-клеток in vivo .

Материалы и методы

Культура клеток

Линии клеток MCA205 (фибросаркома), B16F10 (меланома), сингенные от мышей C57BL/6, и клеточную линию CT26 (карцинома толстой кишки), сингенные от мышей Balb/c, культивировали при 37°C в 5% CO ₂ в RPMI 1640 (Lonza), обогащенный 10% эмбриональной бычьей сывороткой, 0,4 ммоль/л пирувата натрия, 4 ммоль/л HEPES и антибиотиками (пенициллином, стрептомицином и амфотерицином В). Все клеточные линии были получены из Американской коллекции типовых культур, за исключением B16-OVA, которая была любезным подарком Pr Laurence Zitvogel.

Модели мышей

Мыши.

Все эксперименты были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Бургундского университета. Самок мышей C57BL/6 или Balb/c приобретали в Centre d’Elevage Janvier (Le Genest St. Isle, Франция) и использовали в возрасте от 6 до 10 недель. Трансгенные мыши OT-I (C57BL/6-Tg(TCRαTCRβ)1100mjb) были предоставлены C.Borg (INSERM U645, Безансон, Франция). Сингенные мыши Foxp3-EGFP [16] и CD45.1 были получены от CDTA (UMR 7355 CNRS, Орлеан, Франция).

Модели опухолей.

опухолевых клеток СТ26 вводили в правый бок мышам Balb/c (1,10 ⁶ клеток). Размер опухоли контролировали три раза в неделю с помощью штангенциркуля. В некоторых экспериментах 1,10 ⁶ клеток вводили внутрибрюшинно, чтобы вызвать карциноз брюшины.

Процедуры.

Мыши, обработанные BLM, получали 5 внутрибрюшинных инъекций (20 мг/кг) через день, начиная с того момента, когда размер опухоли достиг приблизительно 25 мм ² .Мышей, получавших ЛПС (InVivoGen, Тулуза, Франция), обрабатывали внутрибрюшинно (40 мкг) за день до умерщвления. Мыши, обработанные IL-2, получали 2 внутрибрюшинных инъекции в день (1,10 ⁵ МЕ, Хирон), начиная за два дня до умерщвления. Антитела к CD8 (2.43), анти-CD4 (GK1.5), анти-CD25 (PC-61.5.3) и анти-TGFβ (1D11) были куплены у BioXcell (Западный Ливан, Нью-Гэмпшир, США) и использованы для устранения CD8 ⁺ , CD4 ⁺ , CD25 ⁺ Treg-лимфоциты или TGFβ in vivo соответственно. Инъекции выполняли внутрибрюшинно по 150 мкг на мышь за 12 часов до и через 12 часов после первой инъекции БЛМ, а затем по 100 мкг на мышь два раза в неделю.

Вакцинация. Клетки

B16F10, экспрессирующие куриный овальбумин (B16-OVA), обрабатывали в течение 24 часов указанными препаратами, а затем вводили (5,10 ⁵ клеток) в подушечки лап мышей C57BL/6. Положительный контроль представлял собой 1 мг белка овальбумина (Calbiochem, Merck France) плюс 10 мкг CpG ODN 1668 (InVivoGen).Через пять дней собирали дренирующие лимфатические узлы, механически разрушали их и повторно стимулировали в течение 72 часов с помощью PBS, OVA (1 г/л) или анти-CD3 (2 мкг/мл, 145.2C11, BioXcell) плюс анти-CD28 (2 мкг/л). мл, PV1, BioXcell). Затем собирали супернатанты и определяли концентрацию IFNγ с помощью ELISA (BD biosciences, le Pont de Claix, Франция).

In vitro Лечение

Опухолевые клетки обрабатывали в течение 24 часов 30 мкМ митомицина С, 0,25 мкМ доксорубицина, 30 мМ N-ацетилцистеина или 15 мкг/мл BLM для клеток CT26 и MCA205, 150 мкг/мл BLM для B16F10.

Анализ подавления.

Мы использовали анализ подавления OT-I [4], [17], [18], адаптированный следующим образом. Через пять дней после обработки PBS или BLM селезенки мышей с опухолями собирали и механически разрушали. MDSC были помечены как клетки PE-Cy7 Gr1 ⁺ и выделены с помощью магнитных шариков против PE-Cy7 (Miltenyi). CD4 ⁺ лимфоцитов очищали с использованием набора для выделения Т-клеток MACS CD4 ⁺ II (Miltenyi, Париж, Франция), а затем Treg очищали среди CD4 ⁺ лимфоцитов с использованием микробусин CD25 (Miltenyi): CD4 ⁺ CD25 Клетки ⁺ были помечены как Treg, а клетки CD4 ⁺ CD25 ^— были использованы как Tconv.Отдельно трансгенных мышей OT-I умерщвляли и собирали лимфатические узлы и селезенки. Затем лимфоциты CD8 ⁺ очищали с использованием набора для выделения Т-клеток MACS CD8 ⁺ II. Лимфоциты CD8 ⁺ OT-I совместно культивировали в течение 72 часов с пептидом SIINFEKL (10 мкг/мл, тебу) и очищенными клетками Treg или Tconv (1∶1) от мышей с опухолями. Концентрацию IFNγ в супернатантах определяли с помощью ELISA (BD bioscience).

Перенос клеток.

Мышей CD45.2 Foxp3-EGFP умерщвляли, затем собирали лимфатические узлы и селезенки.Эти органы механически разрушали, и суспензию отдельных клеток обогащали лимфоцитами CD4 ⁺ с использованием набора для выделения Т-клеток MACS CD4 ⁺ II (Miltenyi). Затем клетки CD4 ⁺ GFP ^— CD62L ⁺ (наивные CD4 ⁺ Т-лимфоциты) и клетки CD4 ⁺ GFP ⁺ (Treg) были отсортированы с использованием FACS Aria III (BD). In vivo отсортированные наивные Т-клетки и Treg-клетки вводили внутривенно мышам с опухолью CD45.1 C57BL/6 CT26.Мышей CD45.1, которым вводили Treg, затем обрабатывали PBS, BLM или IL-2. Мышей CD45.1, которым вводили наивные Т-клетки CD4 ⁺ , обрабатывали PBS или BLM. За день до умерщвления мышей CD45.1, которым вводили Treg, вводили EdU (70 мг/кг, внутрибрюшинно). Через пять дней после обработки BLM всех мышей CD45. 1 умерщвляли и собирали селезенки и опухоли. Органы механически разрушали и проводили окрашивание CD4 CD45.2 Foxp3 EdU (набор Click-iT EdU, Invitrogen, Сент-Обен, Франция).Затем клетки анализировали с помощью проточной цитометрии. In vitro Treg культивировали с супернатантом клеток CT26, обработанных PBS или BLM, в присутствии антител против CD3 и против CD28. Через три дня клетки инкубировали в течение 3 ч с BrdU, затем обрабатывали с помощью набора BD BrdU Flow Kit в соответствии с протоколом производителя и анализировали с помощью FACS.

