Продукты с метионином: Содержание метионина в продуктах

Содержание

Метионин — Foodcom

Аминокислоты играют решающую роль в синтезе белка в организме и служат строительными блоками для белков. Метионин — одна из тех важнейших аминокислот, которые обеспечивают трансляцию остальной части аминокислотного профиля. Он служит ключом, который позволяет другим аминокислотам выполнять свою функцию.
Метионин также отвечает за стабилизацию белка.

 

Приложения

Метионин — важный ингредиент в питании животных. Продукт добавляют в кормовые премиксы для поддержания желаемого уровня метионина, которого может быть недостаточно в других источниках белка, таких как соевые бобы или семена рапса.


Технические аспекты

Метионин — важный ингредиент, обеспечивающий комплексный синтез белка. Это позволяет животному использовать остальные аминокислоты. Высокопродуктивные коровы нуждаются в повышенном уровне метионина для производства молока. Продукт также приводит к меньшему количеству нарушений здоровья и меньшему количеству выкидышей.

В рационе поросят метионин частично отвечает за синтез креатина. Добавленный в корм для птицы, метионин способствует увеличению яйценоскости, наращиванию мышечной массы и здоровью пищеварительного тракта.

 

Срок годности

Срок годности метионина — 3 лет. Хранить в сухом помещении при температуре не выше 30 ° С.

 

Упаковка

Foodcom S.A. поставляет метионин в мешках по 25 кг и так называемых биг-бегах.

 

 

Почему стоит выбрать Foodcom в качестве европейского поставщика кормовых добавок?

Качество услуг Foodcom подтверждено сертификатом BRC Agents & Brokers.

Наша отличная команда службы поддержки продаж поможет нашим трейдерам безупречно и эффективно заключать контракты и деловые сделки, чтобы обеспечить наилучшее качество обслуживания всем нашим бизнес-партнерам. Наша команда логистики позаботится о транспортировке, а финансовый отдел будет отвечать за все вопросы, связанные с финансовой частью сделки.

Структурная изменчивость гена богатого метионином альбумина SFA8 подсолнечника | Анисимова

1. Анисимова И. Н., Алпатьева Н. В., Тимофеева Г. И. Скрининг генетических ресурсов растений с использованием ДНК-маркеров: основные принципы, выделение ДНК, постановка ПЦР, электрофорез в агарозном геле: Методические указания ВИР / под ред. Е. Е. Радченко. СПб. : ВИР, 2010. 30 с.

2. Гаврилова В. А., Анисимова И. Н. Генетика культурных растений. Подсолнечник Санкт-Петербург : ВИР, 2003. 197 c.

3. Agizzio A. P., Da Cunha M., Carvalho A. O., Oliveira M. A., Ribeiro S. F., Gomes V. M. The antifungal properties of a 2S albumin-homologous protein from passion fruit seeds involve plasma membrane permeabilization and ultrastructural alterations in yeast cells // Plant Sci., 2006, vol. 171, no. 4, pp. 515−522. DOI: 10.1016/j.plantsci.2006.06.001.

4. Anisimova I. N., Fido R. J., Tatham A. S., Shewry P. R. Genotypic variation and polymorphism of 2S albumins of sunflower // Euphytica, 1995, vol. 83, pp. 15–23.

5. Anisimova I. N., Konarev A. V., Gavrilova V. A., Rozhkova V. T., Fido R. J., Tatham A. S., Shewry P. R. Polymorphism and inheritance of methionine-rich 2S albumins in sunflower // Euphytica, 2003, vol. 129. no. 1, pp. 99–107. DOI: 10.1023/A:1021562712945.

6. Badouin H., Gouzy G., Grassa C. J. et al. The sunflower genome provides insights into oil metabolism, flowering and Asterid evolution // Nature, 2017, vol. 546, pp. 148−152. DOI: 10.1038/nature22380.

7. Elliott A. G., Delay C., Liu H., Phua Z., Rosengren K. J., Benfield A. H., Panero J. L., Colgrave M. L., Jayasena A. S., Dunse K. M., Anderson M. A. Evolutionary origins of a bioactive peptide buried within preproalbumin // The Plant Cell, 2014, vol. 26, pp. 981–995. DOI 10.1105/tpc.114.123620.

8. Franke B., Colgrave M. L., Mylne J. S., Rosengren K. J. Mature forms of the major seed storage albumins in sunflower: A mass spectrometric approach // 2016, vol. 147, no. 1, pp.177−186. DOI: 10.1016/j.jprot.2016.05.004.

9. Jayasena A. S., Franke B., Rosengren J., Mylne J. S. A tripartite approach identifies the major sunflower seed albumins // Theor. Appl. Genet., 2016, vol. 129, no. 3, pp. 613−629. DOI: 10.1007/s00122-015-2653-3.

10. Kortt A. A., Caldwell J. B. Low molecular weight albumins from sunflower seed: identification of a methionine-rich albumin // Phytochemistry, 1990, vol. 29, no. 9, pp. 2805−2810.

11. Kortt A. A., Caldwell J. B., Lilley G. G., Higgins T. J. V. Amino acid and cDNA sequences of a methioninerich 2S protein from sunflower seed (Helianthus annuus L.) // Eur. J. Biochem., 1991, vol. 195, pp. 329−334. DOI: 10.1111/j.1432-1033.1991.tb15710.x.

12. Konarev Al. V., Gavrilova V. A., Rozhkova V. T., Fido R. J., Tatham A. S., Shewry P. R. Novel proteinase inhibitors in seeds of sunflower (Helianthus annuus L.): polymorphism, inheritance and properties. Theor. Appl. Genet., 2000, vol. 100, no. 1, pp. 82−88. DOI: 10.1007/s001220050012.

13. Konarev A. V., Anisimova I. N., Gavrilova V. A., Vachrusheva T. E., Konechnaya G. Y., Lewis M., Shewry P. R. Serine proteinase inhibitors in the Compositae: Distribution, polymorphism and properties // Phytochemistry, 2002, vol. 59, pp. 279−291. DOI: 10.1016/S0031-9422(01)00463-0.

14. Kreis M., Forde B. G., Rahman S., Miflin B. J., Shewry P. R. Molecular evolution of the seed storage proteins of barley, rye and wheat // J. Mol. Biol., 1985, vol. 183, no. 3, pp. 499−502.

15. Lin C. L., Taggart A. J., Fairbrother W. G. RNA structure in splicing: An evolutionary perspective // RNA Biol., 2016, vol. 13, no. 9, pp. 766−771. DOI: 10.1080/15476286.2016.1208893.

16. Luckett S., Garcia R. S., Barker J. J., Konarev A. V., Shewry P. R., Clarke A. R., Brady R. L. High resolution structure of a potent, cyclic proteinase inhibitor from sunflower seeds // J. Mol. Biol., 1999, vol. 290, pp. 525−533. DOI: 10.1006/jmbi.1999.2891.

17. Meyer M., Plass M., Pérez-Valle J., Eyras E., Vilardell J. Deciphering 3’ss selection in the yeast genome reveals an RNA thermosensor that mediates alternative splicing // Mol. Cell., 2011, vol. 43, no. 6, pp. 1033–1039. DOI: 10.1016/j.molcel.2011.07.030.

18. Moreno F.J., Clemente A. 2S Albumin Storage Proteins: What makes them food allergens? // Open Biochem. J., 2008, vol. 2, pp. 16−28. DOI: 10.2174/1874091X00802010016.

19. Mylne J. S., Colgrave M. L., Daly N. L., Chanson A. H., Elliott A. G., Mc Callum E. J., Jones A., Craik D. J. Albumins and their processing machinery are hijacked for cyclic peptides in sunflower // Nat. Chem. Biol., 2011, vol. 7, pp. 257−259. DOI: 10.1038/nCHeMBIO.542.

20. Odintsova T. I., Rogozhin E. A., Sklyar I. V., Musolyamov A. K., Kudryavtsev A. M., Pukhalsky V. A., Smirnov A. N., Grishin E. V., Egorov T. A. Antifungal activity of storage 2S albumins from seeds of the invasive weed dandelion Taraxacum officinale Wigg. // Protein and Peptide Letters, 2010, vol. 17, no. 4, pp. 522−529. DOI: 10.2174/092986610790963591.

21. Pandya M. J., Sessions R. B., Williams P. B., Dempsey C. E., Tatham A., Shewry P. R., Clarke A. R. Structural characterization of a methionine-rich, emulsifying protein from sunflower seed // Proteins: Structure Function, and Bioinformatics, 2000, vol. 38, no. 3, pp. 341−349. DOI: 10.1002/(SICI)1097- 0134(20000215)38:33.0.CO;2-D.

22. Radauer C., Breiteneder H. Evolutionary biology of plant food allergens // J. Allergy Clin. Immunol. 2007, vol. 120, no. 3, pp. 518–525. DOI: 10.1016/j.jaci.2007.07.024.

23. Shewry P. R., Napier J. A., Tatham A. S. Seed Storage Proteins: Structures and Biosynthesis // The Plant Cell, 1995, vol. 7, no. 7, pp. 945−956. DOI: 10.1105/tpc.7.7.945.

24. Shewry P. R., Tatham A. S. The characteristics, structures and evolutionary relationships of prolamins. In : Seed proteins (eds. P. R. Shewry, R. Casey). Kluwer Academic Publishers, the Netherlands, pp. 11−33.

25. Sun J., Zhao H., Nie L., Yi J., Zhang Q.-L. The intron in an albumin gene from sunflower increases expression of SFA8. In: Molecular breeding of forage and turf (eds. H. Budak, G. Spangenberg) 2015, pp. 183−191. DOI: 10.1007/978-3-319-08714-6_16.

26. Tabe L. M., Higgins C. M., McNabb W. C., Higgins T. J. Genetic engineering of grain and pasture legumes for improved nutritive value // Genetica, 1993, vol. 90, no. 2–3, pp. 181−200.

27. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction // Nucleic Acids Res., 2003, vol. 31, no. 13, pp. 3406−3415. DOI: 10.1093/nar/gkg595.

28. Youle R. J., Huang A. H. C. Occurrence of low molecular weight and high cysteine containing albumin storage proteins in oilseeds of diverse species // Am. J. Bot., 1981, vol. 68, no. 1, pp. 44−48. DOI: 10.2307/2442990.

Ученые назвали помогающую в профилактике рака диету. Ограничение метионина.: greentown2020 — LiveJournal

Американские ученые провели исследование с целью выяснить, какой тип питания помогает при профилактике лечения онкологических заболеваний. Выяснилось, что употребление овощей и фруктов способствует повышению эффективности химиотерапии и лучевой терапии при лечении онкологии.

Тем не менее роль питания в профилактике или лечении рака пока не так однозначна.

Джейсон Локасейл, старший автор недавнего исследования, объясняет: «Рак во многих отношениях сложнее, потому что это разные заболевания с множественными формами, часто определяемые на молекулярном уровне, поэтому мы только начинаем понимать, как диета, а также питание влияют на эти процессы.»

Их статья, опубликованная в журнале Nature, посвящена роли аминокислоты Метионин в лечении рака.

Что такое Метионин?

Метионин необходим для функционирования наших клеток. Эксперты называют ее незаменимой аминокислотой, потому что наш организм не может ее вырабатывать. Люди получают ее только через пищу, которую они едят.

Многие продукты содержат метионин, но особенно высокие его уровни содержат мясо и яйца.

Эта аминокислота интересовала исследователей много лет. Например, исследование, опубликованное в 1993 году, показало, что ограничение потребления метионина продлевает продолжительность жизни крыс.

Более поздние исследования обнаружили роль аминокислоты в метаболических изменениях. Одно из этих исследований на животных моделях показало, что она может предотвратить ожирение, вызванное специфической диетой.

Некоторые исследователи начали изучать потенциальную роль метионина в лечении рака. Метионин вызвал интерес у исследователей, поскольку он играет важную роль в клеточном механизме, на который ориентированы некоторые химиотерапевтические препараты и лучевая терапия. Ученые обозначают это, как одноуглеродный обмен.

Кроме того, в некоторых более ранних исследованиях уже указывалось, что ограничение метионина в рационе может иметь противораковый эффект. Авторы объясняют:

«Поэтому мы пришли к выводу, что ограничение метионина может иметь широкие противоопухолевые перспективы в виде нацеливания на определенную область метаболизма, и что эти противораковые эффекты будут взаимодействовать с реакцией на другие методы лечения, которые также влияют на одноуглеродный метаболизм».

В ходе исследования, ученые использовали различные модели рака. Во-первых, они протестировали два типа устойчивых к лечению раковых тканей, взятых у людей и привитых мышам.

Когда ученые кормили группу мышей пищей с пониженным уровнем метионина, рост опухоли у них замедлялся по сравнению с группой мышей, получавших стандартную диету.

Когда они изучили метаболические детали, то обнаружили, как и ожидалось, что ограничение метионина снижает рост опухоли, препятствуя метаболизму с одним углеродом.

Затем ученые использовали обычный химиотерапевтический препарат в сочетании с диетой с ограниченным содержанием метионина. Они использовали низкую дозу препарата, которой было недостаточно, чтобы уменьшить опухоль. Однако, по мнению авторов, диета с низким содержанием метионина в сочетании с препаратом привела к «заметному ингибированию (задержке) роста опухоли».

Когда исследователи изучали тип мышиной саркомы, которая не реагирует на лучевую терапию, они обнаружили, что одной только диеты с ограничением метионина недостаточно для замедления роста опухоли. Однако, когда эти мыши также получали дозу лучевой терапии, рост опухоли был значительно замедлен.

На следующем этапе своего исследования ученые в течение 3 недель кормили шесть здоровых людей пищей с низким уровнем метионина. Они получили метаболические эффекты, аналогичные тем, которые наблюдались и на мышах.

«Это исследование предполагает, что диетическое ограничение метионина вызывает быстрые и специфические метаболические изменения у мышей и людей, которые могут быть вызваны и в клинических условиях».

Исследователь Джейсон Локасейл считает, что «нарушая метаболический путь через ограничение метионина в рационе, можно усилить действие химиотерапии, направленной на эти аспекты метаболизма рака».

Как объясняют авторы, эти результаты являются предварительными, и этот подход может быть неэффективным для некоторых людей или для определенных типов рака. К тому же не исключено, считают они, что ограничение метионина может, напротив, даже стимулировать рост некоторых видов опухолей.

Короче говоря, исследователи ясно дают понять, что это не призыв к тому, чтобы люди стали стопроцентными вегетарианцами. Хотя этот тип диетического лечения и не будет принят в ближайшем времени, тем не менее, это важный шаг в понимании того, как диета может влиять на рост раковой опухоли. Вот заключение авторов:

«Это исследование может помочь установить принципы использования диетических вмешательств в процессе лечения рака в более широком контексте».

Высокий уровень омега-3 кислот связали с уменьшением риска смерти от всех причин

Ученые проанализировали уровень омега-3 кислот в крови у 42466 человек и смертность от всех причин в семнадцати когортах. Высокий уровень омега-3-полиненасыщенных жирных кислот из рыбы и морепродуктов, ассоциировался со снижением общего риска смерти на 15-18 процентов. Сходные результаты получили для риска смерти от сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. При этом такой связи не наблюдалось для альфа-линоленовой кислоты, содержащейся в растительных маслах.

Омега-3-полиненасыщенные жирные кислоты — ненасыщенные жирные кислоты, имеющие двойную углерод-углеродную связь в омега-3-позиции. Эти кислоты относятся к незаменимым, то есть человеческое тело не может их производить. Эйкозапентаеновую, доказопентаеновую, докозагексаеновую кислоты люди получают из рыбы и морепродуктов, в то время как альфа-линоленовая содержится во многих растительных маслах.

