Желтая вода после фортранса: Почему выходит вода ярко-желтого цвета, фортранс, желтая вода, вопрос врачу от 04.07.2018 — ответов врачей: 2

Содержание

инструкция, отзывы и последствия, цена

Периодическое очищение кишечника фортрансом необходимо ввиду того, что под влиянием ряда факторов (нарушение правил здорового питания, некачественные продукты, плохая экологическая обстановка, вредные условия производства и т.п.), в нашем организме скапливается масса вредных веществ. Оседает вся эта «грязь» на ворсинках кишечника. И наша задача в этом случае – выбрать действительно хороший и проверенный метод, который мягко выведет из кишечника шлаки, токсины, соли тяжелых металлов и радионуклиды.

Состав фортранса

Эффективность чистки фортрансом обусловлена составом препарата. В одном пакетике этого сильнодействующего слабительного лекарства содержатся следующие компоненты:

макрогол 4000 – 64 г
безводный сульфат натрия – 5,7 г
бикарбонат натрия – 1,68 г
хлорид натрия – 1,46 г
хлорид калия – 0,75 г

Вспомогательные ингредиенты: ароматическая добавка (вкус пассифлоры), сахарин натрия.

Как пить фортранс для очистки кишечника

Способ применения фортранса достаточно прост. Берете 3-4 пакетика с порошком и разводите в соответствующем количестве негазированной воды (в трех или четырех литрах). Это количество жидкости необходимо выпить за 3-4 часа. Пьется лекарство порционно – по 250 мл за один раз. Эффект наступает уже спустя час и длится порядка 6-10 часов.
Важные правила:

За сутки до начала приема лекарства фортранс ваше меню должно состоять из легко усвояемых продуктов – каши, омлет, фруктовое желе (но без кусочков фруктов).
В день процедуры разрешается позавтракать омлетом, а затем употреблять только обезжиренный мясной бульон, соки, чай.
Необходима адаптация после фортранса – весь следующий день вы должны пребывать в состоянии покоя, не заниматься физическими и умственными нагрузками и отварной рис.

Очищение кишечника фортрансом: отзывы

Подавляющая часть людей, использовавших это лекарство, отмечают его жуткие вкусовые качества. Не всем удается выпить необходимое количество жидкости за установленное время без появления рвотных позывов. Тем не менее, результативность очистки кишечника фортрансом практика доказывает.

Препарат пользуется уважением и у медиков. Как правило, его назначают в качестве подготовки к ирригоскопии, колоноскопии, лапароскопии. А вот фортранс для похудения врачи использовать не рекомендуют, да и результаты такого способа снижения веса нельзя назвать эффективными.

Аналоги фортранса

Ввиду того, что средство характеризуется не очень приятным вкусом, то вам будет интересно узнать об аналогах препарата, которые окажутся не менее эффективными. Заменить фортранс способны лавакол, дюфалак, флит фосфо-сода и некоторые другие продукты фармацевтики.

Многие также гадают, что купить в аптеке — фортранс или форлакс. Это совершенно разные препараты, несмотря на созвучность названий. Первый оказывает мощное слабительное действие, а второй способствует лишь легкому, поверхностному очищению кишечника (используется просто для того, чтобы избавиться от возникшего запора).

В качестве своеобразного аналога можно назвать и кружку Эсмарха. Но на вопрос о том, что лучше – фортранс или клизма, ответ однозначен. Конечно, слабительный препарат. В отличие от клизмы он чистит кишечник полностью, а не только часть толстой и всю прямую кишку. К тому же, куда проще без посторонней помощи развести порошок в воде и выпить, нежели самостоятельно ставить очистительную клизму.

Фортранс: противопоказания и последствия

У препарата существует ряд противопоказаний:

детский возраст (до 15 лет)
кишечная непроходимость
проблемы с сердцем
желудочно-кишечные заболевания

обезвоживание организма
непереносимость компонентов

Среди неприятных и опасных последствий, которые могут возникнуть после увлечения чисткой кишечника фортрансом (при его регулярном, а не разовом применении), выделяют:

атонию кишечника (невозможность опорожняться самостоятельно, без использования слабительного)
выпадение волос, кровоточивость десен, ломкость ногтей (как следствие серьезных нарушений процесса усвоения из пищи витаминов, минералов, солей)
вздутие живота, повышенное газообразование даже после употребления самых безобидных продуктов
невозможность организма усваивать грубую пищу (результат – механические повреждения кишечника, геморрой, трещины)
замедление всем обменных процессов
диарея

Так что, следует понимать, что очищение фортрансом кишечника должно быть обосновано медицинскими показаниями.