Проточная цитометрия

Через пять дней после последней обработки BLM мышей с опухолями умерщвляли, органы извлекали и механически разрушали. Суспензию клеток из селезенки или опухоли разделяли с помощью среды для разделения лимфоцитов (Eurobio) для выделения живых мононуклеарных клеток.Клетки окрашивали антителами, описанными ниже, в соответствии с протоколом производителя. Окрашивание Foxp3 проводили с использованием набора для окрашивания регуляторных Т-клеток мыши (eBiosciences). Мертвые клетки исключали путем мечения DAPI (1 мкг/мл). Следующие антитела были получены от BD Biosciences: APC-H7 анти-CD19, PerCP анти-CD3, V500 анти-CD4, V450 анти-CD8, PE анти-DX5, FITC анти-CD11c, PE анти-Ly6G, PerCP анти-CD4, APC анти-CD3, FITC анти-CD40, PE анти-CD86, Alexa700 анти-CD62L, V450 анти-CD45.2, APC анти-CD11c; следующие антитела были от BioLegend: Alexa700 анти-F4/80, APC анти-LAP; следующие антитела были от eBiosciences: APC анти-CD11b, PerCP-Cy5.5 анти-Ly6C, eFluor450 анти-Foxp3, Alexa700 анти-CHM-II. Также использовали другие антитела: азид Alexa647 (Invitrogen), кроличью цельную сыворотку против CRT (Abcam), кроличью цельную сыворотку против ERp57 (Abcam), Alexa 680 против кролика (Invitrogen). Данные были получены с помощью LSR II (BD) и проанализированы с помощью FlowJo (Tristar). Сортировку клеток проводили с помощью BD ARIA III. Популяции клеток определяли следующим образом: В-лимфоциты: CD19 ⁺; CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-лимфоциты: CD3 ⁺ CD4 ⁺ или CD3 ⁺ CD8 ⁺ соответственно; NK-лимфоциты: CD19 ^– CD3 ^– DX5 ⁺ ; дендритные клетки: CD19 ⁻ CD3 ⁻ CD11c высокий; моноциты/макрофаги: CD11b ⁺ F4/80 ⁺ ; моноцитарные или гранулоцитарные МСК: CD11b ⁺ Ly6C ⁺ или CD11b ⁺ Ly6G ⁺ соответственно; Treg: CD3 ⁺ CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ ; созревание дендритных клеток: интенсивность флуоресценции мечения CD40 и CD86 в живых клетках CD11c high MHC-II ⁺ .

Обнаружение аутофагии

Набор

Cyto-ID (Enzo) использовали в соответствии с протоколом производителя для проточной цитометрии и иммунофлуоресценции. Анти-LC3 (клон 5F10, Nanotools) использовали на клетках, фиксированных и пермабилизированных с помощью набора BD fix/perm, и выявляли с помощью alexa 488 anti-mouse (InVitroGen).

Обнаружение АФК

Клетки

инкубировали 2 часа с указанными препаратами, промывали, затем инкубировали с 100 мкМ DCFH ₂ /DA (Sigma) в течение 50 мин при 37°C и анализировали методом проточной цитометрии.

Иммуноблот-анализ

Образцы лизировали в лизисном буфере, содержащем 1% SDS (Promega), 10 мМ трис-HCl pH 7,5, 1 мМ NaF (Sigma), 1 мМ ЭДТА (Promega), 2 мМ ортованадата натрия (Sigma) и коктейль антипротеаз (Roche, Mannheim). , Германия). Концентрацию белка для каждого образца определяли с помощью анализа белка DC в соответствии с протоколом производителя (Bio-rad, Marnes-la-Coquette, Франция). После иммуноблоттинга было выявлено иммунохимическое обнаружение с помощью соответствующего вторичного антитела, меченного пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch).Конкретные полосы визуализировали с помощью системы обнаружения хемилюминесценции (Санта-Крус, Гейдельберг, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Контроль равной загрузки белков осуществляли с помощью антитела против актина. Использовали следующие антитела: моноклональные кроличьи анти-p-eIF2α (Cell Signaling), моноклональные кроличьи анти-eIF2α (Cell Signaling), моноклональные мышиные анти-β-актин (Sigma).

Концентрация внеклеточного АТФ

Супернатанты дважды центрифугировали (425 90 101 g 90 102 , 3 мин, комнатная температура) для удаления клеточного дебриса.Затем определяли концентрацию АТФ с помощью набора для анализа жизнеспособности клеток Cell Titer Glo (Promega) в соответствии с протоколом производителя.

ИФА

В соответствии с протоколом производителя использовали следующие наборы: набор для обнаружения HMGB1 (Chondrex), набор для ИФА IFNγ (BD), набор для ИФА TGFβ1 Ready-SET-Go (eBiosciences).

Праймеры и ПЦР

Очистку нуклеиновой кислоты проводили с использованием Trizol (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Набор обратной транскриптазы M-MLV (Invitrogen) использовали в соответствии с протоколом производителя для выполнения обратной транскрипции.RT-qPCR проводили с использованием набора Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) в соответствии с протоколом производителя с системой быстрой ПЦР в реальном времени 7500 (Applied Biosystems). Использовали следующие праймеры: b-actin (внутренний контроль): прямой 5′-ATGGAGGGGAATACAGCCC-3′, обратный 5′-TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT-3′; Tgfb1 : прямой 5′-CAACCCAGGTCCTTCCTAAA-3′, обратный 5′-GGAGAGCCCTGGATACCAAC-3′.

трансдукция кшРНК

клетки CT26 трансдуцировали лентивирусными трансдукционными частицами MISSION (Sigma-Aldrich) для подавления CRT или частицами отрицательного контроля в соответствии с инструкциями производителя.

Статистический анализ

Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 5. Сравнение контрольных и тестовых условий проводили с помощью t-критерия Стьюдента или критерия Манна-Уитни; групповое сравнение проводилось с помощью теста Крускала-Уоллиса с последующим пост-тестом Данна. Сравнение роста опухоли проводили методом двустороннего ANOVA.

Результаты

BLM индуцирует стигмы иммуногенной гибели клеток

Противоопухолевый эффект

BLM обусловлен его способностью индуцировать образование радикальных форм кислорода (АФК) [19], [20].Поскольку генерация АФК может привести к стрессу ретикулума [21], мы предположили, что БЛМ может вызывать АФК-зависимый стресс ER и индукцию ICD. Мы обнаружили, что BLM, подобно доксорубицину (DOX), антрациклиновому и иммуногенному препарату [7], запускает фосфорилирование eIF2α, маркер стресса ретикулума в клетках CT26 (рис. 1а). Индуцированный химиотерапией стресс ретикулума может вызвать транслокацию кальретикулина (CRT) и шаперона эндоплазматического ретикулума ERp57 на клеточную поверхность [22], [23]. In vitro , BLM индуцировал транслокацию CRT и ERp57 на плазматическую мембрану опухолевых клеток в трех моделях рака мыши (рис. 1b).Как и ожидалось, эффекты BLM сравнимы с эффектами DOX, тогда как митомицин C (Mito C), неиммуногенный препарат [7], не индуцировал воздействие CRT или ERp57 (рис. 1b). Важно отметить, что мы показали, что эти транслокации прерываются с помощью N-ацетилцистеина (NAC) (рис. 1c), ингибитора АФК (рис. S1). Второй детерминантой ICD является способность химиотерапии индуцировать высвобождение HMGB1, который запускает TLR4 на антигенпрезентирующих клетках [8]. Используя ELISA, мы заметили, что BLM индуцирует высвобождение HMGB1, аналогичное доксорубицину (рис. 1d).Третьим элементом ICD является способность химиотерапевтического агента запускать аутофагию и последующую секрецию АТФ, которая активирует дендритные клетки через P2RX7 [9], [24]. Мы наблюдали, что BLM индуцирует, как и DOX, LC3 puncta при иммунофлуоресценции и мечение Cyto-ID при проточной цитометрии, два маркера вакуолей аутофагии (рис. 1e, 1f и рис. S2). Следует отметить, что митомицин С не смог вызвать эти признаки аутофагии (рис. S2). Подобно DOX, BLM также индуцировал высвобождение АТФ из клеток CT26 (рис. 1g).Ингибитор АФК NAC также притуплял как аутофагию, так и высвобождение АТФ (рис. 1f и 1g).