Ученые из десяти стран под руководством Уильяма Харриса (William S. Harris) из Университета Южной Дакоты изучили ассоциацию между содержанием омега-3 кислот и смертностью. Исследование включало в себя данные 42466 человек из 17 когорт в десяти странах и длилось 16 лет. Все участники не имели серьезных хронических заболевания и не принимали дополнительно омега-3 комплексы. Всем испытуемым измерили уровень омега-3-полиненасыщенных жирных кислот в крови. Конечной точкой в исследовании была смерть от любой причины, но также отдельно выделялась смерть от сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Ученые произвели поправку на влияние пола, возраста, расы, образования, гражданского статуса и образа жизни. Использовалась регрессионная модель пропорционального риска Кокса, а затем исследователи выполнили метаанализ для всех когорт.

37 процентов людей умерло за время исследования. Из них 30 процентов — от сердечно-сосудистых заболеваний, 30 процентов — от рака и 39 процентов — от остальных причин, в том числе насильственных. При высоком уровне эйкозапентаеновой, доказопентаеновой, докозагексаеновой кислот в крови риск смерти был на 15-18 процентов ниже, чем при низком уровне (p< 0,003). Сходные результаты для этих омега-3 кислот получили по смертности от сердечно-сосудистых и онкологических патологий (p<0,05 ). Альфа-линоленовая кислота не показала значимую ассоциации со смертностью.

 Авторы резюмировали, что высокий уровень в крови омега-3-полиненасыщенных жирных кислот, содержащихся в рыбе и морепродуктах, ассоциировался с меньшим риском смерти от всех причин. Это происходит за счет гипотензивного и антиагрегантного эффекта омега-3 жирных кислот, а также их позитивного влияния на эндотелий, адипоциты и липидный профиль.

Не обязательно в больших количествах есть рыбу и морепродукты, чтобы получать пользу от омега-3-жирных кислот, в этом также могут помочь лекарства. Прием препаратов с омега-3 кислотами приводит к статистически значимому снижению риска смерти, инфарктов и инсультов — в другом исследовании к такому выводу пришли американские ученые.

Для чего нужен метионин? Продукты, богатые метионином

Продукты богатые метионином

Это, главным образом: яйца, бразильские орехи, молоко и молочные продукты, рыба, морепродукты и мясо, которые богаты белковыми продуктами. 

Метионин важен для наращивания мышечной массы за счет увеличения выработки креатина, белка, который стимулирует гипертрофию и используется спортсменами для ускорения роста мышц.

Метионин является незаменимой аминокислотой, а это означает, что организм не может вырабатывать его в одиночку, поэтому его необходимо получать с пищей. В организме он играет важную роль, например, помогает укрепить иммунную систему и способствует выработке энергии. Сбалансированная диета с достаточным потреблением мяса, яиц, молока и злаков, таких как рис, достаточно, чтобы обеспечить организм ежедневным количеством метионина.

Для чего нужен метионин?

Метионин выполняет следующие функции в организме:

  • Стимулировать прирост мышечной массы, увеличивая выработку креатина;
  • Действуя как антиоксидант, предотвращая повреждение клеток и укрепляя иммунную систему;
  • Укрепляет иммунную систему, так как является антиоксидантом и уменьшает воспаление;
  • Предотвращает повторные инфекции мочевыводящих путей, помогая предотвратить размножение бактерий;
  • Способствует детоксикации организма, генерируя вещества, которые помогают устранить токсичные соединения, такие как, некоторые вещества лекарств.
  • Помогает облегчить симптомы артрита и ревматизма.

Эффект при чрезмерном употреблении метионина

Природный метионин в пищевых продуктах обычно не вызывает побочных эффектов, но необходимо соблюдать осторожность, при использования добавок этого вещества без медицинской консультации.

Избыток метионина может вызывать опасные побочные эффекты, такие как усиление роста опухолей и сердечные заболевания, такие как атеросклероз, особенно в случаях дефицита фолиевой кислоты, витамина В9 и витамина В12.

Вам также будет интересно почитать:

Диета Низкая в метионине 2021

Метионин — это незаменимая аминогруппа, которую организму необходимо вырабатывать креатин и способствовать нормальному метаболизму и росту. Медицинский центр Университета Питтсбурга требует от вашего тела от 800 мг до 1 000 мг в день для поддержания нормального здоровья. По состоянию на 2011 год не было терапевтической дозы для метиона. Несмотря на то, что в целом считается безопасным, исследование, опубликованное в выпуске «Journal of Nutritional Biochemistry» за 2007 год, показало, что диета с высоким содержанием метионина вызывала снижение массы тела и снижение липопротеинов высокой плотности у испытуемых грызунов.

Видео дня

Веганские диеты и метионин

Употребление в пищу продуктов с низким содержанием метионина, например, в веганском рационе бобовых, сои и орехов вместе с адекватным витамином B-12 добавление, помогает продлить срок службы у испытуемых грызунов, согласно исследованию, опубликованному в выпуске 2009 года «Медицинские гипотезы». «Придерживаясь вегетарианской диеты, вы должны тщательно регулировать потребление бобов и сои, включая достаточное количество фруктов. Однако, чтобы максимизировать преимущества низкой диеты с метионином, также требуются адекватные упражнения. Необходимы дополнительные исследования для дальнейшего понимания долгосрочных эффектов низкой диеты метионина на человека.

Длительный жизненный период

Постепенное снижение потребления метионинов с 0. 86% до 0. 17% увеличило продолжительность жизни испытуемых на крысах на 30%, согласно исследованию, опубликованному в 1993 выпуск журнала «Journal of Nutrition. «Тем не менее, исследование также показало, что низкий уровень метиониновой диеты нарушает рост, несмотря на увеличение потребления пищи. Дальнейшее исследование влияния диеты с низким содержанием метионина на продолжительность жизни и рост даст представление о его воздействии на людей

Продукты, которых следует избегать

Избегайте таких продуктов, как яйца, сыр, рыба трески и морские водоросли, потому что они высоко в метионине. Порошкообразные яичные белки содержат около 3 г метионина каждые 100 г, отмечает сайт DietAndFitnessToday. Содержание метионина в сыре, рыбе трески и водорослях составляет 1 г на каждые 100 г. Другие диетические источники метионина включают высокобелковые продукты, такие как домашняя птица, красное мясо и молочные продукты, отмечает Медицинский центр Университета Питтсбурга.

Уровни липопротеинов высокой плотности и гомоцистеина

Исследование, опубликованное в выпуске «Journal of Nutritional Biochemistry» за 2007 год, показало, что мыши на диете с высоким содержанием метионина потеряли более 20 процентов своего веса, но также более низкий уровень липопротеинов высокой плотности или уровень ЛПВП по сравнению с мышами на низких диетах метионина. Исследование подавало мышам диету с низким содержанием фолатов и дополняло метионином или фолиевой кислотой в их питьевой воде в течение примерно семи недель. Результаты показали, что уровни гомоцистеина натощак были выше у мышей, получавших диету с низким содержанием фолата, но с высоким содержанием метионина по сравнению с мышами, получавшими высокий уровень фолата и высокую диету метионина.Это говорит о том, что фолаты каким-то образом способны компенсировать эффекты, которые метионин оказывает на уровни гомоцистеина. Гомоцистеин — это аминокислота, которая ассоциируется с более высоким риском таких состояний, как сердечный приступ и инсульт. Необходимо провести дополнительные исследования, чтобы определить, как низкая диета метионина влияет на уровни ЛПВП и гомоцистеина у людей.

АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО НАЗНАЧЕНИЯ Текст научной статьи по специальности «Прочие сельскохозяйственные науки»

1

АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

НАЗНАЧЕНИЯ

Вопрос здорового образа жизни населения — один из самых актуальных для многих государств мира. Согласно данным экспертов Всемирной организации здравоохранения, здоровье нации на 52-55% определяют социально-экономические условия в стране, ежедневные привычки людей и качество их питания [1]. Несбалансированный рацион -тоже часть нездорового уклада жизни, и он наносит непоправимый ущерб организму. Дефицит основных питательных веществ может вызвать изменения в деятельности всех его систем, дисфункции и болезни внутренних органов, а в конечном итоге — вылиться в общенациональный рост заболеваемости раком, диабетом, сердечно-сосудистыми и респираторными патологиями. Для решения этой проблемы, которая приобрела поистине всемирный размах, ВОЗ разработала Глобальный план действий по профилактике неинфекционных заболеваний и борьбе с ними на 20132020 гг. Один из действующих рычагов его стратегии — рационализация питания за счет развития производства специализированных пищевых продуктов, употребление которых способствует повышению устойчивости организма к действию стрессоров [2]. Естественное происхождение пищи, поступающей на стол человека, ее экологическая чистота, содержание полноценного набора незаменимых компонентов и биологически активных веществ позволяет в короткие сроки и с высокой эффективностью скоррек-

«!»!» !

Екатерина Беспалова,

младший научный сотрудник лаборатории оборудования и технологий молочноконсервного производства Института мясомолочной промышленности НПЦ НАН Беларуси по продовольствию, аспирант; bespalova-kat@mail.ru

Инна Миклух,

старший научный сотрудник лаборатории оборудования и технологий молочноконсервного производства Института мясомолочной промышленности НПЦ НАН Беларуси по продовольствию, кандидат технических наук, доцент; inmiklukh@mail.ru

Аннотация. В статье приведены данные исследования аминокислотного состава новых молочных продуктов с повышенным и пониженным содержанием белка, а также сыворотки, обезжиренного молока и других сырьевых ингредиентов, на основе которых они создаются. Предложен способ производства диетических видов молочной продукции путем комплексной переработки исходного сырья с применением мембранных технологий разделения на фракции.

Ключевые слова: аминокислотный состав, функциональные молочные продукты, высокобелковые и низкобелковые продукты.

Для цитирования: Беспалова Е., Миклух И. Аминокислотный состав молочных продуктов функционального назначения //Наука и инновации. №11. С. 78-83. https://doi.org/10.29235/1818-9857-2020-11-78-83

тировать дисбаланс в работе организма, вызванный большими физическими, нервно-эмоциональными нагрузками.

Все развитые страны ориентированы на увеличение объемов выпуска функциональных продуктов и разработку их новых видов. Ассортимент постоянно совершенствуется за счет включения в их состав разнообразных полезных ингредиентов, к которым относятся пробиотическая микрофлора, пищевые волокна, витамины, минеральные комплексы, антиоксиданты и др. [3]. Такие виды продуктов производятся в различных отраслях пищевой промышленности: хлебобулочной и кондитерской, молочной, масложиро-вой, используются в рецептах приготовления безалкогольных напитков. На рынке здоровых и диетических молочных продуктов выделяются отдельные направления: со сниженной долей сахара или совсем

без него, с пищевыми волокнами, с пробиотическими свойствами, безлактозные, с регулируемым белковым составом.

В рационе населения нашей страны ощутим дефицит полноценных белков, которые играют важнейшую роль в рациональном питании человека. Недостаток этих веществ ведет к снижению устойчивости организма к инфекциям, обострению течения воспалительных процессов, неблагоприятно воздействует на деятельность сердечно-сосудистой, дыхательной и других систем организма. У человека, недополучающего белок, ухудшается аппетит, что, в свою очередь, приводит к еще большему ограничению его поступления с пищей. Белковые аминокислоты — это строительный материал для мышц, необходимый также и для замещения мышечных протеинов, которые расщепляются после травм, тренировок или других нагрузок, что особенно актуально для людей,

активно занимающихся спортом и занятых физическим трудом. Кроме того, аминокислоты с разветвленной цепью (лейцин, изолейцин, валин) участвуют в энергетических процессах, происходящих в организме, и, обладая определенными анаболическими свойствами, ускоряют образование энергии для мышечных сокращений [4].

Вместе с тем существует категория лиц, вынужденных ограничивать потребление молочного белка: при нарушениях работы почек, печени, сердца, сосудов, сахарном диабете, некоторых видах артрита, онкологических новообразованиях, реакции иммунной системы на белок коровьего молока (аллергии на молоко), фенил-кетонурии и прочих состояниях, для которых характерна непереносимость аминокислот. Для этих людей жизненно необходимы продукты с низким содержанием белка, ассортимент которых в нашей стране

Молочное сырье

Ультрафильтрация

Концентрат

Фильтрат (пермеат)

Высокобелковые смеси

Низкобелковые

Рис. 1. Переработка молочного сырья на высоко- и низкобелковые продукты

представлен только импортными производителями.

Сотрудниками лаборатории оборудования и технологий молочноконсервного производства Института мясо-молочной промышленности разработаны технологии высокобелкового и низкобелкового продуктов, полученных в результате комплексной переработки молочного сырья. При этом уделено особое внимание подбору базового компонентного состава. Установлена необходимость применения молочной основы с изначально требуемым содержанием белка и последующим введением в систему дополнительных ингредиентов. Для получения основных составляющих применялось мембранное разделение молочного сырья на две диаметрально отличающиеся категории — концентрат белка и пермеат (рис. 1). Ультрафильтрация на основе диа-фильтрации обезжиренного молока и молочной сыворотки (в смеси или по раздельности)

позволяет извлекать растворимые сывороточные белковые и молочно-белковые концентраты (с содержанием белка от 35% до 85% в сухом веществе) и пермеат (от 2% до 4%). Эти компоненты использовались для дальнейшей переработки на конечный продукт с заданными физико-химическими показателями.

Для жидкого продукта с 6-12% протеина в составе допускается применение

12

в качестве основного компонента сухого сывороточного белкового концентрата (КСБ-УФ) с содержанием белка 55-80%, имеющегося в массовой продаже, с последующим восстановлением обезжиренным молоком как источником казеина.

При изготовлении низкобелковых смесей основным компонентом определен пермеат, характеризующийся достаточно высоким содержанием

треонин

лейцин фенилаланин +тирозин

Рис.

Название аминокислоты 2. Аминокислотный состав сырья

лактозы (более 80%). Присутствие в нем остаточных количеств белковых веществ и минеральных соединений придает ему дополнительные преимущества, заключающиеся в более выраженном молочном вкусо-ароматическом профиле (например, по сравнению с лактозой и даже с деминерализованной молочной сывороткой). В качестве жировой фракции в продукте применялись сливки молочные высокожирные, которые содержат низкий уровень протеина (в среднем 5%).

Для построения большинства белков организму требуются незаменимые аминокислоты, причем в определенном соотношении, которое должно быть максимально приближено к таковому в белках тела человека. Нарушение сбалансированности аминокислотного состава пищевых продуктов приводит к сбою процессов синтеза организмом собственных белков, сдвигая динамическое равновесие анаболизма и катаболизма в сторону преобладания их распада [5].

Поскольку изучение общего химического состава сырья позволяет только приблизи-

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Эталон КСБ-УФ I КМБ-УФ ОБМ Пермеат

треонин

леицин

фенилаланин +тирозин

Название аминокислоты Рис. 3. Аминокислотный скор сырья, %

тельно составить представление о биологической ценности продуктов, проведено исследование содержания в их составе незаменимых аминокислот, таких как треонин, валин, мети-онин и цистеин, изолейцин, лейцин, фенилаланин и тирозин, лизин, и аминокислотного скора (рис. 2, 3). Содержание метионина определялось в комплексе с цистеином, поскольку синтез последнего зависит от количества первого в организме. Фенилаланин превращается в тирозин, который используется в синтезе двух основных нейромедиаторов: допамина и норэпинефрина [6].