Лучше не использовать средство для самолечения, а обговорить его использование со своим врачом.

Колоноскопия под наркозом и без

Колоноскопия – это безопасное эндоскопическое исследование кишечника с помощью гибкого зонда, оснащенного видеокамерой. Ни один из альтернативных методов диагностики не дает более точной и достоверной информации. Только колоноскопия позволяет осмотреть все отделы толстого кишечника и выявить любые патологические изменения: полипы, язвы, предраковые состояния, опухоли.

Диагностическая колоноскопия: показания и противопоказания

Без показаний данный вид обследования не проводится. Если врач дает направление на колоноскопию, значит, для этого есть серьезные основания. Отказываться от процедуры не стоит. Во-первых, для постановки или уточнения диагноза без нее не обойтись, во-вторых – на современных аппаратах и с использованием анестезирующих средств колоноскопия проходит быстро и безболезненно.

Выделяют 3 основные группы показаний к проведению исследования:

Диагностика причин неприятных симптомов. Есть ряд клинических проявлений, при наличии которых колоноскопию откладывать нельзя. Это регулярные боли в животе, нарушения стула, кровотечения из прямой кишки, гной или слизь в кале, беспричинная потеря веса. Эти состояния могут говорить не только об опасных заболеваниях, поэтому для выявления их причин необходимо тщательное обследование.
Скрининг в профилактических целях. Чтобы своевременно выявить скрытые патологии, которые никак себя не проявляют, проводятся скрининговые процедуры. Такие обследования рекомендуется периодически проходить пациентам из группы риска: мужчинам и женщинам после 40 лет и людям с наследственной предрасположенностью к онкологическим заболеваниям.
Контроль после лечения. Диагностическая процедура проводится для оценки состояния пациента после терапевтического либо хирургического лечения, чтобы убедиться в отсутствии рецидивов и осложнений.

Колоноскопию не назначают беременным женщинам. Кроме того, исследование не проводят при нарушении свертываемости крови, легочной и сердечной недостаточности, гипертонии, перитоните, перфорации кишечника.

Какие болезни можно диагностировать с помощью колоноскопии?

Благодаря своевременно проведенной колоноскопии врачи могут обнаружить многие опасные нарушения:

болезнь Крона;
язвенный колит;
полипозные образования и эрозии;
внутренние кровотечения;
болезнь Гиршпрунга;
кишечную непроходимость;
опухоли различного характера и др.

Во время колоноскопии врач может провести лечебные мероприятия. Без полостной операции специалисты купируют кровотечения, удаляют полипы и небольшие опухоли, берут материал для гистологического анализа.

Подготовка к обследованию

Для успешного проведения колоноскопии подготовку к процедуре нужно начать за 2–3 дня. Из рациона исключаются тяжелые для пищеварения мучные изделия, мясо, сырые фрукты и овощи, бобовые, сладкие блюда.

Непосредственно перед исследованием проводят очищение кишечника с помощью слабительных средств или клизмы. В день процедуры допускается легкий завтрак (кроме тех случаев, когда запланировано обследование под наркозом).

Колоноскопическое исследование в Москве. Как проходит процедура?

Продолжительность колоноскопии составляет не более 30 минут. Эндоскоп вводится через задний проход и медленно перемещается по толстой кишке. Для улучшения визуализации через зонд подается воздух. Изображения с видеокамеры поступают на экран монитора. Это позволяет оценить состояние слизистой в режиме реального времени.

В РГНКЦ колоноскопию выполняют с помощью новейшего цифрового оборудования. По желанию пациента возможно применение наркоза. Наши специалисты используют все возможности данного обследования: быстро и аккуратно проводят диагностику, при необходимости удаляют мелкие образования и делают биопсию (забор тканей для дальнейшего исследования).