Рис. 1. Лечение BLM вызывает характерные явления иммуногенной гибели клеток.

A: вестерн-блоттинг фосфорилированного, общего eIF2α и β-актина в CT26, обработанном через 24 часа указанными препаратами. B: указанные опухолевые клетки обрабатывали in vitro различными химиотерапевтическими препаратами в течение 24 часов, затем с помощью проточной цитометрии определяли воздействие CRT (левая панель) или ERp57 (правая панель).C: опухолевые клетки обрабатывали BLM с N-ацетилцистеином (NAC) или без него в течение 24 часов, затем с помощью проточной цитометрии определяли воздействие CRT (левая панель) или ERp57 (правая панель). C: HMGB1 титровали методом ELISA в супернатанте клеток CT26, обработанных через 24 часа указанными препаратами. E: Клетки CT26 культивировали на предметных стеклах и обрабатывали указанными препаратами в течение 24 часов. Затем клетки подвергали маркировке анти-LC3 (зеленый) и DAPI (синий) и наблюдали под эпифлуоресцентным микроскопом. F: клетки CT26 обрабатывали указанными препаратами в течение 24 часов, затем окрашивали с использованием набора для обнаружения аутофагии Cyto-ID и анализировали с помощью проточной цитометрии.G: АТФ титровали в супернатанте СТ26, обработанного указанными препаратами, в течение 24 часов. Все представленные данные являются репрезентативными для одного из трех экспериментов. B-D, E и F показывают среднее значение +/- SEM.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065181.g001

В совокупности эти данные показывают, что BLM запускает все характерные события иммуногенной гибели клеток [7]–[9] зависимым от АФК образом.

BLM-индуцированная иммуногенная гибель клеток стимулирует CD8

⁺ Зависимый противоопухолевый иммунитет

Чтобы определить, индуцируют ли обработанные BLM опухолевые клетки противоопухолевый иммунный ответ in vivo , мы вакцинировали наивных мышей путем инъекции клеток B16-OVA, обработанных PBS, BLM или DOX, в подушечку лапы. Мы наблюдали, что клетки, обработанные BLM и DOX, способны индуцировать зависимую от овальбумина продукцию IFNγ Т-клетками из дренирующего лимфатического узла (рис. 2а). Мы также выполнили вакцинацию in vivo с контрольными или CRT-нокаутированными BLM-обработанными умирающими опухолевыми клетками с последующим заражением живыми опухолевыми клетками. Мы могли наблюдать, что обработанные BLM контрольные клетки CT26 были способны индуцировать защитный иммунитет (100% защита, n = 10), в отличие от обработанных митомицином CT26 (20% защиты, n = 10) и CRT-инвалидированных BLM-обработанных клеток. клеток (защита 30%, n = 10).Кроме того, в условиях растущих п/к опухолей CT26 мы наблюдали, что 5 инъекций BLM задерживали рост контрольных клеток CT26, трансфицированных shRNA, но не влияли на клетки CT26, трансфицированные CRT shRNA (рис. 2b). Наконец, истощение IFNγ или CD8 полностью предотвращает противоопухолевый эффект BLM in vivo (рис. 2c и 2d). В совокупности эти данные убедительно свидетельствуют о том, что BLM оказывает кальретикулин-, IFNγ- и CD8-зависимый противоопухолевый эффект.

Рис. 2. Противоопухолевый эффект БЛМ in vivo через иммунные механизмы.

A: Выполнена инъекция различных вакцин в подушечку стопы: B16-OVA, обработанная PBS, DOX или BLM, или белок овальбумина. Через 5 дней собирали подколенные лимфатические узлы и клетки повторно заражали пептидом OVA SIINFEKL. Через 3 дня культивирования IFNγ титровали в супернатанте методом ELISA. B: shControl CT26 (левая панель) или shCRT CT26 (правая панель) вводили мышам в бок. Когда опухоль достигала примерно 25 мм ² , мышей лечили PBS или BLM и отслеживали рост опухоли с помощью штангенциркуля с течением времени.C и D: клетки CT26 инъецировали мышам в бок. Когда опухоль достигала примерно 25 мм ² , мышей лечили PBS или BLM. Некоторым мышам вводили изотипический контроль или истощающие анти-CD8 (C) или анти-IFNγ (D). Мы наблюдали за ростом опухоли с помощью штангенциркуля с течением времени. Все представленные данные являются репрезентативными для одного из двух экспериментов. Графики показывают среднее значение +/- SEM.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065181.g002

BLM не оказывает влияния на врожденные иммунные клетки

В дополнение к своей способности вызывать ICD опухолевых клеток, химиотерапия может использовать иммунную систему хозяина, индуцируя созревание дендритных клеток [25], активацию NK-клеток [1] ​​или путем устранения иммуносупрессивных клеток, таких как Treg и MDSC [3]. 4], [26].

Чтобы рассмотреть эти возможности при лечении БЛМ, мы сначала оценили, действительно ли инъекция БЛМ значительно изменила количество В-клеток, CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, NK-клеток, дендритных клеток, моноцитов/макрофагов или MDSC в селезенке опухолевых клеток. несущие мыши (рис. 3а). Мы заметили, что обработка BLM не изменила долю всех проанализированных типов клеток. Далее мы проверили, способствует ли BLM созреванию антигенпрезентирующих клеток, проверяя влияние однократной системной инъекции BLM или липополисахарида (LPS) на характер созревания дендритных клеток селезенки (DC). В то время как LPS индуцировал, как и ожидалось, массивную активацию CD86 и CD40, введение BLM не влияло на экспрессию этих маркеров, исключая любые свойства BLM, непосредственно активирующие DC (рис. 3b).

Рисунок 3. БЛМ не оказывает очевидного влияния на клетки врожденного иммунитета.

A: Селезенки мышей с опухолями CT26, обработанных PBS или BLM, собирали, и клетки анализировали с помощью проточной цитометрии. На графике показана доля различных популяций спленоцитов, идентифицированных с помощью иммунного окрашивания.B: Мыши получили одну инъекцию PBS, LPS или BLM. Через день собирали селезенки и оценивали состояние созревания дендритных клеток, определяемое как CD11c ^hi и MHC-II ⁺ , с помощью проточной цитометрии с окрашиванием CD40 (левая панель) и CD86 (правая панель). C: Мы вводили клетки CT26 в бедро мышей. Когда опухоль достигала примерно 25 мм ² , мы лечили их PBS, одной или пятью инъекциями BLM. Через день после последней инъекции собирали паховые лимфатические узлы и анализировали активацию NK-клеток с помощью иммуноокрашивания CD69. D: То же, что и A, с дальнейшей идентификацией субпопуляций MDSC с иммуноокрашиванием Ly6G и Ly6C. Клетки выделены как CD11b ^hi среди живых клеток. E: MDSC от мышей, несущих CT26, получавших PBS или BLM, выделяли из селезенки и совместно культивировали с OT-I в присутствии SIINFEKL. Через 3 дня культивирования IFNγ титровали в супернатанте методом ELISA. Все представленные данные являются репрезентативными для одного из трех экспериментов. Графики показывают среднее значение +/- SEM.