Установлено,что сывороточные белки содержат больше эссенциальных аминокислот, чем казеин (на 8,2 г/100 г белка). Индекс питательной ценности казеина составляет 0,8, в то время как у сывороточных белков он приближается к единице. В то же время в составе последних обнаруживается некоторый дефицит серосодержащих аминокислот. Поскольку казеин, напротив, имеет их в избытке, то необходимо дополнить высокобелковые продукты казеиновой составляющей. Определено, что концентрат сывороточного белка, обезжиренное

Наименование аминокислоты Апр АС, % Апр АС, %

г/100 г белка К г/100 г белка К

Треонин 6,30±0,8 3,2 157±20 0,54±0,12 3,9 135±30

Валин 5,60±0,6 2,9 112 ±12 0,58±0,13 4,2 116±26

Метионин+цистеин 2,00±0,4 1,0 56±11 0,14±0,03 1,0 40±9

Изолейцин 6,50±0,5 3,3 163±13 0,51 ±0,11 3,6 128±28

Лейцин 11,00±0,6 5,6 157±9 0,92±0,19 12,9 131±27

Фенилаланин+тирозин 8,20±0,4 4,2 137±7 0,65±0,1 4,4 108±17

Лизин 9,50±0,6 4,8 172±11 0,81±0,21 7,4 147±38

Суммарное содержание 49,00±1,2 — — 8,69±1,92 — —

Таблица 1. Аминокислотный состав и скор высоко- и низкобелковых продуктов

2

Наименование показателя № 1 № 2

Массовая доля сухих веществ, % 23,80±0,5 10,00±0,02

Массовая доля белка, % 12,20±0,5 0,36±0,02

Массовая доля золы, % 1,20±0,1 0,35±0,02

Массовая доля лактозы, % 7,60±0,4 7,54±0,06

Массовая доля жира, % 0,50±0,1 1,71±0,04

Таблица2. Физико-химические показатели продуктов с повышенным и пониженным содержанием белка

молоко и сливки содержат максимальное количество незаменимой аминокислоты, относящейся к одной из трех разветвленных кислот — лейцина (в количествах 11,2; 10,1; 8,2 г/100 г белка соответственно). В концентрате молочного белка максимальная доля суммы фенилаланина и тирозина равна 10,6 г/100 г белка. Пермеат богат аминокислотой лизином в количестве 5,3 г/100 г белка, которая присутствует в основном в животных протеинах и является дефицитной в растительных.

Для определения биологической ценности рассчитан аминокислотный скор молочных смесей по формуле 1. В качестве эталона определено количество аминокислот «идеального белка», принятого ФАО/ВОЗ:

А

АС = А2 • 100%,

(1)

где АС — аминокислотный скор, %; Апр — содержание аминокислоты испытуемого белка, г/100 г белка; Аэт — содержание этой же аминокислоты в эталоне, г/100 г белка.

Установлено, что аминокислотный скор концентрата сывороточного и молочного белков и сливок лимитирован по сумме серосодержащих ами-

нокислот метионина и цисте-ина (аминокислотные скоры 34,97% и 10% соответственно). В обезжиренном молоке аминокислотный скор составляет более 100% по всем аминокислотам, что свидетельствует об отсутствии лимитирующих биологическую ценность незаменимых аминокислот. Пер-меат же, напротив, лимитирован по всем аминокислотам: их содержание менее 100%, в большей мере по треонину (первая лимитирующая аминокислота).

С учетом полученных ранее результатов исследований, требуемого состава конечного продукта и функциональной значимости каждой фракции белка для потребителей, нуждающихся в высокобелковом питании, определена необходимость сбалансировать состав смесей по незаменимым аминокислотам путем регулирования количественного содержания всех компонентов. Для этого применены встроенные функции программных средств вычислительной техники. По результатам выработаны партии продуктов с повышенным (№1) и пониженным (№2) содержанием белка. Определены соотношения незаменимых аминокислот в их составах.

Аминокислотный скор рассчитали, приняв за единицу лимитирующую кислоту по формуле 2. Результаты представлены в табл. 1.

К =

А

А

(2)

где К — соотношение аминокислот, А — содержание аминокислоты в образце, г/100 г белка; Алим — содержание лимитирующей кислоты, г/100 г белка.

В результате проведенных исследований биологической ценности молочного сырья по величине аминокислотного скора установлено, что белковый состав обоих продуктов лимитирован по суммарному сочетанию незаменимых аминокислот метионин-цистеин. Установлено также, что введение казеина с обезжиренным молоком в продукт №1 позволило уменьшить лимитирование указанной выше кислоты на 65% по отношению к таковому в концентрате сывороточного белка. В готовом продукте наблюдалось увеличение соотношения аминокислот по сравнению с эталоном на 1,5-3,2 ед. Однако для установления соотношения, максимально близкого к эталону, возможно введение в продукт дополнительно незаменимых аминокислот при низком их содержании или регулирование диеты потребителя по этим компонентам.

Для низкобелкового продукта характерно наличие аминокислот в концентрации меньше 1,0 г/100 г белка, что делает возможным его потребление лицами, испытывающими проблемы с переносимостью белка либо его компонентов. По соотношению незаменимых аминокислот в сравнении с эта-

лоном установлено превышение на 2,5-4,6 ед. в продукте №2, кроме лимитирующей кислоты.

В подобранных рецептурах отсутствует соотношение аминокислот ниже 1,0, что исключает возможность распада собственных белков организма человека для восполнения баланса.

Определены физико-химические показатели продуктов (для продукта с пониженным содержанием белка приведены в пересчете на восстановленный до готового к употреблению) (табл. 2).

По результатам исследований определено содержание белка в продукте №1, которое составляет более 50% в сухом веществе, в продукте №2 — не более 4%.

Для придания продуктам устойчивой однородной консистенции без оседания белка для высокобелковых смесей и расслоений жировой фазы для низкобелковых в процессе хранения подобраны стабилизирующие и эмульгирующие агенты из числа разрешенных согласно ТР ТС 029/2012 «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств». Обладая высокой степенью гелеобразования, стабилизаторы способствуют понижению концентрации свободной влаги и показателя активности воды, что сопровождается снижением способности микроорганизмов к кислотообразова-нию и улучшением структурно-механических свойств. Уровень этих добавок в готовых продуктах просчитан в результате органолептических исследований путем проведения дегустаций и изучения реологических характеристик, измерения показателя вязкости ротаци-

онным вискозиметром компании ВгоокАеЫ. Для высокобелковых смесей определен стабилизатор каррагинан (Е 407) в концентрации 4 г/л готового продукта, для низкобелковых — камедь рожкового дерева (Е410) из расчета 1 г/л и эмульгатор моно- и дигли-цериды жирных кислот (Е471) в количестве 4 г/л. Приведенные концентрации позволяют получить конечную продукцию с заданными показателями.

Таким образом, итогом проведенных научных исследований стала разработка технологий производства функциональных молочных продуктов с повышенным и пониженным содержанием белка с применением мембранного разделения сырья. На основе определенного аминокислотного состава и скора концентрата сывороточного и молочного белка, обез-

у /

7

жиренного молока и молочных высокожирных сливок проведено сбалансирование компонентного состава готового продукта по данному показателю. Применение этой технологии на практике позволит обеспечить людей, нуждающихся в рациональном и диетическом питании, адаптированными молочными продуктами с выбором оптимального для них протеинового состава.

■ Summary. The article presents research data on the amino acid composition of new dairy products with a high and low protein content, as well as whey, skim milk and other raw ingredients on the basis of which they are created. A method for the production of dietetic types of dairy products by complex processing of raw materials using membrane technologies for separation into fractions is proposed.

■ Keywords: amino acid composition, functional dairy products, high-protein and low-protein products.

■ https://doi.org/10.29235/1818-9857-2020-11-78-83

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Доклады о состоянии здравоохранения, 2013-2015 гг. / Всемирная организация здравоохранения // http:// www.who.int.ru.

2. Потороко И.Ю. Научные и практические аспекты технологий продуктов питания функциональной направленности / И.Ю. Потороко, А.В. Паймулина, Д.Г. Ускова, И.В. Калинина // Вестник ЮУрГУ. Серия «Пищевые биотехнологии». 2018. Т. 6, №1. С. 49-59.

3. Грунская В.А. Творожные десертные продукты с функциональными свойствами и повышенной пищевой ценностью / В.А. Грунская, Д.С. Габриелян, Е.А. Кузина, К.А. Зайцев // Молочнохозяйственный вестник. №3. 2019. С. 88-100.

4. Технология продуктов спортивного питания: учеб. пособие / Э.С. Токаев [и др.]. — М., 2010.

5. Борисова О.О. Питание спортсменов. Зарубежный опыт и практические рекомендации. Учебно-методическое пособие. — М., 2007.

6. Мелещеня А.В. Мясные продукты специального назначения для спортсменов и людей, испытывающих повышенные физические нагрузки. / А.В. Мелещеня, О.В. Дымар, Т.А. Савельева [и др.]. Монография. 2011.

Статья поступила в редакцию 02.04.2020 г. http://innosfera.by/2020/11/functional_dairy_products

Вмешательства при передозировке парацетамола (ацетаминофена)

Вопрос обзора: в этом обзоре мы рассмотрели доказательства в отношении вмешательств (видов лечения), используемых при отравлении людей парацетамолом (ацетаминофеном). В основном, мы попытались оценить влияние этих вмешательств на число смертей и необходимость трансплантации печени.

Актуальность: парацетамол является одним из самых распространённых лекарств, принимаемых сверх предписанной дозы. Преднамеренное или случайное отравление парацетамолом является частой причиной поражения печени.

Дата поиска: доказательства актуальны на январь 2017 года.

Характеристика исследований: рандомизированные клинические испытания (исследования, в которых людей в случайном порядке распределяют в одну из двух или более групп лечения), в которых участники обратились за медицинской помощью по причине того, что приняли чрезмерную дозу парацетамола, преднамеренно или случайно, независимо от количества принятого парацетамола, возраста, пола или других медицинских состояний пациента.

Существует множество различных вмешательств, которые могут быть использованы для лечения людей с отравлением парацетамолом. Эти вмешательства направлены на уменьшение абсорбции [всасывания] парацетамола в пищеварительном тракте и, следовательно, уменьшение количества парацетамола, которое попадает в кровоток. Эти средства включают активированный уголь (который связывает парацетамол в желудке), промывание желудка (для удаления из желудка как можно большего количества парацетамола) или ипекакуана (сироп, который при приеме внутрь вызывает рвоту (тошноту)). После всасывания парацетамол через кровоток попадает в печень, где большая его часть распадается на безопасные составляющие. Однако, небольшая часть этого лекарства превращается в токсичный продукт, с которым печень обычно может справиться, но приём большого количества парацетамола является для печени избыточным. Вследствие этого токсичный продукт может повредить печень и привести к печёночной недостаточности, к почечной недостаточности, а в некоторых случаях к смерти. Другие вмешательства для лечения отравления парацетамолом включают лекарства (антидоты), которые могут уменьшить количество токсичных продуктов (например, лекарственное средство циметидин) или расщепить токсичные продукты (включают такие лекарственные средства, как метионин, цистеамин, димеркапрол или ацетилцистеин). Наконец, могут быть предприняты попытки удалить парацетамол и его токсичные продукты из кровотока при помощи специального оборудования для очистки крови. Все эти виды лечения были изучены.

Мы нашли 11 рандомизированных клинических испытаний с участием 700 человек. В большинстве этих испытаний рассматривали различные виды лечения.

Основные результаты: активированный уголь, промывание желудка и ипекакуана могут уменьшить всасывание парацетамола при условии их применения в течение одного-двух часов после приёма парацетамола, но клиническая польза неясна. Активированный уголь, возможно, является лучшим выбором, если человек может его принять. Иногда люди не могут принять внутрь активированный уголь по причине сонливости или потому что не нравится вкус, структура (либо оба этих фактора).

Из видов лечения, направленных на удаление токсичных продуктов парацетамола, ацетилцистеин, вероятно, может уменьшить частоту поражения печени от отравления парацетамолом. Кроме того, он имеет меньше побочных эффектов, чем другие антидоты, такие как димеркапрол и цистеамин; его преимущество над метионином было неясным. Ацетилцистеин следует назначать людям с отравлением парацетамолом при риске повреждения печени, риск зависит от принятой дозы, времени приёма пищи и данных лабораторных исследований.

В наиболее поздних клинических испытаниях рассматривали способы снижения частоты побочных эффектов с помощью внутривенного (через вену) введения ацетилцистеина, изменив способ введения. Эти клинические испытания показали, что при использовании более медленной инфузии и низкой начальной дозы ацетилцистеина может быть уменьшена доля таких побочных эффектов, как тошнота, рвота, а также аллергия (нежелательные реакции организма на лекарство, такие как сыпь).

Качество доказательств: этот обзор вмешательств при отравлении парацетамолом обнаружил удивительно небольшое число опубликованных рандомизированных клинических испытаний для этого достаточно распространённого состояния. Кроме того, в большинстве испытаний было мало участников и во всех испытаниях был высокий риск смещения. Соответственно, качество доказательств следует рассматривать как низкое или очень низкое.

Добавление метионина в соевые продукты: влияние на параметры азотного баланса

Соевый белок — один из продуктов самого высокого качества. Вклад сои в питание человека увеличивается благодаря ее положительному питательному профилю, низкой стоимости, высокому содержанию белка и отличным функциональным свойствам. Добавление метионина в рационы соевых бобов крыс улучшает биологическую ценность соевого белка. Было проведено несколько исследований по обогащению соевого белка метионином на младенцах, но обычно обнаруживается обогащение детских смесей этой аминокислотой.Это исследование было проведено, чтобы продемонстрировать на истощенных детях влияние добавления метионина к соевому молоку и изолированному соевому белку, а также для сравнения их результатов с коровьим молоком. Было обследовано 30 детей с недостаточным питанием в возрасте от 1 до 3 лет, поступивших в наше метаболическое отделение и разделенных на группы по 6 детей. Их кормили экспериментальными смесями с коровьим молоком, соевым молоком, соевым молоком плюс метионин, изолированной соей и изолированной соей плюс метионин. Состав питательных веществ в смесях был рассчитан так, чтобы быть похожим на материнское молоко.DL-метионин, 1,5 г на 100 г белка, добавляли к соевому молоку и изолированным смесям сои. Были выполнены два азотных баланса по 3 дня каждый. Фекальный и мочевой азот, сывороточные белки, креатинин и мочевина в сыворотке и моче отслеживались во время исследования. Результаты показали различия в потреблении и удержании азота между некоторыми группами, но не было статистически значимых различий в абсорбции белка в группах. Не было продемонстрировано различий в сывороточных белках, общем азоте и других проанализированных параметрах сыворотки и мочи.Дети, которых кормили коровьим молоком, показали самую высокую задержку азота в обоих исследованиях баланса. Добавление метионина в смесь соевого молока увеличивало удержание азота, не достигая уровня коровьего молока, и не имело такого же эффекта при добавлении к изоляту соевого белка.

Биотехнологические применения S-аденозилметионин-зависимых метилтрансфераз для биосинтеза и разнообразия натуральных продуктов | Биоресурсы и биопроцессинг

Определение желаемой активности метилтрансферазы

Биосинтез малых молекул в гетерологичных хозяевах с помощью метаболической инженерии и синтетической биологии получил значительное развитие (Cravens et al.2019; Chen et al. 2019b; Ян и др. 2020). Одним из важных предварительных условий является определение пути биосинтеза и определение ферментов для производства желаемого натурального продукта. В основном широко используется обнаружение генов у местных хозяев, особенно с развитием секвенирования генома, модификации генома и биоинформатики (Katz and Baltz, 2016) (рис. 1a). Этот метод обычно требует доступа к естественным хозяевам, а также выполнения секвенирования генома и профилирования метаболитов (Katz and Baltz 2016).Другой метод заключается в использовании беспорядочных ферментов, которые катализируют структурно похожие субстраты для выполнения желаемой биотрансформации (Lin et al., 2019; Huffman et al., 2019) (рис. 1b). Он опирается на существующие знания об идентифицированных природных ферментах и ​​расширяет объем субстратов для природных ферментов (Li et al. 2020). В этом разделе мы рассмотрим недавнее открытие новых метилтрансфераз и применение беспорядочных метилтрансфераз для биосинтеза натуральных продуктов (Таблица 1).