Наш центр находится по адресу: Москва, улица 1-я Леонова, дом 16. Для уточнения цен на услуги и записи на прием позвоните по указанным на сайте телефонам или воспользуйтесь онлайн-формой.

Гастрит жел — Вопрос гастроэнтерологу

Если вы не нашли нужной информации среди ответов на этот вопрос, или же ваша проблема немного отличается от представленной, попробуйте задать дополнительный вопрос врачу на этой же странице, если он будет по теме основного вопроса. Вы также можете задать новый вопрос, и через некоторое время наши врачи на него ответят. Это бесплатно. Также можете поискать нужную информацию в похожих вопросах на этой странице или через страницу поиска по сайту. Мы будем очень благодарны, если Вы порекомендуете нас своим друзьям в социальных сетях.

Медпортал 03online.com осуществляет медконсультации в режиме переписки с врачами на сайте. Здесь вы получаете ответы от реальных практикующих специалистов в своей области. В настоящий момент на сайте можно получить консультацию по 74 направлениям: специалиста COVID-19, аллерголога, анестезиолога-реаниматолога, венеролога, гастроэнтеролога, гематолога, генетика, гепатолога, гериатра, гинеколога, гинеколога-эндокринолога, гомеопата, дерматолога, детского гастроэнтеролога, детского гинеколога, детского дерматолога, детского инфекциониста, детского кардиолога, детского лора, детского невролога, детского нефролога, детского онколога, детского офтальмолога, детского психолога, детского пульмонолога, детского ревматолога, детского уролога, детского хирурга, детского эндокринолога, дефектолога, диетолога, иммунолога, инфекциониста, кардиолога, клинического психолога, косметолога, липидолога, логопеда, лора, маммолога, медицинского юриста, нарколога, невропатолога, нейрохирурга, неонатолога, нефролога, нутрициолога, онколога, онкоуролога, ортопеда-травматолога, офтальмолога, паразитолога, педиатра, пластического хирурга, подолога, проктолога, психиатра, психолога, пульмонолога, ревматолога, рентгенолога, репродуктолога, сексолога-андролога, стоматолога, трихолога, уролога, фармацевта, физиотерапевта, фитотерапевта, флеболога, фтизиатра, хирурга, эндокринолога.

Мы отвечаем на 97.42% вопросов.

Оставайтесь с нами и будьте здоровы!

Давайте поговорим о сексе (для транс-мужчин)

Вот простой факт, о котором мало кто догадывается: многие транс-мужчины предпочитают не делать то, что мы называем «операцией на ягодицах». То есть они решили не делать никаких операций на гениталиях, с которыми родились. Это означает, что в мире есть значительное количество мужчин с вагиной. Я разговаривал со многими транс-мужчинами на протяжении всей своей жизни и работы, и, по моим оценкам, около 90 процентов транс-мужчин по всему миру — я брал интервью у мужчин из Швеции, США.К., Бразилия, Мексика и другие страны — не сделали выбор в пользу операции на дне.

Для кого-то это решение вызвано финансовыми причинами, для кого-то боязнью осложнений, а для кого-то это больше похоже на «шаг за шагом»: «Посмотрим, как будет себя чувствовать этот первый этап (операция на груди, гормоны), и я возьму его оттуда». Независимо от причины, тело трансгендерного человека, недавно перешедшего, — это новый ландшафт для него, и, возможно, тот, который не очень хорошо понят или приспособлен даже самим мужчиной.

Когда я впервые совершил переход, я беспокоился, что не смогу найти партнера или даже любовь. Я беспокоился, что людей просто оттолкнет мысль о мужчине с вагиной. С тех пор я взял интервью и поговорил с сотнями трансгендерных парней, которые разделяют те же опасения. 30-летний Кевин, живущий в Бруклине, сказал: «Решение не делать операцию на ягодицах было тем, к чему я шел много лет. Только когда я увидел в Интернете видеоролики о вашей работе (серия документов, которую я делаю под названием

Sexing the Transman ), я понял, что мне не нужен пенис, чтобы стать мужчиной.Я беспокоился о сексе, но, что удивительно, большинство моих сексуальных партнеров были очень открыты для меня и моего тела, даже если это для них незнакомая территория».