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0065181.g003

Мы также проверили активацию NK-клеток в дренирующих опухоль лимфатических узлах. Мы не наблюдали какой-либо активации NK, оцениваемой по экспрессии CD69, ни после PBS, ни после одной, ни после пяти инъекций BLM (рис. 3c).

Наконец, мы оценили частоту MDSC в селезенке мышей с опухолями, получавших лечение BLM. Мы обнаружили, что BLM не влиял на количество миелоидных или гранулоцитарных подмножеств MDSC (рис. 3d) и не влиял на иммуносупрессивную функцию MDSC, что оценивалось по способности MDSC подавлять способность OT-I продуцировать IFNγ (рис. 3e).

В целом эти данные свидетельствуют о том, что BLM не влияет на клетки врожденного иммунитета, такие как дендритные клетки, NK-клетки или MDSC.

BLM опосредует пролиферацию регуляторных Т-клеток посредством TGFβ, полученного из опухолевых клеток

Хотя мы не обнаружили изменений в большинстве популяций иммунных клеток (рис. 3а), мы наблюдали накопление Foxp3 ⁺ Treg в лимфоидных органах мышей, получавших лечение BLM и несущих опухоли CT26 (рис. 4а) или EL4 (не показано). затем определили биологическую функцию этих Treg.Мы отсортировали субпопуляции Т-клеток CD4 ⁺ CD25 ⁺ (Treg) и CD4 ⁺ CD25 ^— (обычные Т) из селезенки мышей с опухолями, получавших PBS или BLM, и проверили их способность притуплять Продукция IFNγ клетками OT-I в анализе in vitro . Как и ожидалось, мы наблюдали, что обычные Т-клетки были неспособны подавлять способность OT-I продуцировать IFNγ. Напротив, Treg от необработанных мышей или мышей, получавших BLM, обладал сильной и аналогичной способностью притуплять продукцию OT-I IFNγ (рис. 4b).

Рисунок 4. BLM индуцирует in vivo накопление Treg посредством продукции TGFb.

A: Собирали селезенки мышей с опухолями CT26, обработанных PBS или BLM, и клетки анализировали с помощью проточной цитометрии на обнаружение Foxp3 ⁺ CD4 ⁺ Treg. B: Treg от мышей, несущих CT26, получавших PBS или BLM, выделяли из селезенки и совместно культивировали с OT-I в присутствии SIINFEKL (SII). Через 3 дня культивирования IFNγ титровали в супернатанте методом ELISA.C: Схематическое представление экспериментов с панелями D и E. D: GFP ⁺ Клетки CD4 ⁺ были отсортированы от мышей CD45.2 FOXP3-EGFP, затем инъецированы внутривенно. у мышей CD45.1 с опухолью CT26. Затем мышей обрабатывали PBS, IL-2 или BLM. Всем мышам вводили EdU. Через сутки после лечения собирали селезенки и опухоли и оценивали статус пролиферации перенесенных клеток путем выявления EdU с помощью проточной цитометрии. E: CD4 ⁺ CD62L ⁺ GFP ^— наивных Т-клеток отделяли от CD45.2 мышам FOXP3-EGFP и вводили внутривенно. у мышей CD45.1 с опухолью CT26. Затем мышей обрабатывали PBS или BLM. Собирали селезенки и анализировали клетки с помощью проточной цитометрии на обнаружение Treg. F: мышам инъецировали 1,10 ⁶ клеток CT26 внутрибрюшинно. Через десять дней мышам вводили PBS или BLM. На следующий день собирали асцит и оценивали TGFβ с использованием метода ELISA. G: клетки CT26 обрабатывали PBS или BLM in vitro в течение 24 часов, затем супернатант собирали и оценивали на TGFβ с помощью метода ELISA.H: Мышей, несущих опухолевые клетки CT26, обрабатывали PBS или BLM. На следующий день собирали опухоли CT26 и опухолевые клетки отделяли от инфильтрирующих опухоль лимфоцитов. Опухолевые клетки окрашивали на LAP и анализировали с помощью проточной цитометрии. I: GFP ⁺ CD4 ⁺ клетки отбирали от мышей CD45.2 FOXP3-EGFP, затем культивировали in vitro в условиях, стимулирующих TCR. Мы добавили культуральный супернатант CT26, обработанный в течение 24 часов PBS BLM. В некоторые лунки добавляли блокирующие антитела против TGFβ.После трех дней культивирования клетки инкубировали с BrdU в течение 3 ч, а затем проводили детекцию BrdU с помощью проточной цитометрии. J: То же, что и A, но мышам вводили блокирующие антитела против TGFβ. Все представленные данные являются репрезентативными для одного из двух (панели B, D, E, G и I) или трех экспериментов (панели A, F, H и J). Графики показывают среднее значение +/- SEM.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065181.g004

Более высокое присутствие Treg может быть связано с дифференцировкой наивных Т-клеток в Treg или экспансией ранее существовавших Treg.Чтобы проверить эти гипотезы, мы перенесли CD45. 2 CD4 ⁺ GFP ⁺ (Treg) или CD45.2 CD4 ⁺ GFP ^— CD62L ⁺ (наивные Т-клетки) от мышей Foxp3-EGFP к CD45. 1 мышь с опухолями (рис. 4с). Мы наблюдали, что BLM индуцирует пролиферацию Treg на том же уровне, что и инъекция IL-2, известного индуктора Treg (рис. 4d) [27], [28]. Напротив, BLM не смог индуцировать дифференцировку наивных Т-клеток в Treg (рис. 4e).

Известно, что пролиферация клеток

Treg обусловлена ​​продукцией IL-2 [28], [29] или TGFβ [30], [31].Мы проверили наличие IL-2 и TGFβ в асците на модели перитонеального карциноза CT26. Хотя мы не смогли обнаружить какой-либо IL-2 в асците мышей, получавших PBS или BLM (не показано), мы наблюдали индукцию продукции TGFβ в асците животных, получавших BLM (рис. 4f). In vitro мы также наблюдали, что обработка BLM индуцировала продукцию TGFβ с помощью CT26 как на уровне мРНК (рис. S3), так и на уровне белка (рис. 4g). Точно так же мы наблюдали, что BLM может индуцировать экспрессию мРНК tgfb в клетках B16F10, EL4 и MCA205 (не показано).

Чтобы подтвердить, что TGFβ также продуцируется in vivo опухолевыми клетками, мы определили экспрессию латентно-ассоциированного белка (LAP), белка, связанного с TGFβ, в раковых и иммунных клетках. Только опухолевые клетки, выделенные из подкожной опухоли, показали повышенную экспрессию LAP после лечения BLM (рис. 4h и рис. S4).