Фиг.1

Иллюстрации методов определения желаемой активности метилтрансфераз. a Геномные и химические методы скрининга используются для идентификации новых метилтрансфераз из природных микробных организмов-хозяев. Сначала проводится секвенирование генома для получения генетической информации. Во-вторых, инструменты in silico используются для идентификации предполагаемого гена метилтрансферазы. Для биосинтеза натуральных продуктов такие метилтрансферазы часто обнаруживаются в кластере биосинтетических генов в микробных организмах-хозяевах.В-третьих, конструируются мутантные штаммы с нокаутом (KO) или нокаутом (KI) для удаления или сверхэкспрессии предполагаемого гена метилтрансферазы, соответственно. Наконец, затем проводят химический скрининг для определения неметилированных промежуточных продуктов или продуктов с повышенным содержанием метилиров из этих мутантных штаммов по сравнению со штаммом дикого типа (WT). Некоторые иллюстрации были созданы с помощью BioRender.com. b Беспорядочные метилтрансферазы используются для катализирования структурно подобных субстратов для достижения желаемой реакции метилирования.Трехмерная модель представляет собой кофеин-О-метилтрансферазу из Homo sapiens (PDB: 3BWY). Связанный SAH показан зеленым цветом.

Таблица 1 Сводка недавно обнаруженных метилтрансфераз
Открытие новых метилтрансфераз у местных хозяев

На основании нашего обзора недавней литературы, большинство описанных новых метилтрансфераз были обнаружены у микробов и находятся в кластеры биосинтетических генов (Chavali, Rhee, 2017; Soldatou et al., 2019) (Таблица 1).Таким образом, мы в основном сосредоточимся на новых метилтрансферазах, обнаруженных в микроорганизмах. Для выяснения функций генов метилтрансфераз обычно используется геномный и химический скрининг. В общем, ген метилтрансферазы нарушен в нативном микробном хозяине, и профили метаболитов между диким типом и мутантным штаммом будут сравниваться для идентификации накопленных промежуточных продуктов с помощью точного анализа массы (рис. 1а). Используя эту стратегию, Mo et al. (2017) идентифицировали карбоксилат-O-метилтрансферазу (NcmP) из Saccharothrix syringae NRRL B-16468 , которая метилирует нокамицин E с образованием нокамицина I, мощной молекулы антибиотика (рис.2а). Авторы предположили, что нокамицин II, структурно подобный нокамицину I, также был образован под действием NcmP. В другом исследовании геномное и химическое профилирование выявило новую двухкомпонентную систему циклопропаназы для синтеза антибиотика CC1065 из Shewanella woodyi ATCC 51908 (Jin et al. 2018). Система циклопропаназы включает C10P, радикальный фермент SAM, и C10Q, бифункциональную метилазу и циклазу (Wu et al., 2017; Jin et al., 2018). Удалив C10P или C10Q , мутантный штамм не смог продуцировать антибиотик CC1065.Эксперименты по маркировке показали, что C10P генерирует метиленовый радикал SAM и образует ковалентный аддукт SAM-субстрат, который биотрансформируется с помощью C10Q в циклопропановый фрагмент (рис. 2b). Фрагмент циклопропана является сложной задачей для химиков-синтетиков и часто присутствует в клинических лекарствах (Jin et al. 2018). Таким образом, открытие или конструирование ферментов, образующих циклопропан, может обеспечить альтернативные пути синтеза для фармацевтического применения. В другом исследовании Конг и соавторы выяснили функции трех метилтрансфераз (XanM1-3) в поликетидном соединении, ксантонах, биосинтетическом кластере из Streptomyces flavogriseus (рис.2в). Однако, когда XanM1 был удален, ни продукт, ни промежуточное соединение не были обнаружены, что позволило авторам предположить, что XanM1 катализирует промежуточное соединение, которое, возможно, все еще связано с белком-носителем ацила поликетидного комплекса. Интересно, что очищенный XanM1 способен метилировать субстраты XanM2 и XanM3, и три метилтрансферазы обладают незначительной перекрывающейся активностью метилирования по отношению к нескольким промежуточным продуктам на пути ксантолипина (Kong et al. 2020). Это привело авт. К идентификации общего предка для трех метилтрансфераз и постулировало, что XanM1-3 эволюционировали посредством дупликации генов.Как показано на рис. 2, многие природные продукты и промежуточные продукты имеют сложную химическую структуру, поэтому они могут быть недоступны на рынке. Выделение этих соединений из мутантных штаммов необходимо для подтверждения функции фермента метилтрансферазы. В недавней работе Li et al. (2018) промежуточные соединения пути биосинтеза гентамицина С были выделены из мутантных штаммов Micromonospora echinospora для исследования функции сложной сети метилтрансфераз (рис.2г) . Помимо профилирования метаболитов штаммов с делецией метилтрансферазы, автор сверхэкспрессирует индивидуальную метилтрансферазу ( genN , genD1 и genK ) в M. echinospora с удаленным биосинтетическим кластером гентамицина. Затем выделенные промежуточные продукты пути добавляли отдельно в культуральную среду штамма, сверхэкспрессирующего каждый из генов метилтрансферазы, для идентификации метилированного продукта. С помощью этого подхода Ли и его коллеги предоставили убедительные доказательства того, что эти метилтрансферазы проявляют сильную селективность в отношении сайта метилирования, но легко принимают несколько аналогичных промежуточных продуктов пути.Неожиданно авт. Также обнаружили N-метилтрансферазу ( GenL ), которая катализирует существенную последнюю стадию 6′-N-метилирования, которая не кластеризуется вместе с др. Тремя MTs в геноме (Fig. 2d). Несмотря на то, что GenL активен для превращения гентамицина C1a и C2 в C2b и C1, соответственно, вопрос о первичной функции GenL остается открытым.

Рис. 2

Реакции недавно открытых новых метилтрансфераз. Эти ферменты в основном обнаруживаются посредством геномного и химического скрининга (таблица 1). a Метилирование нокамицина E NcmP с образованием нокамицина I. Показана структура нокамицина II. b Новая система циклопропаназы, опосредованная радикалами SAM, для продуцирования антибиотика CC1065. c Сеть метилтрансфераз, участвующих в биосинтезе ксантолипина. d Сеть метилтрансфераз, участвующих в биосинтезе гентамицина С. Исходным соединением является 3-дегидро-3-оксогентамицин А2 (DAA2)

Все предыдущие примеры открытия метилтрансфераз начинались с анализа генома и идентификации кластера биосинтетических генов (Таблица 1).Прогнозированию кластера биосинтетических генов природных продуктов в значительной степени способствовало развитие инструментов прогнозирования in silico (Medema et al. 2011; Chavali and Rhee 2017; Soldatou et al. 2019). Duell et al. (2019) применили antiSMASH и ClusterFinder, чтобы найти кластеры биосинтетических генов содорифена в Serratia plymuthica WS3236 (Medema et al.2011; Cimermancic et al.2014) . Содорифен синтезируется из фарнезилпирофосфата (FPP) бифункциональной метилтрансферазой и циклазой (SodC) и терпенциклазой (SodD) (Reuss et al.2018; Duell et al. 2019) (рис. 3а). Ферментативная активность была подтверждена сверхэкспрессией генов SodC и SodD в Escherichia coli с повышенным количеством FPP и прямым анализом образующихся продуктов (Duell et al., 2019). В другом исследовании Drummond et al. (2019) использовали геранилпирофосфат (GPP) метилтрансферазу из Streptomyces coelicolor в качестве запроса к BLAST-поиску природных вариантов у бактерий и идентифицировали IPP-метилтрансферазу (IPPMT) из Streptomyces monomycini (рис.3а). Примечательно, что нативный хозяин не производит никаких метилированных терпеноидных соединений. В таком случае предыдущий метод нокаута гена и промежуточной идентификации не сможет проверить функцию гена. Чтобы обойти это, кластер биосинтетических генов может быть сверхэкспрессирован у родственных видов с низким или нулевым продуцированием вторичных метаболитов и провести скрининг продуктов, образованных дополнительными генами (Ahmed et al. 2020) (Fig. 1a). Например, Awakawa et al. (2014) сверхэкспрессировали индоловый алкалоид, телеоцидин B, биосинтетический путь, из Streptomyces mediocidicus, в Streptomyces lividans TK21 , который не продуцирует телеоцидин B . Это привело авт. К открытию бифункциональной метилтрансферазы и циклазы, TleD, которая может метилировать и циклизовать терпеновую составляющую телеоцидина B (Yu et al. 2016) (Fig. 3b).

Рис. 3

Реакции недавно открытых новых метилтрансфераз. Для обнаружения этих ферментов использовались инструменты in silico (таблица 1). a Метилтрансферазные реакции, которые модифицируют предшественники терпеноидов. IPP, изопентенилпирофосфат; GPP, геранилпирофосфат; FPP, фарнезилпирофосфат. b Бифункциональная метилтрансфераза и циклаза, участвующие в биосинтезе телеоцидина

Такое открытие новых метилтрансфераз, которые модифицируют сложные вторичные метаболиты, продолжает расширять наш набор инструментов для биокатализаторов для биосинтеза более разнообразных природных продуктов. Большинство метилтрансфераз обладают беспорядочной активностью, которая потенциально может применяться для принятия новых субстратов, расширяя биокаталитическое разнообразие.

Применение беспорядочных метилтрансфераз

Беспорядочные метилтрансферазы можно применять для принятия аналогичных, но неместных субстратов для получения желаемых метилированных продуктов (рис.1б). Путь de novo может быть разработан с использованием беспорядочных ферментов для биосинтеза соединений, пути которых неизвестны (Lin et al.2019; Li et al.2020). Одной из таких важных беспорядочных метилтрансфераз является O-метилтрансфераза кофейной кислоты (COMT). Беспорядочные связи COMT из Homo sapiens (Hs.COMT) были способны выполнять ключевую реакцию 4-O-метилирования в пути биосинтеза ванилина (Kunjapur et al., 2016; Chen et al., 2017). Chen et al. (2017) продемонстрировали, что Hs.COMT метилирует альтернативный субстрат 3,4-дигидроксибензиловый спирт (3,4-DDBA) с разумной эффективностью и производит ~ 500 мг / л ванилилового спирта путем биотрансформации целых клеток (рис.4а). 3,4-DDBA является субстратом меньшего размера по сравнению с кофейной кислотой, и, следовательно, вполне возможно, что связывающий карман Hs.COMT может принимать 3,4-DDBA, хотя сродство связывания не является сильным ( K m = 0,52 мМ) (Chen et al.2017). Интересно, что активный сайт COMT может вместить более крупные субстраты. Heo et al. (2017) идентифицировали такой COMT из Arabidopsis thaliana (At.COMT), чтобы связывать ресвератрол ( K m = 44,9 мкМ) с эквивалентным сродством, как у кофейной кислоты ( K m = 40.5 мкМ) (рис. 4а). С помощью At.COMT авторы установили путь de novo для производства ~ 33 мг / л диметилированного ресвератрола, птеростильбена, в Escherichia coli ( E. coli ). Накапливался монометилированный ресвератрол, пиностильбен, что указывает на необходимость дальнейшей оптимизации активности At.COMT.

Рис. 4

Реакции беспорядочных метилтрансфераз для образования малых молекул. a Кофеат-O-метилтрансферазы (COMT) легко принимают структурно подобные соединения, такие как кофеат, 3,4-дигидроксибензиловый спирт (3,4-DDBA) и ресвератрол. b О-метилтрансфераза ювенильного гормона кислота (JHAMT) может метилировать C12 – C16 жирные кислоты. См. Таблицу 1 для получения дополнительной информации о ферментах.

Метиловый эфир жирных кислот (FAME) — это возобновляемое, биоразлагаемое и экологически чистое биотопливо. Однако токсичный метанол используется для химического превращения жирной кислоты в FAME. Юнус и др. (2020) использовали кислотную O-метилтрансферазу ювенильного гормона из Drosophila melanogaster (DmJHAMT) и разработали путь биосинтеза без метанола для получения FAME (рис.4б). DmJHAMT является ключевым регуляторным ферментом метаморфоза насекомых и демонстрирует широкий спектр субстратов от жирных кислот C12 до C16 (Shinoda and Itoyama 2003; Sherkhanov et al. 2016). Путем слияния DmJHAMT ниже сильного промотора и увеличения внутриклеточной концентрации SAM> 95% лауриновой кислоты было преобразовано в метиллаурат (Yunus et al. 2020). Эта стратегия биотрансформации обещает заменить токсичный химический процесс. Несмотря на то, что был достигнут высокий выход конверсии, DmJHAMT по-прежнему остается одним из основных ограничивающих факторов, требующих дальнейшей оптимизации.

Инженерия беспорядочных ферментов требуется для повышения их специфичности и активности по отношению к желаемым субстратам, и часто используются стратегии ферментной инженерии, такие как структурно-управляемый мутагенез (Chen et al. 2019a; Chen and Arnold 2020; Li et al.2020). Более того, высокопроизводительные анализы метилтрансферазы значительно улучшат скорость выявления полезных мутантов, которые будут обсуждаться в следующем разделе.

Разработка активности метилтрансферазы

Для выявления полезных мутаций по астрономическим размерам белковых последовательностей компьютерный структурный анализ может дать понимание и направить рациональные конструкции мутантов.Например, для повышения активности бергаптол-O-метилтрансферазы (BMT) Zhao et al. определили кристаллическую структуру BMT из Peucedanum praeruptorum (Pp.BMT) и рационально сконструировали 14 одиночных мутантов, выбрав низкие энергии мутаций, рассчитанные с помощью Discovery Studio 4.1 (Zhao et al.2020). Один из мутантов, V320I, увеличивал ферментативную активность более чем в восемь раз. Когда кристаллическая структура недоступна, модели гомологии строятся на основе подобия последовательностей. Игнеа и его коллеги сконструировали модель гомологии для метилтрансферазы GPP из Pseudanabaena limnetica (Pl.GPPMT) и сконструировал 44 мутанта (Ignea et al. 2018). Среди них две одиночные замены, V250A и F226H, улучшили продукцию терпеноидов C11 в два и три раза соответственно (рис. 3a). Несмотря на то, что компьютерный дизайн ферментов значительно продвинулся вперед, это все еще ресурсоемкий процесс для компьютерного скрининга только части (10 5 –10 6 ) пространства белковых последовательностей (Wu et al. 2019). Часто in silico метод сочетается с надежным и чувствительным высокопроизводительным скрининговым анализом (HTS) для ускорения процесса разработки.В этом разделе мы суммируем анализы HTS, разработанные для низкомолекулярных метилтрансфераз (таблица 2). Анализы ДНК или протеинметилтрансферазы были рассмотрены в предыдущих отчетах, хотя некоторые анализы также могут применяться для скрининга NPMT (Luo 2012; Li et al. 2017; Zhang et al. 2021).

Таблица 2 Сводка высокопроизводительных анализов на метилтрансферазу
Высокопроизводительный анализ in vitro

Большинство анализов метилтрансферазы предназначены для количественного определения побочного продукта, SAH.Для превращения SAH в хромогенные или флуоресцентные молекулы часто применяется реакция связанных ферментов (таблица 2). Преимущество такой конструкции состоит в том, что она устраняет любое ингибирование SAH метилтрансфераз. Обычно используются ферменты метионинового цикла. Например, нуклеозидаза SAH (mtn) и S -рибозилгомоцистеинлиаза (LuxS) легко превращают SAH в гомоцистеин, который содержит свободную тиольную группу. Реагент Эллмана (5,5′-дитиобис-2-нитробензойная кислота) применялся для количественного определения концентрации тиоловых групп и, следовательно, он используется для количественного определения концентрации гомоцистеина.Полученный желтый раствор имеет оптическую плотность при 412 нм, которая линейно увеличивается с увеличением концентрации SAH (Hendricks et al. 2004; Biastoff et al. 2006). Сходным образом активируемая тиолом флуоресцентная репортерная молекула, флуоресцеин-цистамин-метиловый красный (FL-S-S-MR), была синтезирована для количественного определения концентрации гомоцистеина (Wang et al. 2005). Однако следует отметить, что эти анализы чувствительны к присутствию восстанавливающих агентов, таких как дитиотреитол (DTT) или остатков цистеина, присутствующих в ферментах, что приводит к высоким фоновым показаниям.Таким образом, эти анализы в основном применяются для характеристики очищенных метилтрансфераз. Другой компонент SAH — аденин азотистого основания. Когда аденин дезаминируется адениндезаминазой до гипоксантина, наблюдается уменьшение УФ-поглощения при 265 нм. Изменение оптической плотности при 265 нм видно уже при 10 мкМ аденина (Dorgan et al. 2006). Фактически, когда SAH дезаминируется дезаминазой TM0936 с образованием S -инозилгомоцистеина (SIH), наблюдается заметное падение поглощения при 263 нм, что снижает количество дополнительных ферментов, необходимых для преобразования SAH в хромогенный субстрат (Burgos et al.2017). Уменьшение поглощения при 263 нм можно отслеживать непрерывно. Анализ применялся для обнаружения и характеристики активности глицин-N-метилтрансферазы в экстрактах печени крыс, и наименьшая обнаруженная активность составила 2 мкМ / ч. Чтобы улучшить чувствительность анализа и избежать вывода на основе биомолекул, поглощающая способность которых составляет около 260–280 нм, в исследовании был разработан другой анализ, основанный на флуоресценции, с использованием аналога SAM, 8-аза-SAM. Однако доступность этого аналога может препятствовать его использованию (Burgos et al.2017). Более того, аденин может быть преобразован в дигидроксиаденин с помощью ксантиноксидазы (XOD). Перекись водорода (H 2 O 2 ) образуется в ходе реакции и впоследствии используется пероксидазой хрена для окисления красного комплекса до флуоресцентной молекулы резоруфина (Akhtar et al. 2018). Анализ был коммерциализирован (Cayman Chemical # 700150), хотя активность XOD недостаточна и приводит к медленному канализации SAH на дигидроксиаденин (Burgos et al.2017). Все анализы были разработаны для характеристики очищенных метилтрансфераз.Чувствительность может быть значительно снижена при применении анализов к полуочищенным метилтрансферазам из-за присутствия мешающих веществ. Насколько нам известно, ни один из этих анализов не применялся для скрининга вариантов метилтрансферазы, поскольку пропускная способность может быть снижена, если требуется очистка фермента.

Высокопроизводительный анализ in vivo

Для увеличения пропускной способности предпочтительны анализы осветленного клеточного лизата или анализы in vivo. Луо и др. (2019) разработали связанный с ростом in vivo анализ метилтрансферазы, связывая биосинтез необходимого цистеина с побочным продуктом метилирования SAH (рис.5а). С помощью этого анализа можно за один раз провести скрининг 10 7 мутантов, что значительно повысит производительность. С помощью анализа, связанного с ростом, авторы успешно идентифицировали единственную мутацию (F214L) в фенилэтаноламин-N-метилтрансреазе (PNMT), которая в два раза улучшила активность PNMT в отношении неприродного субстрата октопамина. Более того, исследование показало, что анализ in vivo может применяться для оптимизации гетерологичного пути в E. coli , включающего метилирование. Одним из недостатков анализа является потенциально высокий уровень ложноположительных результатов, поскольку исследование показало, что SAM-зависимый cfa из E.coli вместо PNMT был улучшен в изолятах, не связанных с ростом. Более того, повышение скорости роста — это сложный и неспецифический признак, который может не иметь большого динамического диапазона (Lin et al., 2017). Недавно были усовершенствованы биосенсоры, позволяющие проводить высокопроизводительное измерение молекулы-мишени in vivo. Сообщалось о естественных рибопереключателях SAH, которые могут отличить SAH от SAM более чем в 1000 раз (Wang et al. 2008). Su et al. (2016) провели скрининг 58 РНК-рибопереключателей на наличие SAH и идентифицировали два многообещающих биосенсора (Nmo1-4 из Nitrococcus mobilis , Mpe1-5 из Methylibium petroleiphilum ) для количественной оценки концентрации SAH как in vitro, так и in vivo (рис.5б). Биосенсоры имеют динамический диапазон от наномолярной до микромолярной концентрации SAH, что хорошо фиксирует внутриклеточную концентрацию SAH (~ 1,3 мкМ). Исследование показало, что когда активность SAH нуклеозидазы (mtn) ингибировалась в E. coli BL21, биосенсор Nmo1-4 давал флуоресцентные сигналы, которые были прямо пропорциональны концентрации ингибиторов mtn, что означает, что биосенсор может оценивать концентрацию SAH. in vivo. Помимо РНК-аптамера, белки или факторы транскрипции, которые реагируют на небольшие молекулы, также используются в качестве биосенсоров для количественной оценки активности метилтрансферазы.Система MetJ-MetO, которая описана в следующем разделе, была разработана в S. cerevisiae для определения внутриклеточной концентрации SAM (Umeyama et al. 2013; Dong et al. 2021) (Fig. 5c). Другой пример — ванилатный биосенсор, который был оптимизирован для анализа активности O-метилтрансферазы в отношении продукции ванилата (рис. 5d). Он основан на естественной системе Caulobacter crescentus VanR-VanO и обеспечивает 14-кратный динамический диапазон (Meyer et al.2019; Kunjapur and Prather 2019).С помощью биосенсора автор проверил 16 вариантов естественной O-метилтрансферазы из бактериальных, грибковых и архейных источников и идентифицировал три новых O-метилтрансферазы, которые более активны, чем обычно используемые Hs.COMT. Эти биосенсоры представляют собой многообещающие биотехнологические инструменты, которые можно применять для эволюции метилтрансфераз с высокой пропускной способностью, что еще предстоит продемонстрировать, хотя одним важным предварительным условием является то, что субстрат метилтрансферазы должен быть поглощен клеткой. К сожалению, биосенсоры для конкретных продуктов не имеют универсального применения для исследования других НПМТ.Кроме того, оптимизация биосенсора, реагирующего на небольшие молекулы, требует значительных инженерных усилий. Для сравнения, обнаружение побочного продукта SAH может быть более применимо для измерения большинства активностей метилтрансферазы, хотя при этом не удастся количественно определить активность неметилирующей метилтрансферазы (Fage et al. 2015; Ohashi et al. 2017).

Рис. 5

Иллюстрации высокопроизводительных анализов метилтрансфераз in vivo. a Анализ связанной с ростом метилтрансферазы, где биосинтез незаменимой аминокислоты цистеина (Cys) связан с биосинтезом SAH.Концентрация SAH зависит от активности метилтрансферазы. Если присутствует активность метилтрансферазы, будет производиться Cys и будет происходить быстрый рост микробов. Если активность метилтрансферазы отсутствует, Cys не будет продуцироваться, и рост микробов не будет наблюдаться. b SAH биосенсор на основе рибопереключателя, который будет связываться с 3,5-дифтор-4-гидроксибензилиденимидазолиноном (DFHBI) в присутствии SAH и производить сигнал флуоресценции. c Система MetJ-MetO в качестве биосенсора для количественной оценки внутриклеточной концентрации SAM в S.cerevisiae. MetJ слит с активирующим доменом (AD). В присутствии SAM metJ будет связываться с metO, и AD активирует экспрессию нижестоящего репортерного белка. d Система VanR-VanO в качестве биосенсора для количественного определения концентрации ванилата. В отсутствие ванилата VanR связывается с VanO и блокирует транскрипцию. В присутствии ванилата VanR не сможет связываться с VanO, и транскрипция нижестоящего репортерного гена продолжится. Пожалуйста, обратитесь к Таблице 2 для получения дополнительной информации

Регенерация и диверсификация кофакторов

Помимо улучшения активности метилтрансферазы, рециклинг SAM является еще одним важным аспектом для биотехнологического применения метилтрансфераз; он устраняет ингибирование SAH, регенерирует нестабильный SAM и снижает затраты (Mordhorst and Andexer 2020; Popadić et al.2021 г.). Путь рециркуляции нативного SAM включает множество ферментативных реакций (рис. 6a). Одна из реакций включает сложные кофакторы, а именно метилтетрагидрофолат и витамин B12 (кобаламин), что затрудняет рециркуляцию SAM внеклеточно. В результате регенерация SAM in vivo может быть более жизнеспособной или экономичной для SAM-зависимого биосинтеза натуральных продуктов (Bennett et al.2017). В этом разделе обсуждаются последние достижения в регенерации SAM, как in vitro, так и in vivo. Наконец, мы выделим использование синтетических аналогов SAM для переноса альтернативных химических групп в диверсификацию натуральных продуктов.

Рис. 6

Кофакторы метилтрансферазной реакции. a Иллюстрация реакций регенерации SAM. b Иллюстрация аналогов ЗРК. c K i SAH и K m SAM для низкомолекулярных метилтрансфераз демонстрируют высокую корреляцию с коэффициентом Спирмена 0,86 (подробную информацию см. В Таблице 3). Сокращения следующие. SAM, S -аденозилметионин; SAH, S -аденозилгомоцистеин; Met, l-метионин; Hcy, гомоцистеин; SRH, S — (5-дезокси-d-рибос-5-ил) -1-гомоцистеин; THF, тетрагидрофолат; THPG, тетрагидроптероилтри-1-глутамат; h4C-THF, 5-метилтетрагидрофолат; h4C-THPG, 5-метилтетрагидроптероилтри-1-глутамат; SAE, S -аденозил-1-этионин; SAA, S -аллил-1-гомоцистеин; SAP, S -пропил-1-гомоцистеин; 1- t Мет, тетразол-1-метионин; 7dz АТФ, 7-деаза-АТФ; Pi, фосфат; PPi, пирофосфат; МТ, метилтрансфераза; HMT, галогенидметилтрансфераза; SAHH, SAH гидроксилаза; Mtn, нуклеозидаза SAH; LuxS, S -рибозилгомоцистеинлиаза; метионин-синтаза, зависимая от метионина, кобаламина (или виатамина B12); метионин-синтаза, независимая от метионина, кобаламина (или виатамина B12); BHMT, бетаин-гомоцистеин S-метилтрансфераза 1; BHMT2, S -метилметионин-гомоцистеин-S-метилтрансфераза; ADK, аденозинкиназа; PPK2-I / II, полифосфаткиназа; metK, S -аденозилметионинсинтаза

Повышение концентрации SAM

Чтобы разработать систему рециркуляции SAM in vitro, Popadic et al.систематически оптимизирована бициклическая система регенерации (рис. 6a): в одном цикле используются аденозинкиназа (ADK) и полифосфаткиназы (PPK2-I / II) для регенерации АТФ из аденозина, а в другом цикле используется бетаин-1-гомоцистеин S-метилтрансфераза (BHMT). ) для регенерации l-метионина (Met) из l-гомоцистеина (Hcy) и бетаина (Popadić et al. 2021). Система in vitro требует семи ферментативных этапов, которые сложно реализовать эффективно (Mordhorst and Andexer 2020). Недавно Liao и Seebeck (2019) использовали обратимую галогенидметилтрансферазу (HMT) из Chloracidobacterium thermophilum для получения SAM из SAH и метилгалогенида (рис.6а), демонстрируя первый возможный метод прямого синтеза SAM из SAH in vitro. Система рециркуляции кофакторов успешно применялась для множественных реакций метилтрансфераз in vitro, обеспечивая конверсию> 90% с каталитическим количеством SAH. Однако требуется высокая концентрация галогенида метила, что создает угрозу безопасности. Прежде чем внедрять систему рециркуляции SAM / SAH в более крупном масштабе, необходимо изучить менее опасный донор метила.

Вместо in vitro часто используется регенерация SAM in vivo.В экспоненциально растущем штамме E. coli MG1655 концентрация SAM составила 0,4 мМ (Parveen and Cornell 2011). Для увеличения внутриклеточной концентрации SAM у гетерологичного хозяина применяли кормление l-метионином со сверхэкспрессией S -аденозилметионинсинтетазы (metK из E. coli или SAM2 из S. cerevisiae ) (Hu et al. 2012). ; Хан и др., 2016; Хео и др., 2017; Сюй и др., 2019; Лю и др., 2019). Чтобы сэкономить на стоимости производства, Liu et al.(2019) сконструировали промышленный штамм дрожжей, чтобы скрыть d-метионин в l-метионин, разрушая d-аминокислоту-N-ацетилтрансферазу (HPA3) и сверхэкспрессируя оксидазу d-аминокислот (DAAO) из Trigonopsis variabilis и l-фенилаланин. дегидрогеназа (l-PheDH) из Rhodococcus jostii . Таким образом, более дешевый рацемический dl-метионин может быть добавлен в среду и преобразован в SAM сверхэкспрессируемым ферментом SAM2. С генетическими модификациями для уменьшения деградации SAM 10,3 г / л SAM было успешно произведено сконструированным штаммом дрожжей в 10-литровом биореакторе с питанием 16 г / л dl-метионина.

Метаболизм SAM строго регулируется и подвергается ингибированию с помощью обратной связи в E. coli (Cress et al., 2017). Когда SAM накапливается, он связывается с репрессором metJ и транскрипционно репрессирует гены, ответственные за биосинтез SAM (Smith and Greene 1984). Чтобы улучшить продукцию O-метилированного антоциана в E. coli , Cress et al. (2017) заставили замолчать metJ с помощью CRISPRi-опосредованной дерегуляции. Стратегия эффективно увеличила продукцию O-метилированного антоциана в два раза, что указывает на то, что доступность SAM ограничивает активность O-метилтрансферазы в E.coli (Cress et al., 2017). Точно так же удаление metJ вместе с избыточной экспрессией генов пути биосинтеза метионина увеличивало концентрацию SAM и улучшало продукцию ванилина в E. coli на 33% (Kunjapur et al. 2016).

Применяя регулирование обратной связи SAM и системы metJ-metO, Umeyama et al. (2013) сконструировали генетическую цепь в S. cerevisiae для определения внутриклеточной концентрации SAM (рис. 5c). Авт. Слили metJ с доменом активатора транскрипции (AD) B42 и включили репортерный ген ниже метионинового оператора metO .В присутствии SAM комплекс SAM-metJ-B42 связывается с metO , и B42 активирует экспрессию нижележащего репортерного гена. Авторы продемонстрировали, что схема способна обнаруживать SAM с концентрацией всего 5 мкМ. С помощью этой генной цепи в качестве высокопроизводительного скрининга продукции SAM исследование показало, что избыточная экспрессия GAL11 может улучшить концентрацию SAM в 3,3 раза. Тот же метод скрининга был применен Dong et al. (2021 г.). Авторы разработали метод MAGIC (многофункциональный CRISPR для всего генома), который одновременно активирует и препятствует транскрипции и удаляет гены.Путем нескольких раундов трансформации библиотек направляющих РНК (размер> 10 6 ) в штамм дрожжей, чувствительных к SAM, авторы идентифицировали новые мишени, а именно: активация SNZ3, RFC4 и RPS18B увеличивала накопление SAM в 2,2 и 1,6 раза в лабораторные и промышленные штаммы дрожжей соответственно.