Чтобы проверить, может ли эта продукция TGFβ опухолевыми клетками быть ответственной за накопление Treg у мышей, получавших BLM, мы отсортировали CD4 ⁺ GFP ⁺ от мышей Foxp3-EGFP и стимулировали их с помощью запуска Т-клеточного рецептора (TCR).В некоторых условиях добавляли супернатант клеток CT26, обработанных PBS или BLM, с блокирующим антителом против TGFβ или без него. После 72 ч стимуляции пролиферацию Treg оценивали с помощью анализа включения BrdU. Мы могли наблюдать, что супернатант обработанного BLM CT26 индуцирует пролиферацию Treg и что этот эффект зависит от TGFβ (рис. 4i). In vivo мы также наблюдали, что ингибирование TGFβ блокирующим антителом против TGFβ предотвращает индуцированное BLM накопление Treg у мышей с опухолями (фиг. 4j).

Взятые вместе, эти данные убедительно свидетельствуют о том, что BLM индуцирует накопление Treg за счет увеличения продуцируемого опухолью TGFβ.

TGFβ или истощение регуляторных Т-клеток усиливает противоопухолевое действие BLM

Чтобы оценить терапевтическую значимость этих наблюдений, мы проверили влияние истощения Treg на противоопухолевый эффект BLM. В модели карциномы толстой кишки CT26. Сначала мы заметили, что противоопухолевый эффект BLM резко улучшился за счет истощения CD4 ⁺ Т-клеток (рис. 5а).Чтобы подтвердить, что противоопухолевый эффект истощения CD4 в основном опосредуется Treg, мы протестировали действие анти-CD25, которое является мембранным маркером мышиного Treg, истощающего антитела. Мы заметили, что истощение CD25 также повышает противоопухолевую эффективность BLM (рис. 5b).

Рисунок 5. Противоопухолевый эффект BLM усиливается за счет истощения Treg или TGFβ.

Пятьсот тысяч клеток CT26 вводили в бок мышам. Когда опухоль достигала примерно 25 мм ² , мышей лечили PBS или BLM.Некоторым мышам вводили контрольные антитела изотипа или истощающие анти-CD4 (A), анти-CD25 (B) или блокирующие анти-TFGβ (C) антитела. Рост опухоли контролировали штангенциркулем в течение времени. Все представленные данные являются репрезентативными для одного из двух экспериментов. Графики показывают среднее значение +/- SEM.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065181.g005

Выше (рис. 4) мы продемонстрировали, что BLM индуцирует продукцию TGFβ опухолевыми клетками и экспансию Treg у мышей с опухолями.Чтобы определить, влияет ли это явление на противоопухолевый эффект BLM, мы лечили мышей с опухолями либо BLM, либо анти-TGFβ, либо обоими. В то время как антитело против TGFβ не оказывало существенного влияния на рост опухоли, истощение TGFβ усиливало противоопухолевую эффективность BLM (фиг. 5c).

В совокупности эти данные подчеркивают, что лечение BLM вызывает TGFβ-зависимую пролиферацию Treg, что снижает его противоопухолевую эффективность.

Обсуждение

Наше исследование показывает, что БЛМ можно отнести к числу иммуногенных противоопухолевых препаратов, которые запускают ИКД наряду с оксалиплатином и антрациклинами [7], [8], [32].Здесь, изучая иммунные эффекты противоракового лечения BLM, мы показываем, что BLM способен вызывать ER и окислительный стресс, воздействие CRT, высвобождение HMGB1, аутофагию и высвобождение АТФ, обеспечивая все элементы, необходимые для индукции ICD. приводя к ответу IFNγ и CD8 ⁺ Т-клеток против опухолевых клеток. Важно отметить, что BLM имеет обоюдоострый эффект, поскольку BLM также индуцирует продукцию TGFβ опухолевыми клетками и последующее накопление Treg, что ограничивает его противоопухолевую эффективность. Эти данные демонстрируют, что БЛМ может иметь амбивалентные иммунные эффекты, которые ограничивают противоопухолевую эффективность этого противоракового агента.Это похоже на наши недавние выводы об иммунных эффектах 5-фторурацила (5 FU) на опухолевый иммунитет. Мы действительно описали, что 5-ФУ индуцирует гибель MDSC, что восстанавливает CD8 ⁺ T-клеточный противоопухолевый иммунитет и обуславливает первоначальную эффективность химиотерапии [4]. Но когда MDSC погибают, они высвобождают IL-1β, который индуцирует накопление вредных клеток Th27, способствуя более позднему рецидиву опухоли [33]. Вместе эти наблюдения о 5 FU и BLM подчеркивают важность проведения систематического анализа иммунного действия противоопухолевых агентов на различные аспекты иммунного ответа.

Кроме того, сердечные гликозиды, такие как дигоксин, недавно были идентифицированы как сильные иммуногенные индукторы гибели клеток с использованием стратегии высокой пропускной способности [34]. В этом исследовании на моделях грызунов было показано, что обработка опухолевых клеток дигоксином может усиливать эффекты неиммуногенных цитотоксических препаратов, таких как цисплатин [32], благодаря их способности превращать неиммуногенные клетки в иммуногенные. Однако влияние BLM на иммунный ответ при использовании этой стратегии не было обнаружено. Таким образом, мы считаем, что систематический анализ иммунных свойств химиотерапевтических агентов на каждой подгруппе иммунных клеток дополняет стратегию высокой пропускной способности.

Foxp3 ⁺ CD4 ⁺ CD25 ⁺ Treg первоначально были определены как субпопуляция супрессорных Т-клеток, которые опосредуют иммунную толерантность путем подавления аутореактивных Т-клеток [35], [36]. При неоплазии человека Treg-клетки накапливаются в опухолях, дренируя лимфатические узлы и кровь, и их индукция часто коррелирует с плохим исходом как при раке человека, так и при раке грызунов [37].Было установлено, что активация и экспансия подмножества Treg зависят от IL-2 [28], [29] и TGFβ [30], [31]. Обработка фибробластов легких BLM приводит к увеличению транскрипции tgfb1 и увеличению белка TGFβ [38], [39]. Эта продукция TGFβ фибробластами в легких после инъекции BLM ответственна за индукцию фиброза легких, одного из основных побочных эффектов BLM [40], [41]. Здесь мы сделали оригинальное наблюдение, что BLM также может запускать продукцию TGFβ опухолевыми клетками.Мы можем предположить, что это увеличение экспрессии TGFβ может привести к иммуносубверсии противоракового иммунного ответа. В частности, мы показали, что BLM-индуцированная продукция TGFβ опухолевыми клетками стимулирует экспансию Treg и, таким образом, может ингибировать CD8 ⁺ противоопухолевый иммунный ответ, вызванный BLM-управляемой иммуногенной гибелью клеток. В модели B16F10, хотя высокая или низкая доза BLM могла индуцировать продукцию TGFβ с помощью B16F10, только высокая концентрация BLM могла индуцировать ICD (не показано). Таким образом, мы можем выдвинуть гипотезу о том, что в некоторых случаях эффект ICD, который возникает только при высоких дозах BLM, менее вероятен [90–101] in vivo [90–102] и что индукция, управляемая TGFβ-Treg, будет преобладающей.Мы также показываем, что истощение Treg или ингибирование TGFβ значительно повышают противоопухолевую эффективность BLM в нашей модели in vivo на грызунах . Взятые вместе с текущей литературой, наши данные позволяют предположить, что TGFβ и Treg ответственны как за ограниченный противоопухолевый эффект, так и за основной побочный эффект BLM [40], [41]. Это может служить основанием для того, чтобы разрушить это явление путем комбинирования ингибиторов BLM и Treg, таких как циклофосфамид [3]. В будущем связь между BLM и новыми препаратами, такими как антитела против человеческого CD25 (такие как даклизумаб) [42] или ингибиторы передачи сигналов TGFβ (такие как ингибиторы Smad) [43], может быть полезной как для противораковой эффективности, так и для побочных эффектов. управление эффектами.

В заключение, это исследование подтверждает амбивалентное иммунологическое свойство BLM за счет его способности вызывать иммуногенную гибель клеток и накопление Treg.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Обработка BLM индуцирует образование АФК. Клетки CT26 обрабатывали 24 часа 90×101 in vitro 90×102 PBS, митомицином С (Mito C), доксорубицином (DOX) или блеомицином (BLM) с добавлением PBS или N-ацетилцистеина (NAC). Через 24 ч культивирования продукцию радикалов оценивали с помощью обнаружения DCFH ₂ /DA с помощью проточной цитометрии.Представленные данные являются репрезентативными для одного из трех экспериментов. Графики показывают среднее значение +/- SEM.

10.1371/journal.pone.0065181.s001

(TIF)

Рисунок S2.

Лечение BLM вызывает аутофагию. Клетки CT26 культивировали на предметном стекле и обрабатывали PBS, Mito C, DOX или BLM в течение 24 часов (шкала: 10 мкм). Верхняя панель: клетки фиксировали и пермеабилизировали, затем метили антителом против LC3 (зеленый) и DAPI (синий). Нижняя панель: клетки окрашивали с использованием набора для обнаружения аутофагии Cyto-ID, показывая аутофагосомы (зеленый) и Hoescht 33342 (синий).Представленные данные являются репрезентативными для одного из двух экспериментов.

10.1371/journal.pone.0065181.s002

(TIF)

Рисунок S3.

Обработка BLM индуцирует транскрипцию tgfb в опухолевых клетках. Клетки CT26 обрабатывали in vitro PBS, BLM или DOX. Через 24 часа клетки собирали и выделяли их мРНК, а затем подвергали RT-qPCR для экспрессии tgfb . Результаты показаны стандартизированными по экспрессии актина . Представленные данные являются репрезентативными для одного из трех экспериментов.

10.1371/journal.pone.0065181.s003

(TIF)

Рисунок S4.

BLM Лечение in vivo не вызывает заметной модификации Lap в иммунных клетках хозяина. Мышей, несущих опухолевые клетки CT26, обрабатывали PBS или BLM. На следующий день собирали опухоли CT26 и клетки селезенки. Опухолевые клетки отделяли от инфильтрирующих опухоль лимфоцитов. Клетки селезенки и инфильтрирующие опухоль лимфоциты окрашивали на LAP и анализировали с помощью проточной цитометрии. Представленные данные являются репрезентативными для одного из трех экспериментов.

10.1371/journal.pone.0065181.s004

(TIF)

Авторские взносы

Идея и разработка экспериментов: FG GM. Выполняли опыты: Х. Бугаут М.Б. Х. Бергер В.Д. ЛО РЭ СЛ ФК ФВ ЧР. Проанализированы данные: ЧР ЛА ФГ ГМ. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты анализа: CR. Написал статью: FG GM.