Снижение ингибирования SAH

Хотя увеличение доступности SAM улучшает активность метилтрансферазы, уменьшение побочного ингибирования SAH является еще одной эффективной стратегией (Dorgan et al.2006 г.). Сообщается, что SAH является мощным ингибитором многих метилтрансфераз; SAH связывается с некоторыми метилтрансферазами сильнее, чем SAM, и сообщаемое значение SAH K i может быть столь же низким, как субмикромолярный диапазон (таблица 3) (Petronikolou and Nair 2015). Накопление SAH in vivo токсично (Christopher et al. 2002; James et al. 2002). У некоторых микроорганизмов сложная регуляторная система была разработана для определения и предотвращения накопления SAH внутриклеточно. Например, рибопереключатель РНК был идентифицирован в Pseudomonas syringae перед ферментами пути деградации SAH (Wang et al.2008 г.). Рибопереключатель образует трехмерную структуру, которая скрывает или обнажает сайт инициации трансляции в отсутствие или в присутствии SAH, соответственно, таким образом эффективно поддерживая внутриклеточную концентрацию SAH ниже микромолярного диапазона. Подобные регуляторные элементы были идентифицированы у протеобактерий, актинобактерий и других. Такие рибопереключатели были модифицированы и использовались в качестве биосенсоров для мониторинга активности метилтрансферазы in vivo (Su et al., 2016).

Таблица 3 Краткое изложение K m, SAM и K i, SAH всех низкомолекулярных метилтрансфераз в BRENDA

Насколько нам известно, методы направленной ферментной инженерии для мутации метилтрансфераз и смягчения ингибирования SAH не дали результатов. были исследованы.В общем, SAH имеет тот же карман связывания, что и SAM, и, следовательно, SAH часто используется для сокристаллизации с метилтрансферазами, чтобы исследовать сайт связывания кофактора (Liscombe et al. 2012). Мутирующие остатки, взаимодействующие с SAH, неизменно влияют на аффинность связывания SAM. Это очевидно из линейной корреляции между K m SAM и K i значениями SAH с коэффициентом Спирмена 0,86 (рис. 6c и таблица 3). Более распространенной стратегией является коэкспрессия ферментов метионинового цикла, нуклеозидазы SAH (mtn) или гидролазы SAH (SAHH) для удаления SAH.Кунджапур и соавторы применили стратегию для увеличения производства ванилина в E. coli (Kunjapur et al., 2016). Интересно, что титр ванилина улучшался только при совместной экспрессии mtn и LuxS из E. coli , что указывает на то, что удаление SAH усиливает активность метилтрансферазы. Неожиданно, когда SAHH из S. cerevisiae коэкспрессировался, титр ванилина снижался. Неожиданный пагубный эффект сверхэкспрессии SAHH на титр ванилина, возможно, был связан с плохой экспрессией SAHH эукариотического происхождения.Можно проверить скрининг активности SAHH бактериального происхождения. Связывание деградации SAH с генерацией SAM будет идеальным для увеличения предложения кофакторов и снижения ингибирования обратной связи с метилтрансферазами. Оптимизация ферментативной активности в метиониновом цикле может быть полезной для максимального увеличения SAM и минимизации концентрации SAH.

Диверсификация за счет аналогов SAM

Универсальность метилтрансфераз привела к творческим применениям, таким как перенос более сложной части на биомолекулы, и в последние годы были разработаны аналоги SAM (Dalhoff et al.2006; Singh et al. 2014). Singh et al. (2014) провели скрининг пяти метионин аденозилтрансфераз (MAT) и определили, что человеческий MAT II может синтезировать 29 ненативных аналогов SAM из L, -аналогов метионина и АТФ. Путем сочетания MAT II с ребеккамицинметилтрансферазой (RebM) были получены дифференцированно алкилированные индолокарбазолы с заметными выходами (≥ 40%). Более того, расширяя область применения галогенидметилтрансферазы (HMT), Tang et al. (2021) мутировали HMT из Arabidopsis thalia , чтобы перенести этил-, пропил- и аллил-фрагменты на SAH и получить соответствующие аналоги SAM с высокой эффективностью (рис.6б). Недавно был обнаружен естественный путь биосинтеза аналога SAM, карбокси- S -аденозил-метионин (cxSAM); CmoA катализирует перенос карбоксильной группы от префената к метильной группе в SAM, производя cxSAM (Kim et al. 2013; Herbert et al. 2020) (Fig. 6b). Это открывает возможность генерировать разнообразные карбоксиметилированные продукты как in vitro, так и in vivo. Одно предостережение заключается в том, что карбоксиметилирование является чрезвычайно редкой реакцией в природе, и метилтрансферазы дикого типа не могут легко принять cxSAM в качестве кофактора.Было обнаружено, что CmoA работает в тандеме с тРНК-карбоксиметилтрансферазой (CmoB), которая проявляет в 500 раз более высокое сродство к cxSAM по сравнению с SAM (Herbert et al.2020). Тщательно исследуя связывающие сопутствующие факторы остатки из рентгеновской кристаллической структуры CmoB, Герберт и его коллеги идентифицировали ключевые остатки для мутации в катехол-O-метилтрансферазе (COMT) из Rattus norvegicus и коклаурин-N-метилтрансферазы. (CNMT) из Coptis japonica , чтобы сконструировать эти метилтрансферазы, чтобы они были более селективными с cxSAM, чем SAM (Herbert et al.2020). Путем сочетания этих сконструированных метилтрансфераз с CmoA были получены карбоксиметилированные продукты, а именно карбоксиметилированный катехол и карбоксиметилированный тетрагидроизохинолин, соответственно, с помощью COMT или CNMT.

Кроме того, некоторые аналоги SAM обладают улучшенной стабильностью по сравнению с SAM, который подвержен депуринизации, внутримолекулярной циклизации и эпимеризации сульфония. Чтобы стабилизировать SAM, Huber et al. (2016) синтезировали аналог SAM, 7dz Ado t Met, из 7dz ATP и l- t Met (рис.6б). Аналог демонстрирует исключительно высокую стабильность при pH 8. Интересно, что пермиссивный карминомицин 4-OMT (DnrK) может использовать модифицированный аналог SAM с такой же эффективностью, как SAM, таким образом, потенциально 7dz Ado t Met может быть выгодной заменой в SAM-зависимой ферментативной реакции. Хотя аналоги SAM открывают большие перспективы для разнообразия натуральных продуктов, их синтез и регенерация по-прежнему представляют собой проблему для масштабных приложений.

Этикетирование метионина 35S | База знаний по поддержке приложений | Лабораторные продукты и услуги

наверх

Обзор


Метаболическое мечение клеток низкоэнергетическими бета-излучающими радиоизотопами, такими как 35 S-метионин и 35 S-метионин / цистеин часто используется для отслеживания биосинтеза, созревания и деградации белков in vivo .Мечение метионинсодержащих белков в клетках основывается на использовании культуральных сред, не содержащих метионин, с добавлением радиоактивно меченного источника 35S. Количественное определение и идентификация меченых белков обычно проводится путем разделения на двумерном SDS-PAGE геле и экспонирования на пленке (авторадиография) или фосфорного изображения (хотя возможны и другие методы обнаружения).

Внеклеточную трансляцию белка с использованием лизатов ретикулоцитов или экстрактов зародышей пшеницы также проводят с использованием 35 S-метионина.Бесклеточная трансляция обеспечивает быстрый способ быстрого получения небольших количеств меченого белка для использования в различных типах биохимических анализов.

Top

Что мне нужно для проведения этого анализа?


Анализ мечения клеток

  • 35 S-меченный метионин (см. Таблицу в следующем разделе)
  • Клетки
  • Культуральная среда, не содержащая метионина
  • PBS
  • Раствор ДНКазы / РНКазы
  • Раствор ДНКазы / РНКазы
  • Реагенты и оборудование для гель-электрофореза
  • Пленка для авторадиографии — см. Продукты и каталожные номера ниже (если не используется фосфоро-визуализатор)
  • Проявитель пленки или фосфоро-визуализатор (например, фосфоро-визуализатор Cyclone ™) в зависимости от случая
  • Рекомендуется: ловушка для угля (кат. .No. NEX033T)


Бесклеточная трансляция

  • 35 S-меченный метионин (см. Таблицу в следующем разделе)
  • Система бесклеточной трансляции (обычно с использованием лизата ретикулоцитов или экстракта зародышей пшеницы, такие как системы TNT® от Promega)
  • Матричная РНК (при использовании системы трансляции in vitro ) или ДНК (при использовании связанной системы транскрипции / трансляции in vitro )
  • Ингибитор рибонуклеазы (например, RNasin)
  • Рекомендуется: ловушка для угля (кат.№ NEX033T)

Top

Продукты и каталожные номера



Таблица выбора метионина

Радиоактивно меченные 35 S Метионин и 35 S Метионин / цистеиновые продукты
См. Инструкции по выбору в блок-схеме выше продукт для вашего анализа. Вы также можете посетить Какую форму мне выбрать? для дополнительной помощи в выборе подходящего товара.


Меры предосторожности при обращении с 35 S-меченными соединениями

  • Растворы, содержащие 35 S-меченые соединения, могут выделять летучие радиоактивные побочные продукты.В дополнение к обычным правилам безопасности при обращении с радиоактивными материалами, настоятельно рекомендуется открывать флакон с угольной ловушкой (Кат. № NEX033T).
  • Рекомендуется при инкубации клеток с 35 S метионином и цистеином, которые у вас есть. древесный уголь используется для улавливания летучих побочных продуктов. Активированный уголь доступен от множества поставщиков.


Усилители авторадиографии для пленочного или фосфорного изображения

  • Усилитель авторадиографии EN3HANCE® (кат.№ 6NE9701): используйте на гелях для наилучшего разрешения полосы.
  • ENLIGHTNING ™ Rapid Autoradiography Enhancer (Cat. No. 6NE9741): более безопасная альтернатива 6NE9701. Используйте на гелях.

Top

Краткий протокол


Маркировка клеток


Протокол

Top

Цитаты


Маркировка клеток

  1. Bizios, N. Эукариотическая маркировка клеток Methods Mol. Биол 112 , 49-52 (1999).Ссылка
  2. Gonnord, P. et al. Пальмитоилирование рецептора P2X7, АТФ-зависимого канала, контролирует его экспрессию и ассоциацию с липидными рафтами. FASEB J 23 , 795-805 (2009). Ссылка
  3. Колли Б.К., Костал Дж., Заборина О., Чакрабарти А. & Chang, K. Выделяемая Leishmania нуклеозиддифосфаткиназа предотвращает АТФ-опосредованный цитолиз макрофагов. Мол. Biochem. Паразитол 158 , 163-175 (2008). Ссылка
  4. Pollard, J.W.Изотопное мечение белков in vivo для электрофореза в полиакриламидном геле. Methods Mol. Биол 32 , 67-72 (1994). Link
  5. Takahashi, M. & Ono, Y. Импульсный анализ протеинкиназы C. Methods Mol. Биол 233 , 163-170 (2003). Ссылка


Бесклеточный перевод

  1. Kraichely, D.M. И Макдональд, П. Подтверждение дрожжевых двугибридных белковых взаимодействий с использованием раскрытия глутатион-S-трансферазы in vitro. Methods Mol. Биол 177 , 135-150 (2001). Ссылка
  2. Movahedzadeh, F., Rico, S.G. & Cox, R.A. Транскрипция и перевод in vitro. Methods Mol. Биол 235 , 247-255 (2003). Ссылка
  3. Wilson, C.M. & Bulleid, N.J. Исследование сворачивания и деградации мутантных белков, синтезируемых в полупроницаемых клетках. Methods Mol. Биол 232 , 295-312 (2003). Link

Top

Таможенные услуги в PerkinElmer


PerkinElmer предлагает индивидуальные радиохимические продукты, индивидуальное штрих-кодирование пластин и другие услуги.Если вас интересуют индивидуальные услуги, свяжитесь с нашими специалистами по индивидуальному заказу:

ON> POINT® Custom Services

Top

Метионин из Японии и Испании наносит вред промышленности США, сообщает USITC

Комиссия по международной торговле США (USITC) сегодня определила, что промышленность США серьезно пострадала из-за импорта метионина из Японии и Испании, который Министерство торговли США ) проданы в США по цене ниже справедливой.

Председатель Джейсон Э. Кернс, заместитель председателя Рэндольф Дж. Стайн и члены Комиссии Дэвид С. Йохансон, Ронда К. Шмидтлейн и Эми А. Карпель проголосовали «за».

В результате положительных решений Комиссии Commerce издаст постановления об антидемпинговых пошлинах на импорт этого продукта из Японии и Испании.

Комиссия также сделала вывод о критических обстоятельствах в отношении импорта этого продукта из Испании. В результате этот импорт не будет подлежать ретроактивным антидемпинговым пошлинам.

Публичный отчет Комиссии Метионин из Японии и Испании (инв. № 731-TA-1535-1536 (окончательный), публикация USITC 5230, сентябрь 2021 г.) будет содержать мнения Комиссии и информацию, полученную в ходе расследований.

Отчет будет доступен до 28 сентября 2021 г .; когда он доступен, он может быть доступен на веб-сайте USITC по адресу: http://pubapps.usitc.gov/applications/publogs/qry_publication_loglist.asp .


КОМИССИЯ ПО МЕЖДУНАРОДНОЙ ТОРГОВЛЕ СОЕДИНЕННЫХ ШТАТОВ
Вашингтон, округ Колумбия 20436

ОСОБЕННОСТИ

Метионин из Японии и Испании
№ расследования731-TA-1535-1536 (Финал)

Описание продукта: Метионин (органическая аминокислота) и гидроксианалог метионина (органическая кислота) в основном используются в кормах для животных и в аквакультуре.

Статус рассмотрения дела:

1. Тип расследования: Окончательное расследование антидемпинговых пошлин.
2. Заявитель: Novus International, Inc., Сент-Чарльз, Миссури.
3. Учреждение USITC Дата: среда, 29 июля 2020 г.
4. Дата слушания в USITC: вторник, 11 мая 2021 г.
5. Дата голосования USITC: вторник, 24 августа 2021 г.
6. Дата уведомления USITC для продажи: вторник, 7 сентября 2021 г.

Промышленность США в 2020 году:

1. Количество производителей в США: 2.
2. Расположение заводов производителей: Алабама, Арканзас и Техас.
3. Производственные и связанные с ними рабочие: [1]
4. Поставки производителей из США в США: 1
5. Видимое потребление в США: 1
6.Отношение подлежащего импорта к видимому потреблению в США: 1

Импорт в США в 2020 г .:

1. Предмет импорта: 126 млн. Долларов США.
2. Непредметный импорт: 13 миллионов долларов.
3. Основные источники импорта: Испания, Япония, Франция и Малайзия.


[1] Удерживается во избежание разглашения служебной информации компании.