Каталожные номера

1. 1. Hervieu A, Rebe C, Vegran F, Chalmin F, Bruchard M и др.. (2012) Дакарбазин-опосредованная активация лигандов NKG2D на опухолевых клетках активирует NK и CD8 T-клетки и сдерживает рост меланомы.Джей Инвест Дерматол.
2. 2. Миньо Г., Ульрих Э., Бонморт М., Менар С., Апетох Л. и др. (2008) Критическая роль ИЛ-15 в противоопухолевых эффектах, опосредованных комбинированной терапией иматинибом и ИЛ-2. Дж. Иммунол 180: 6477–6483.
3. 3. Гирингелли Ф., Менар С., Пуч П.Е., Ладуар С., Ру С. и др. (2007)Метрономная схема циклофосфамида избирательно истощает CD4+CD25+ регуляторные Т-клетки и восстанавливает эффекторные функции Т- и NK у больных раком на терминальной стадии.Рак Иммунол Иммунотер 56: 641–648.
4. 4. Винсент Дж., Миньо Г., Чалмин Ф., Ладуар С., Брушар М. и др. (2010) 5-фторурацил избирательно убивает ассоциированные с опухолью супрессорные клетки миелоидного происхождения, что приводит к усилению Т-клеточно-зависимого противоопухолевого иммунитета. Рак Рез. 70: 3052–3061.
5. 5. Apetoh L, Locher C, Ghiringhelli F, Kroemer G, Zitvogel L (2011)Использование дендритных клеток при раке. Семин Иммунол 23: 42–49.
6. 6. Тесниер А., Панаретакис Т., Кепп О., Апетох Л., Гирингелли Ф. и другие.(2008) Молекулярные характеристики иммуногенной гибели раковых клеток. Cell Death Differ 15: 3–12.
7. 7. Обейд М., Тесниер А., Гирингелли Ф., Фимия Г.М., Апетох Л. и др. (2007) Воздействие кальретикулина определяет иммуногенность гибели раковых клеток. Nat Med 13: 54–61.
8. 8. Apetoh L, Ghiringhelli F, Tesniere A, Obeid M, Ortiz C, et al. (2007)Toll-подобный рецептор 4-зависимый вклад иммунной системы в противораковую химиотерапию и лучевую терапию. Nat Med 13: 1050–1059.
9. 9. Ghiringhelli F, Apetoh L, Tesniere A, Aymeric L, Ma Y и др. (2009)Активация инфламмасомы NLRP3 в дендритных клетках индуцирует IL-1бета-зависимый адаптивный иммунитет против опухолей. Nat Med 15: 1170–1178.
10. 10. Рыжков В.К., Зейдлиц В.Н., Тихонов К.Б. (1977) Применение протамина сульфата в качестве сосудорасширяющего средства при ангиографии печени и селезенки. Вестн Рентгенол Радиол: 41–45.
11. 11. Dresp J, Schmid E, Bauchinger M (1978)Цитогенетический эффект блеомицина на периферические лимфоциты человека in vitro и in vivo.Мутат Рез 56: 341–353.
12. 12. Caspary WJ, Lanzo DA, Niziak C (1982) Влияние дезоксирибонуклеиновой кислоты на выработку восстановленного кислорода блеомицином и железом. Биохимия 21: 334–338.
13. 13. Hay J, Shahzeidi S, Laurent G (1991) Механизмы повреждения легких, вызванного блеомицином. Arch Toxicol 65: 81–94.
14. 14. Мейер Р. М., Господарович М.К., Коннорс Дж.М., Пирси Р.Г., Уэллс В.А. и соавт. (2012) Только ABVD по сравнению с лучевой терапией при ограниченной стадии лимфомы Ходжкина.N Engl J Med 366: 399–408.
15. 15. Уильямс С.Д., Берч Р., Эйнхорн Л.Х., Ирвин Л., Греко Ф.А. и др. (1987) Лечение диссеминированных герминогенных опухолей цисплатином, блеомицином и либо винбластином, либо этопозидом. N Engl J Med 316: 1435–1440.
16. 16. Беттелли Э., Кэрриер Ю., Гао В., Корн Т., Стром Т.Б. и др. (2006)Взаимные пути развития образования патогенных эффекторных Th27 и регуляторных Т-клеток. Природа 441: 235–238.
17. 17. Чалмин Ф., Ладуар С., Миньо Г., Винсент Дж., Брушар М. и др.(2010)Связанный с мембраной Hsp72 из экзосом опухолевого происхождения опосредует STAT3-зависимую иммуносупрессивную функцию супрессорных клеток миелоидного происхождения мыши и человека. Дж. Клин Инвест 120: 457–471.
18. 18. Чалмин Ф., Миньо Г., Брушар М., Шеврио А. , Вегран Ф. и др. (2012) Факторы транскрипции Stat3 и Gfi-1 контролируют иммуносупрессивную активность клеток Th27 посредством регуляции экспрессии эктонуклеотидазы. Иммунитет 36: 362–373.
19. 19. Burger RM, Peisach J, Horwitz SB (1981)Активированный блеомицин.Временный комплекс лекарств, железа и кислорода, разрушающий ДНК. J Biol Chem 256: 11636–11644.
20. 20. Уоллах-Даян С.Б., Избицкий Г., Коэн П.Ю., Герстл-Голан Р., Файн А. и др. (2006) Блеомицин инициирует апоптоз эпителиальных клеток легких с помощью АФК, но не путем Fas/FasL. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 290: L790–L796.
21. 21. Гарг А.Д., Крыско Д.В., Верфайли Т., Качмарек А., Феррейра Г.Б. и соавт. (2012)Новый путь, сочетающий воздействие кальретикулина и секрецию АТФ при иммуногенной гибели раковых клеток.EMBO J 31: 1062–1079.
22. 22. Panaretakis T, Kepp O, Brockmeier U, Tesniere A, Bjorklund AC, et al. (2009) Механизмы преапоптотического воздействия кальретикулина при иммуногенной гибели клеток. EMBO J 28: 578–590.
23. 23. Панаретакис Т., Йоза Н., Моджтахеди Н., Теньер А., Витале И. и др. (2008) Ко-транслокация ERp57 и кальретикулина определяет иммуногенность гибели клеток. Cell Death Differ 15: 1499–1509.
24. 24. Michaud M, Martins I, Sukkurwala AQ, Adjemian S, Ma Y, et al.(2011)Зависимые от аутофагии противораковые иммунные ответы, индуцированные химиотерапевтическими агентами у мышей. Наука 334: 1573–1577.
25. 25. Tanaka H, ​​Matsushima H, Nishibu A, Clausen BE, Takashima A (2009)Двойная терапевтическая эффективность винбластина как уникального химиотерапевтического средства, способного вызывать созревание дендритных клеток. Рак Рез. 69: 6987–6994.
26. 26. Suzuki E, Kapoor V, Jassar AS, Kaiser LR, Albelda SM (2005)Гемцитабин избирательно устраняет миелоидные супрессорные клетки селезенки Gr-1+/CD11b+ у животных с опухолями и усиливает противоопухолевую иммунную активность.Clin Cancer Res 11: 6713–6721.
27. 27. Thornton AM, Donovan EE, Piccirillo CA, Shevach EM (2004) Передний край: IL-2 критически необходим для in vitro активации функции подавления CD4+CD25+ T-клеток. Дж. Иммунол 172: 6519–6523.
28. 28. Меленсио Л., Маккаллип Р.Дж., Гуан Х., Рамакришнан Р., Джейн Р. и др. (2006)Роль CD4(+)CD25(+) Т-регуляторных клеток в IL-2-индуцированной протечке сосудов. Int Immunol 18: 1461–1471.
29. 29. Thornton CA, Upham JW, Wikstrom ME, Holt BJ, White GP и др.(2004)Функциональное созревание CD4+CD25+CTLA4+CD45RA+ Т-регуляторных клеток в неонатальных Т-клеточных реакциях человека на антигены/аллергены окружающей среды. Дж. Иммунол 173: 3084–3092.
30. 30. Хубер С., Шрамм С., Лер Х.А., Манн А., Шмитт С. и др. (2004) Передовой край: передача сигналов TGF-бета необходима для экспансии in vivo и иммуносупрессивной способности регуляторных CD4+CD25+ Т-клеток. Дж. Иммунол 173: 6526–6531.
31. 31. Ghiringhelli F, Puig PE, Roux S, Parcellier A, Schmitt E, et al. (2005)Опухолевые клетки превращают незрелые миелоидные дендритные клетки в секретирующие TGF-бета клетки, индуцирующие пролиферацию регуляторных Т-клеток CD4+CD25+. J Exp Med 202: 919–929.
32. 32. Тесниер А., Шлеммер Ф., Бойге В., Кепп О., Мартинс И. и др. (2010)Иммуногенная гибель клеток рака толстой кишки, обработанных оксалиплатином. Онкоген 29: 482–491.
33. 33. Brucard M, Mignot G, Derangere V, Chalmin F, Chevriaux A, et al.. (2012) Высвобождение катепсина B, вызванное химиотерапией, в супрессорных клетках миелоидного происхождения активирует инфламмасому Nlrp3 и способствует росту опухоли.Нат Мед.
34. 34. Menger L, Vacchelli E, Adjemian S, Martins I, Ma Y и другие. (2012) Сердечные гликозиды оказывают противораковое действие, вызывая иммуногенную гибель клеток. Sci Transl Med 4: 143ra199.
35. 35. Sakaguchi S (2000)Регуляторные Т-клетки: ключевые регуляторы иммунологической самопереносимости. Ячейка 101: 455–458.
36. 36. Шевач Е.М. (2002) CD4+ CD25+ супрессорные Т-клетки: больше вопросов, чем ответов. Nat Rev Immunol 2: 389–400.
37. 37.Nishikawa H, Sakaguchi S (2010)Регуляторные Т-клетки в опухолевом иммунитете. Int J Рак 127: 759–767.
38. 38. Брин Э., Шулл С., Бёрн С., Абшер М., Келли Дж. и др. (1992) Регуляция блеомицином мРНК трансформирующего фактора роста-бета в фибробластах легких крысы. Am J Respir Cell Mol Biol 6: 146–152.
39. 39. Li H, He B, Que C, Weng B (1996)Экспрессия мРНК TGF-бета 1, PDGF и IGF-1 в легких при индуцированном блеомицином-A5 легочном фиброзе у крыс. Chin Med J (англ.) 109: 533–536.
40. 40. Голди Дж., Колб М., Аск К., Мартин Г., Боннио П. и др. (2006)Передача сигналов Smad3 участвует в легочном фиброзе и эмфиземе. Proc Am Thorac Soc 3: 696–702.
41. 41. Халил Н., Гринберг А.Х. (1991)Роль TGF-бета в легочном фиброзе. Ciba Found Symp 157: 194–207; обсуждение 207–111.
42. 42. Rech AJ, Vonderheide RH (2009)Клиническое использование даклизумаба против CD25-антитела для усиления иммунного ответа на вакцинацию опухолевого антигена путем нацеливания на регуляторные Т-клетки.Ann NY Acad Sci 1174: 99–106.
43. 43. Calone I, Souchelnitskyi S (2012)Ингибирование передачи сигналов TGFbeta и его значение в противоопухолевом лечении. Опыт Онкол 34: 9–16.