Радикальный фермент S-аденозил-L-метионин и метилтрансфераза катализируют образование циклопропана в биосинтезе природных продуктов

Материалы и оборудование

Биохимические вещества и среды были приобретены у Sangon Biotech Shanghai Co., Ltd (Китай), органические растворители для подвижной фазы ВЭЖХ были от Sigma-Aldrich Co., Ltd или Merck Serono Co., Ltd. Химические реагенты, такие как SAH и CD 3 I, были от Sigma-Aldrich Co., Ltd и используется без дополнительной очистки. Наборы для экстракции ДНК из геля и экстракции плазмидной ДНК были получены от Shanghai Generay Biotech Co., Ltd. Рестрикционные ферменты были от Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. ДНК-маркер и вектор pMD19-T были от TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. ДНК-полимераза Taq. и ДНК-полимераза Phanta Max Super-Fidelity были от Vazyme Biotech Co., Ltd. Штамм-продуцент CC-1065 Streptomyces zelensis NRRL 11183 был получен из Американской службы сельскохозяйственных исследований (ARS). Escherichia coli DH5α компетентные клетки использовали для рутинного субклонирования и получения плазмид и выращивали в среде LB с соответствующими антибиотиками. Плазмиды вводили в Streptomyces посредством межродового конъюгального переноса с использованием E. coli S17-1. Векторы экспрессии белков были приобретены у Merck Serono Co., Ltd.Штаммы экспрессии белка E. coli BL21 (DE3) и E. coli Rosetta (DE3) также были получены от Merck Serono Co., Ltd. Ni-NTA для очистки белка был получен от Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. Фермент. Анализы проводили в анаэробном перчаточном боксе от Coy Laboratory Product Inc. Анализы ВЭЖХ выполняли либо на Agilent серии 1200, либо на Shimazu Prominence LC-20A. Характеристику белок-белкового взаимодействия проводили на Malvern MicroCal ITC200. HR-MS выполнялся на Bruker (UHR-TOF) maXis 4G или Agilent Q-TOF 6520A.

Анализ последовательности, синтез праймеров и секвенирование

Сравнение белков проводили методами BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Множественное выравнивание последовательностей выполняли с использованием Clustal Omega на веб-сайте (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Синтез праймеров проводили в Sangon Biotech Shanghai Co., Ltd (Китай) и GENEWIZ Inc. Секвенирование проводили в GENEWIZ Inc. и Shanghai Invitrogen Biotech Co., Ltd.

Эксперименты по делеции и комплементации генов

Для инактивации c10Q , а 1.Фрагмент ДНК 7 т.п.н. (амплифицированный с использованием c10Q -L-for и c10Q -L-rev в качестве праймеров), расщепленный Hin dIII / Xho I и фрагментом ДНК 1,9 т.п.н. (с использованием c10Q -R- for и c10Q -R-rev в качестве праймеров), расщепленные с помощью Xho I / Eco RI, были клонированы в термочувствительную плазмиду pKC1139 (с использованием сайтов Hin dIII / Eco RI) с получением рекомбинантных плазмида pTG1405. Затем конъюгацию использовали для введения pTG1405 из E.coli S17-1 в S. zelensis NRRL 11183. Устойчивые к апрамицину клоны подвергали скринингу при 30 ° C. Затем отбирали кандидатных экзонъюгантов для получения мутантов с одним кроссовером в жидкой среде TSB с апрамицином при 37 ° C. Мутанты с единичным кроссовером впоследствии выращивали в среде TSB без каких-либо антибиотиков в течение нескольких поколений. Ожидаемый мутант с двойным кроссовером S. zelensis TG1405 ( ∆c10Q ) был подтвержден с помощью ПЦР-анализа (с использованием праймеров c10Q -gt-For и c10Q -gt-Rev).

Для экспериментов по комплементации, чтобы ввести c10Q в S. zelensis TG1405, нужно использовать 0,9 kb c10Q -содержащий фрагмент ДНК Eco RI / Nde I (с использованием праймеров c10Q com-For и c10Q com-Rev) клонировали в pSET152 для конструирования плазмиды pTG1406, в которой c10Q контролировалось промотором ermE *. pTG1406 был введен в S. zelensis TG1405 с получением S.zelensis TG1406. Продукты ферментации TG1406 подвергали анализу с помощью ВЭЖХ на образование метаболитов. Те же процедуры были использованы для гетерологичной комплементации Swoo_2002 (плазмида pTG1407) в S. zelensis TG1402 (мутант ∆c10P ) для создания комплементированного штамма S. zelensis TG1407 и для комплементации c10P (плазмида pTG1408) в S. zelensis TG1402 для получения комплементированного штамма S.zelensis TG1408.

Производство и выделение метаболитов

Для ферментации ∆c10P и ∆c10Q споры S. zelensis TG1402 ( ∆c10P ) инокулировали в среду TSB в колбе Эрленмейера на 500 мл для 2-дневный рост в условиях 28 ° C и 220 об / мин, и полученные 10 мл культуры переносили в среду для ферментации в колбе на 500 мл на 6 дней. Компоненты ферментационной среды следующие: 29 : декстрин 30 г, рыбная мука 10 г, кукурузная мука 30 г, хлопковая мука 30 г, глюкоза 10 г, цитрат натрия 2.5 г, MgSO 4 • 7H 2 O 1 г, CaCO 3 5 г, FeSO 4 • 7H 2 O 0,02 г, KCl 0,5 г, CoCl 2 • 7H 2 O 0,02 г, Na 2 HPO 4 • 12H 2 O 3 г и дистиллированный H 2 O до 1 литра, pH 7,0. Клетки мицелия из культурального бульона собирали центрифугированием (3220 × г, в течение 10 мин), а затем мицелий пропитывали ацетоном. Экстракты растворителей использовали для дальнейшего анализа ВЭЖХ.Ферментацию мутантного штамма S. zelensis TG1405 ( ∆c10Q ) проводили с использованием тех же процедур.

В отличие от CC-1065 промежуточное соединение 6 было очень нестабильным в процессе экстракции мицелия ацетоном. После многих усилий наши процедуры выделения метаболита 6 были обобщены. После инкубации с использованием ферментационной среды в течение 6 дней культуральный бульон центрифугировали (3220 × г в течение 10 мин), культуральные фильтраты удаляли, осадок мицелия экстрагировали ацетоном, ацетоновый экстракт экстрагировали этилацетатом в течение 30 минут. ( 6 склонен к гидролизу в основном ацетоновом экстракте), а затем этилацетатную фазу сушили гранулированным безводным хлоридом кальция в течение ночи.Метаболит 6 , экстрагированный этилацетатом, затем подвергали хроматографии на колонке с силикагелем для первого цикла выделения (неочищенный экстракт подвергали колонке с силикагелем путем элюирования смесью CHCl 3 и MeOH в различных соотношениях, радио CHCl 3 : градиент MeOH изменяется как 50: 1 → 40: 1 → 30: 1 → 20: 1 → 15: 1 → 10: 1, элюент детектировали с помощью ВЭЖХ, и 6 элюировали в 20: 1 и 15: 1) и дополнительно очищали полупрепаративной ВЭЖХ-разделением ( 6 очищали полупрепаративной ВЭЖХ-разделением с обращенно-фазовой колонкой (Venusil XBP C18, 5 мкм, 100 Å, 10 × 250 мм) на Shimazu Prominence LC-20A.Колонку уравновешивали 85% растворителем A (H 2 O) / 15% растворителем B (CH 3 CN) в течение 3 мин, градиент элюирования был следующим: 0–3 мин: линейный градиент увеличивается от От 85% A / 15% B до 60% A / 40% B, 3–10 мин: увеличение линейного градиента до 45% A / 55% B, 10–12 мин: увеличение линейного градиента до 30% A / 70% B, 12–21 мин: увеличение линейного градиента до 15% A / 85% B, 21–22 мин: уменьшение линейного градиента до 85% A / 15% B, 22–23 мин: уравновешивание с 85% A / 15 % B. Скорость потока составляла 3 мл • мин -1 , и длина волны детектирования составляла 374 нм, пик ВЭЖХ при времени удерживания 16.2 минуты соответствуют 6 ). Наконец, 6 мг метаболита 6 было выделено из 24 л ферментационного бульона.

Создание штаммов со сверхэкспрессией белка

Взяв, например, C10P, тотальную ДНК, экстрагированную из S. zelensis NRRL 11183, в качестве матрицы, фрагмент ДНК (амплифицированный с праймерами c10P-for и c10P-rev), содержащий интактный ген c10P был сначала клонирован в T-вектор, после проверки секвенированием фрагмент 1,37 kb Eco RI / Hin dIII был выделен из T-вектора, а затем лигирован в тот же сайт pET28a с получением плазмиды pTG1409, которая затем была преобразован в E.coli Rosetta (DE3) для получения штамма экспрессии E. coli Ro28-P для экспрессии C10P с получением N -концевого 6x His-меченного белка. Аналогичные процедуры были использованы для конструирования E. coli Ro37-Q и E. coli RoTB-SW для экспрессии C10Q и Swoo_2002, соответственно.

Для конструирования штамма коэкспрессии (C10P / C10Q) продукт ПЦР размером 0,7 т.п.н., содержащий c10Q , был амплифицирован с использованием пары праймеров c10Q -gong-for и c10Q -gong-rev из общей экстрагированной ДНК. от с.zelensis NRRL 11183, а затем клонировали в T-вектор, после проверки секвенированием фрагмент ДНК Eco RI / Hin dIII был выделен из T-вектора и затем лигирован в тот же сайт RSFDuet на MCS I для дают плазмиду c10Q RSFDuet. Продукт ПЦР, содержащий c10P , амплифицировали с использованием пары праймеров c10P -gong-for и c10P -gong-rev из той же матрицы, а затем клонировали в T-вектор, после проверки секвенированием, 1.Фрагмент ДНК Nde I / Xho I размером 37 т.п.н. был выделен из Т-вектора и затем лигирован в тот же сайт pET37b с получением плазмиды c10P pET37b, а затем 1,37 т.п.н. Nde I / Avr II фрагмент с 6 × His-меткой был выделен из c10P pET37b и лигирован в тот же сайт c10Q RSFDuet на MCS II с получением плазмиды pTG1411, которую затем трансформировали в E. coli Rosetta (DE3 ) для получения штамма коэкспрессии E.coli RoDue-PQ.

Конструирование штаммов со сверхэкспрессией мутантного белка

Взяв, например, C10Q h238A, чтобы заменить His-138 на Ala, амплификацию ПЦР проводили с использованием пары праймеров c10P-Q h238A для и c10P-Q h238A rev. с плазмидой pTG1411 в качестве матрицы, и продукт ПЦР подвергали расщеплению Dpn I, затем трансформировали в E. coli DH5α. После проверки секвенированием полученную мутантную плазмиду pTG1413 затем трансформировали в E.coli Rosetta (DE3) для получения штамма экспрессии E. coli RoDue-PQ M для экспрессии C10Q h238A. Подобные процедуры были использованы для создания других сайт-специфичных мутантов Swoo_2002 и C10Q.

Очистка белка

E. coli Ro28-P (или E. coli RoDue-PQ) использовали для посева в 4 мл среды LB, содержащей 50 мкг • мл -1 канамицина и 25 мкг мл -1 хлоромицетин. Культуру выращивали при 37 ° C в течение ночи, а затем переносили в 500 мл среды LB, содержащей такую ​​же концентрацию антибиотиков и 0.25 мМ сульфат железа (железа) аммония. Когда 500 мл культуры выращивали при 37 ° C с OD при 600 нм ~ 0,3, добавляли 50 мкл 0,3 М водного раствора цистеина и 50 мкл 0,25 М сульфата железа (II) аммония, а затем культуру дополнительно выращивали при 37 ° C до тех пор, пока OD при 600 нм не достигнет ~ 0,6, экспрессию белка затем индуцировали добавлением 30 мкл 1 M IPTG с последующей инкубацией при 16 ° C в течение еще 24 часов. Аналогичные процедуры были применены для экспрессии Swoo_2002 с использованием штамма E.coli RoTB-SW, с той лишь разницей, что инкубацию проводили при 22 ° C в течение 18 часов.

После индукции при добавлении IPTG и инкубации для экспрессии белка клетки собирали из 500 мл культуральной жидкости (3220 × г в течение 10 мин). Затем очистку проводили при 4 ° C в анаэробном перчаточном боксе с менее чем 1 ч. / Млн O 2 . Собранные клетки ресуспендировали в 30 мл буфера для лизиса (HEPES 50 мМ, KCl 300 мМ, имидазол 2 мМ, меркаптоэтанол 10 мМ, глицерин 5%, pH 7.5) содержащий 1 мг / мл -1 лизоцима и разрушенный ультразвуковой обработкой. Бактериальную суспензию герметично закрывали в анаэробном перчаточном боксе и центрифугировали при 7250 × g в течение 60 мин, а затем возвращали в анаэробный перчаточный бокс, супернатант инкубировали с 4 мл смолы Ni-NTA, предварительно уравновешенной лизисным буфером. при 4 ° C в течение 1 ч, а затем подвергали аффинной очистке на колонке путем элюирования различными концентрациями имидазола (50 мМ 12 мл, 100 мМ 8 мл, 150 мМ 4 мл и 400 мМ 3 мл), полученного путем смешивания лизиса буфер с элюирующим буфером (HEPES 50 мМ, KCl 300 мМ, имидазол 400 мМ, меркаптоэтанол 10 мМ, глицерин 20%, pH 7.5). Наконец, белок элюировали 3 мл 400 мМ буфера для элюции и затем подвергали обессоливающей колонке для получения белка в 3 мл буфера Tris • HCl (Tris 50 мМ, NaCl 100 мМ, глицерин 10%, pH 8,0). Чистоту очищенного белка определяли с помощью анализа 12% SDS-PAGE. Однако оказалось, что белок, очищенный в аэробных условиях и затем восстановленный в анаэробных условиях, обладал той же активностью, что и белок, очищенный в анаэробных условиях и затем восстановленный.

Восстановление радикальных белков SAM

Радикальные ферменты SAM (C10P и Swoo_2002) необходимо восстановить в анаэробных условиях перед ферментативными анализами, и восстановление проводили при 4 ° C.Белок в 3 мл буфера Tris • HCl добавляли 30 мкл 1 М DTT к 10 мМ, через 15 минут добавляли 30 мкл 50 мМ сульфата железа (II) аммония до конечной концентрации 0,5 мМ, через 45 мин, 10 мкл 50 мМ сульфида натрия добавляли каждые 30 мин трижды до конечной концентрации 0,5 мМ, а затем восстанавливали в течение не менее 3 часов. После этого восстановленную смесь подвергали обессоливанию для получения темно-коричневого белка в 3 мл буфера Tris • HCl.

УФ-видимый анализ радикального фермента SAM

УФ-видимый анализ восстановленного радикального фермента SAM (и восстановленного радикального фермента SAM, восстановленного дитионитом натрия) был проведен на спектрофотометре Thermo NanoDrop 2000.

Анализ железа для Swoo_2002

Количество железа в восстановленном Swoo_2002 измеряли методом стандартной кривой 48 . После приготовления раствора A (смесь эквивалентного объема 1,2 M HCl и 0,285 M KMnO 4 ) раствор B (9,7 г ацетата аммония и 8,8 г аскорбиновой кислоты растворяли в 10 мл H 2 O, а затем Добавляли 80 мг феррозина и 80 мг неокупроина с последующим разбавлением водой до 25 мл) и 6 мкг (-1 сульфата железа (2) аммония в качестве стандартного раствора, добавляли 1 мл стандартного раствора, разбавленного до различных концентраций 0.5 мл раствора A и инкубировали при 60 ° C в течение 2 часов, затем к смеси добавляли 0,1 мл раствора B и инкубировали при комнатной температуре более 30 минут, значение поглощения при 562 нм измеряли на JASCO V530 и построена калибровочная кривая. Затем 1 мл образца Swoo_2002 при 20 мкМ подвергали той же процедуре, что и стандартный раствор, и измеряли значение поглощения при 562 нм, а затем количество железа в Swoo_2002 было рассчитано на основе калибровочной кривой.

Анализ серы для Swoo_2002

Количество серы в восстановленном Swoo_2002 также измеряли методом стандартной кривой 49 .Шесть микрограммов на миллилитр 6 мкг-мл сульфида натрия -1 готовили в виде стандартного раствора, добавляли 200 мкл стандартного раствора, разведенного до различных концентраций, 600 мкл 1% ацетата цинка и 50 мкл 7% NaOH, а затем инкубировали при комнатной температуре. температура в течение 15 мин, а затем 150 мкл 0,1% DMPD ( N , N -диметил- p -фенилендиамин моногидрохлорид) в 5 M HCl и 150 мкл 10 мМ раствора FeCl 3 в 1 M HCl были добавлены. После 20 мин инкубации измеряли значение поглощения при 670 нм и строили калибровочную кривую.Затем 200 мкл образца Swoo_2002 при 20 мкМ подвергали той же процедуре, что и стандартный раствор, и измеряли значение поглощения при 670 нм, а затем рассчитывали количество серы в Swoo_2002 на основе калибровочной кривой.

Калориметрический анализ изотермического титрования

Белки заменяли из буфера Трис • HCl на буфер PBS (буфер 10 × PBS: 80 г NaCl, 2 г KCl, 29 г Na 2 HPO 4 • 12H 2 O, 2 г KH 2 PO 4 в 1 LH 2 O, pH 7.4) путем трехкратного воздействия на опреснительную колонку (чтобы убедиться, что образец белка не содержит глицерин и содержит менее 5 ДМСО). Анализ ITC проводили на Malvern MicroCal ITC200 с 600 мкМ C10Q, титруя 200 мкл 60 мкМ Swoo_2002, и результаты обрабатывались автоматически в процессе титрования.

Ферментативные анализы in vitro

Все анализы активности ферментов in vitro проводили в анаэробном перчаточном боксе с менее чем 1 ppm O 2 . Ферментативные реакции проводили в буфере Трис • HCl (Трис 50 мМ, NaCl 100 мМ, глицерин 10%, pH 8.0) со следующими компонентами: 1 мкМ восстановленного Swoo_2002, 2 мкМ C10Q, 10 мкМ субстрата, 1 мМ SAM, 5 мМ DTT, 5 мМ MgCl 2 , 5 мМ Na 2 S 2 O 4 и 7% ДМСО. Реакции инкубировали при 28 ° C в течение 12 ч.

ВЭЖХ-анализ ферментных продуктов

ВЭЖХ-анализ CC-1065 и 7 выполняли на обращенно-фазовой колонке (Grace Alltima, C18, 5 мкм, 100 Å, 10 × 250 мм) на Agilent серии 1200. Колонку уравновешивали 85% растворителем A (H 2 O) / 15% растворителем B (CH 3 CN) в течение 3 минут.Градиент элюирования был следующим: 0–3 мин: увеличение линейного градиента от 85% A / 15% B до 60% A / 40% B, 3–10 мин: увеличение линейного градиента до 45% A / 55%. B, 10–12 мин: увеличение линейного градиента до 30% A / 70% B, 12–21 мин: увеличение линейного градиента до 15% A / 85% B, 21–22 мин: уменьшение линейного градиента до 85% A / 15% B, 22-25 мин: 85% A / 15% B. Скорость потока составляла 1 мл • мин –1 и длина волны обнаружения была при 374 нм, пик ВЭЖХ при времени удерживания 13,7 мин и 14,8 мин соответствуют на CC-1065 и 7 соответственно.

ВЭЖХ-анализ SAH и 5′-dA выполнялся на обращенно-фазовой колонке (Diamonsil, C18, 5 мкм, 4,6 × 250 мм) на Agilent серии 1200. Колонку уравновешивали 95% растворителем A (H 2 O + 1 TFA) / 5% растворителем B (CH 3 CN + 1 TFA) в течение 3 минут. Градиент элюирования был следующим: 0–5 мин: 95% A / 5% B, 5–20 мин: увеличение линейного градиента до 80% A / 20% B, 20–24 мин: увеличение линейного градиента до 10 % A / 90% B, 24–27 мин: 10% A / 90% B, 27–29 мин: уменьшение линейного градиента до 95% A / 5% B, 29–30 мин: 95% A / 5% B .Скорость потока составляла 1 мл • мин -1 , а длина волны детектирования была при 260 нм, пик ВЭЖХ при времени удерживания 9,0 мин и 12,2 мин соответствовал SAH и 5′-dA, соответственно.

Выделение и характеристика ферментных продуктов

Полученные ферментативно SAH, 5′-dA и CC-1065 были очищены полупрепаративным разделением HPLC и HR-MS анализы были проведены на Bruker (UHR-TOF) maXis 4 G, оказалось выяснилось, что продукт SAH имел точно такую ​​же молекулярную массу, что и стандартный SAH (вычислено.для C 14 H 21 N 6 O 5 S + 385,1294 [M + H] + , найдено 385,1293; расч. для C 14 H 20 N 6 NaO 5 S + 407.1114 [M + Na] + , найдено 407.1112) продукт 5′-dA имел точно такую ​​же молекулярную массу, что и стандарт 5′-dA (вычислено для C 10 H 14 N 5 O 3 + 252,1097 [M + H] + , найдено 252.1090; расч. для C 10 H 13 N 5 NaO 3 + 274,0916 [M + Na] + , найдено 274,0908), и продукт CC-1065 также имел точно такую ​​же молекулярную массу, что и стандарт CC-1065 (вычислено для C 37 H 34 N 7 O 8 + 704,2469 [M + H] + , найдено 704,2460; вычислено для C 37 H 33 N 7 NaO 8 + 726,2288 [M + Na] + , найдено 726.2267), а результат МС / МС продукта CC-1065 также соответствовал стандарту CC-1065.

Полученный ферментативным путем 7 очищали полупрепаративной ВЭЖХ с обращенно-фазовой колонкой (Venusil XBP C18, 5 мкм, 100 Å, 10 × 250 мм) на Shimazu Prominence LC-20A. Колонку уравновешивали 60% растворителем A (H 2 O) / 40% растворителем B (CH 3 CN) в течение 3 мин, градиент элюирования был следующим: 0–3 мин: линейный градиент увеличивается от От 60% A / 40% B до 50% A / 50% B, 3–6 мин: увеличение линейного градиента до 30% A / 70% B, 6–10 мин: увеличение линейного градиента до 15% A / 85% B, 10–12 мин: увеличение линейного градиента до 10% A / 90% B, 12–14 мин: увеличение линейного градиента до 5% A / 95% B, 14–16 мин: уменьшение линейного градиента до 60% А / 40% Б.Скорость потока составляла 3 мл мин -1 , а длина волны детектирования составляла 374 нм. HR-MS анализ очищенного продукта 7 показал, что он имел точно такую ​​же молекулярную массу, что и стандартный CC-1065 (C 37 H 34 N 7 O 8 + 704,2460), но дополнительные данные МС / МС подтвердили, что продукт 7 является метилированным продуктом субстрата 6 на С-11. В данных ЯМР 1 H (ДМСО- d 6 ) субстрата 6 [29], δ 2.46 (с, 3 H), 3,22 (т, 2 H, Дж = 8,86 Гц), 3,33 (т, 2 H, Дж = 7,17 Гц), 3,82 (с, 3 H), 3,91 (с, 3 H), 4,03 (т, 2 H, J = 8,86 Гц), 4,70 (т, 2 H, J = 7,17 Гц), 6,90 (с, 2 H), 6,96 (д, 1 H, J = 2,28 Гц), 7,05 (с, 1 H), 7,08 (с, 1 H), 7,11 (с, 1 H), 7,71 (с, 1 H), 7,77 (д, 1 H, J = 2,28 Гц), 8,42 (с, 1 H, OH), 10,81 (с, 1 H), 11,14 (с, 1 H, OH), 11,34 (с, 1 H), 11,95 (с, 1 H), 12,93 ( с, 1 H, OH), сигнал 6.96 (д, 1 H, J = 2.28 Гц) соответствует 11-каналу связи 6 с соседним 12-канальным. Однако в данных 1 H ЯМР (ДМСО- d 6 ) продукта 7 сигнал 11-CH отсутствует, а сигнал 12-CH остается. Кроме того, появляется дополнительный сигнал при 2,05 ppm, соответствующий соединению 11-CH 3 с C = C (11-C). Кроме того, данные H-H COSY для субстрата 6 показали очевидный сигнал H-H-связывания между 11-CH и 12-CH, тогда как сигнал H-H-связывания отсутствует в H-H-COSY данных продукта 7 .В заключение, все данные, перечисленные выше, показывают, что продукт 7 является метилированным продуктом субстрата 6 на 11-C.

Синтез CD

3 -SAM

Реакцию проводили в темноте 50 , 5,25 мг SAH (1 экв.) Растворяли в 0,5 мл HCOOH и 0,5 мл CH 3 COOH при 0 °. C, а затем добавляли 41,5 мкл CD 3 I (50 экв.), После этого добавляли 5,4 мг AgClO 4 (2 экв.) И смесь перемешивали при 0 ° C в течение 5 мин перед переносом в комнату. температура.После перемешивания при комнатной температуре в течение 24 ч реакцию гасили 3 мл H 2 O и экстрагировали диэтиловым эфиром (3 × 5 мл), а затем супернатант водной фазы после центрифугирования лиофилизировали для удаления HCOOH, CH 3 COOH и H 2 O, оставшееся твердое вещество, содержащее CD 3 -SAM, подвергали полупрепаративной ВЭЖХ-разделению на обращенно-фазовой колонке (Venusil XBP C18, 5 мкм, 100 Å, 10 × 250 мм) на Shimazu Prominence LC-20A. Колонку уравновешивали 95% растворителем A (H 2 O + 1 TFA) / 5% растворителем B (CH 3 CN + 1 TFA) в течение 3 мин, градиент элюирования был следующим: 0– 1 мин: 95% A / 5% B, 1–12 мин: увеличение линейного градиента до 92.38% A / 7,62% B, 12–14 мин: увеличение линейного градиента до 30% A / 70% B, 14–15 мин: уменьшение линейного градиента до 95% A / 5% B. Скорость потока составляла 3 мл • min -1 и длина волны детектирования 260 нм. CD 3 -SAM собирали через 5,7 мин. HR-MS C 15 H 20 D 3 N 6 O 5 S + ([M] + ), вычислено 402,1633, найдено 402,1633.

Эксперименты по маркировке

Для экспериментов, связанных с CD 3 -SAM, CD 3 -SAM использовался вместо обычного SAM во время анализов активности ферментов in vitro, продукты CC-1065, 7 , SAH и 5 ‘ -dA очищали с помощью ВЭЖХ и подвергали HR-MS, оказалось, что большая часть продукта CC-1065 показала сдвиг массы +2 m / z (C 37 H 32 D 2 Н 7 О 8 + 706.2518), в то время как меньшинство осталось неизменным, большая часть продукта 7 показала массовый сдвиг +2 m / z (C 37 H 32 D 2 N 7 O 8 + 706.2519), в то время как меньшинство не изменилось, большая часть продукта 5′-dA показала сдвиг массы +1 m / z (C 10 H 13 DN 5 O 3 + 253.1084), а меньшая часть не изменилась, в то время как молекулярная масса продукта SAH осталась неизменной (C 14 H 21 N 6 O 5 S + 385.1293). Наблюдение за этим небольшим количеством немеченых продуктов хорошо согласуется с тем фактом, что C10P и Swoo_2002 могут очищаться совместно с небольшим количеством немеченого SAM, как показал анализ ВЭЖХ.

Для экспериментов с D 2 O все химические реагенты для ферментных анализов растворяли в D 2 O и белки заменяли на буфер Tris • HCl, приготовленный в D 2 O. Продукты CC-1065, 7 , SAH и 5′-dA были очищены с помощью ВЭЖХ и подвергнуты HR-MS, оказалось, что большая часть продукта CC-1065 показала сдвиг массы +1 m / z (C 37 H 33 DN 7 O 8 + 705.2458), в то время как меньшинство осталось неизменным, большая часть продукта 7 показала массовый сдвиг +1 m / z (C 37 H 33 DN 7 O 8 + 705.2459) в то время как меньшинство не изменилось, молекулярная масса продукта 5′-dA и SAH осталась прежней (C 10 H 14 N 5 O 3 + 252,1090 для 5′-dA и C 14 H 21 N 6 O 5 S + 385.1293 для SAH).

Идентификация промежуточного соединения субстрата SAM

Когда ферментный анализ был заранее завершен и подвергнут HR-MS, мы искали сигнал молекулярной массы, соответствующий предполагаемому промежуточному соединению субстрата SAM (C 51 H 54 N 13 O 13 S + 1088.3761). Этот пик в ВЭЖХ ранее игнорировался из-за его довольно низкого количества и нестабильности, и этот промежуточный продукт настолько нестабилен, что он будет разлагаться, когда смесь для ферментного анализа подвергали роторному испарению.Затем мы обогатили этот вероятный промежуточный продукт SAM с помощью ВЭЖХ из крупномасштабных ферментных анализов и подтвердили его идентичность с помощью МС / МС. Впоследствии эксперименты CD 3 -SAM были проведены в крупном масштабе для обогащения вероятного дейтерированного промежуточного соединения SAM, затем промежуточное соединение было очищено с помощью ВЭЖХ и подверглось HR-MS, оказалось, что большая часть дейтерированного промежуточного соединения SAM показала массовый сдвиг +2 m / z (C 51 H 52 D 2 N 13 O 13 S + 1090.3809), а меньшинство осталось неизменным.

Доступность данных

Данные, подтверждающие выводы этого исследования, можно получить у соответствующего автора по запросу.

L-метионин | Маг. Принова

Ресурсы для сертификации продукции

Скачать SDS

Скачать TDS

Запросить документы

L-метионин

L-метионин — незаменимая аминокислота; он играет важную роль в метаболизме и является субстратом для других аминокислот, таких как таурин и цистеин.Он используется в аппликациях на вкусовые ощущения и в пищевых добавках, где он может улучшить заживление ран.
  • Белый кристаллический порошок
  • Растворим в воде

Технические характеристики

Технические характеристики
Название производителя CJ Хайде (Нинбо) Биотех
Стр. Пачка 25 кг
Мероприятие кг
Тип корпуса Барабан
Стандартный размер выборки 100.00 г
Код оборудования 9003
Идентификатор продукта 10676
Номер CAS 59-51-8
Номер FEMA 3301
Рыночные приложения Питание, питание, напитки для спорта и образа жизни
Медицинское пособие До, во время и после тренировки
{{/ thumbnail_url}} {{{_highlightResult.name.value}}}

{{#categories_without_path}} в {{{category_without_path}}} {{/ category_without_path}} {{# _highlightResult.color}} {{# _highlightResult.color.value}} {{#categories_without_path}} | {{/ category_without_path}} Цвет: {{{_highlightResult.color.value}}} {{/_highlightResult.color.value}} {{/ _highlightResult.цвет}}

{{price.USD.default_formated}} {{# price.USD.default_original_formated}} {{price.USD.default_original_formated}} {{/price.USD.default_original_formated}} {{# price.USD.default_tier_formated}} Всего лишь {{price.USD.default_tier_formated}} {{/price.USD.default_tier_formated}}

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.