Типы, побочные эффекты и стоимость

Таргетная терапия рака — это препараты, воздействующие на определенные части раковых клеток, такие как белки или гены, которые способствуют росту и распространению рака. Они также могут преследовать другие типы клеток, которые способствуют росту и распространению рака.Для некоторых видов рака таргетная терапия может работать лучше, чем другие методы лечения.

Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрило таргетную терапию более чем 15 видов рака, в том числе рака молочной железы, предстательной железы, толстой кишки и легких. Но они работают только в том случае, если ваша опухоль имеет правильную мишень. И таргетная терапия часто может перестать работать, если цель меняется или ваш рак находит способ обойти лечение.

Исследователи узнают больше об изменениях, вызывающих рак. Это может привести к более целенаправленной терапии в будущем.

Типы таргетной терапии

Существует два основных типа таргетной терапии: низкомолекулярные препараты и моноклональные антитела.

Низкомолекулярные лекарства достаточно малы, чтобы проникнуть внутрь раковых клеток и уничтожить их.

Вы часто можете заметить низкомолекулярные лекарства, потому что их общее название заканчивается на «-ib». Например, иматиниб (Гливек) лечит хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ) и другие виды рака, блокируя сигналы, которые заставляют опухолевые клетки расти.

Моноклональные антитела слишком велики, чтобы проникнуть в клетки.Вместо этого они атакуют цели снаружи клеток или прямо вокруг них. Иногда их используют для запуска химиотерапии и радиации прямо в опухоли. Обычно их вводят через капельницу в вену на руке в больнице или клинике. Иногда их дают как укол.

Общие названия моноклональных антител оканчиваются на «-mab». Бевацизумаб (Авастин) представляет собой моноклональное антитело, блокирующее кровеносные сосуды, питающие опухоли.

Ученые придумали множество низкомолекулярных препаратов и моноклональных антител, которые используют разные мишени для лечения рака разными способами.

Гормональная терапия останавливает выработку организмом гормонов, необходимых для развития некоторых видов рака молочной железы и простаты, или препятствует действию гормонов.

Лекарства от рака молочной железы, такие как тамоксифен, блокируют женский гормон эстроген. Ингибиторы ароматазы снижают количество эстрогена в организме. При раке предстательной железы врачи могут прописать лекарства, которые блокируют мужские половые гормоны или препятствуют их выработке в организме.

Ингибиторы сигнальной трансдукции являются наиболее распространенными таргетными препаратами. Они блокируют сигналы, которые заставляют клетки делиться слишком сильно и слишком быстро.

Одним из примеров является лекарство от рака молочной железы трастузумаб (герцептин). Белок снаружи клеток, называемый рецептором HER2, улавливает сигналы, заставляющие клетку расти и делиться. HER2-положительный рак молочной железы вырабатывает слишком много этого белка, поэтому раку постоянно говорят: «Расти! Расти! Расти!» Трастузумаб может замедлить или остановить этот тип рака молочной железы, цепляясь за белки рецептора HER2, например, закрывая окна фольгой.

Модуляторы экспрессии генов. Этот тип таргетной терапии работает для изменения белков, которые контролируют то, как инструкции генов в раковых клетках выполняются или экспрессируются, потому что это ненормально.

Индукторы апоптоза. Раковые клетки часто находят способ обойти естественный процесс апоптоза, когда здоровые клетки умирают, когда становятся старыми или поврежденными. Индукторы апоптоза вызывают нормальную гибель раковых клеток.

Бортезомиб (Велкейд) — это препарат, который воздействует на лимфому и множественную миелому, рак крови.Ученые также изучают растительные соединения, такие как ресвератрол (содержащийся в красном вине), чтобы выяснить, могут ли они вызывать гибель раковых клеток.

Ингибиторы ангиогенеза блокируют рост кровеносных сосудов, которые образуются раковыми клетками для получения питательных веществ и кислорода. Некоторые нацелены на вещество, называемое фактором роста эндотелия сосудов (VEGF). Другие идут за различными веществами, которые вызывают рост кровеносных сосудов. Если опухоль уже имеет кровоснабжение, от нее можно избавиться с помощью таргетной терапии.

Иммунотерапия использует вашу иммунную систему для уничтожения раковых клеток.Некоторые укрепляют вашу иммунную систему, чтобы она лучше справлялась с раком. Другие помечают опухолевые клетки, чтобы вашей иммунной системе было легче их найти.

Кто получает таргетную терапию

У некоторых видов рака, таких как ХМЛ, почти всегда есть цель, на которой можно сосредоточить лечение. Но иногда вашему врачу нужно будет проверить вашу опухоль, чтобы увидеть, есть ли у нее какие-либо мишени. Иногда делают биопсию — берут небольшой образец опухоли и проверяют его в лаборатории.

Даже если у вас тот же тип рака, что и у другого человека, у вас может не быть той же цели.Не все виды рака молочной железы являются HER2-положительными. Лекарства против рака толстой кишки, такие как цетуксимаб (Эрбитукс), не будут работать, если у вас есть мутация гена KRAS.

Прежде чем ваш врач порекомендует таргетную терапию, вам, возможно, придется сначала попробовать другие методы лечения. Таргетная терапия часто назначается вместе с другими видами лечения.

Побочные эффекты

Таргетная терапия может вызывать серьезные побочные эффекты. Распространенными являются диарея, проблемы с печенью, такие как гепатит, и изменения кожи, волос и ногтей.

Большинству людей труднее всего справляться с проблемами кожи. Это происходит потому, что таргетная терапия рака воздействует на те же факторы роста и кровеносные сосуды, которые необходимы для здоровой кожи. Следите за:

• Сыпь, похожая на прыщи, на коже головы, лица, шеи, груди и спины. Он может чесаться, гореть, жалить или болеть. Иногда можно заразиться. Обычно это длится все время лечения, но проходит после прекращения лечения.
• Ощущение, будто вы сильно обгорели на солнце. Это может начаться еще до того, как вы заметите какие-либо изменения на коже.
• Крайняя чувствительность к солнечному свету.
• Сухая кожа. Он есть почти у всех, кто проходит таргетную терапию. Ваша кожа может трескаться, особенно на руках и ногах, что затрудняет использование рук или ходьбу.
• Опухшие, болезненные язвы на ногтях рук и ног.
• Язвы на коже головы и выпадение волос или облысение. Ваши волосы могут стать странного цвета или не отрасти после лечения.
• Веки могут быть красными, опухшими и загнутыми внутрь или вниз. Это может повредить прозрачный слой на передней части глаза, называемый роговицей.

Перед тем, как начать лечение, переключитесь на мягкое, не содержащее химикатов и отдушек мыло и шампуни. Немедленно сообщите своему врачу о любых изменениях кожи. Их нужно лечить, чтобы не занести инфекцию. Если изменения кожи серьезные, вам может потребоваться прекратить прием таргетных препаратов.

Многие таргетные методы лечения лучше сочетаются с другими видами лечения, такими как химиотерапия и облучение, поэтому вы также можете столкнуться с этими побочными эффектами.

Ваш врач может объяснить, чего ожидать от вашего плана лечения.

Стоимость

Таргетная терапия может стоить десятки тысяч долларов в месяц. Один тип иммунотерапии, называемый CAR T, может стоить около полумиллиона долларов.

Тем не менее, цена может варьироваться в зависимости от типа лекарства, способа его получения, места получения и продолжительности приема.

No related posts.