Лично я всегда буду помнить тот момент, когда я понял, что с моими гениталиями все в порядке, что мое влагалище было частью меня, и что быть мужчиной без пениса нормально, и это произошло благодаря мастурбации и оргазму. Это был один из первых случаев, когда я проник в себя, и я чувствовал себя немного виноватым, что на самом деле достиг кульминации. Это было странное чувство — впервые насладиться своей вагиной — это всегда было чем-то, к чему я не была привязана и даже ненавидела.Но тот оргазм изменил для меня все. Это был действительно поворотный момент в моей идентичности и моей любви к себе.

Мастурбация стала для меня ежедневным ритуалом, как и для многих других транс-мужчин, с которыми я общалась. Из-за этого мы всегда ищем новые способы выйти. В мире секс-игрушек не было ничего, что было бы разработано для нашего тела. Что делает транс-мужские влагалища и вульвы необычными, так это то, что они увеличиваются, особенно клитор, из-за использования тестостерона, и вместе с этим наши влагалища также становятся немного более чувствительными.Парни говорят о недавно повышенном сексуальном сознании и желании секса. Когда это сочетается с непривязанностью к своему телу или недостатком информации или ресурсов, транс-мужчины рискуют не испытать наилучшую сексуальную жизнь.

Поскольку в мире секс-игрушек (или «продуктов для удовольствия») не было ничего для транс-мужчин, мне пришлось быть очень изобретательным! Я разрезал продукты, сделанные для цисгендерных мужчин и женщин, чтобы они соответствовали моей анатомии, например фаллоимитаторы с присоской, вырывал их и использовал отверстие на конце для мастурбации. Я находил такие вещи, как наборы для укуса змеи, которые используются для высасывания яда из укуса змеи, или игрушки, такие как присоски для сосков, и адаптировал их под себя. Некоторые транс-парни показали мне, как они использовали концы бутылок с водой, наполненные водой, чтобы создать всасывание. Один парень даже использовал маленькое полотенце для рук, наполненное смазкой, чтобы натирать его. Удивительно, как можно создавать вещи только для того, чтобы мастурбировать.

Джим, 23-летний транс-мужчина из Филадельфии, сказал мне: «Мастурбация — это то, чем я занимаюсь каждый день.Сначала мне было нелегко найти место, чтобы чувствовать себя комфортно, прикасаясь к себе; это было странно, потому что я никогда не делал этого до перехода. Хотя через это я понял, что люблю секс и что мне нужно чувствовать себя, и пусть это будет хорошо».

Когда я, наконец, смогла полюбить свое тело и чувствовать себя комфортно с ним, я чувствовала себя более комфортно на многих уровнях, выходящих далеко за рамки сексуальности. По этой причине у меня была миссия научить транс-парней любить свое тело и через это любить себя.Эти разговоры так важны для нашего благополучия, и именно поэтому мы давно мечтаем создать игрушку, которая будет только для нас. Это подтверждает; он говорит: «Ваше тело настоящее, оно заслуживает наслаждения, и вы не одиноки». Я действительно надеюсь использовать Buck-Off, чтобы начать разговоры за пределами сообщества транс-мужчин, а также повысить осведомленность о телах транс-мужчин и их конкретных потребностях. Это важно не только для нас, но и для наших потенциальных партнеров, учителей, медицинских работников и законодателей.

БАК ЭНЖЕЛ — американский транс-мужчина, правозащитник, вдохновляющий оратор и режиссер фильмов о половом воспитании. Ангел входит в совет директоров Woodhull Sexual Freedom Alliance с 2010 года; Фонд работает над утверждением сексуальной свободы как основного права человека посредством защиты интересов и образования. BuckAngel.com

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Нацеливание на расщепление внутримолекулярной протеиназы NS2B/3 для трансдоминантного ингибирования вируса денге

Значение

Срочно необходимы ингибиторы вируса денге, переносимого комарами патогена.Вирусно кодируемая NS2B/3, двухсубъединичная сериновая протеиназа, отвечает за многие расщепления внутри вирусного полипротеина. Мы демонстрируем, что два сайта расщепления, фланкирующие NS3, и один внутренний являются самопроцессинговыми. Это строгое внутримолекулярное расщепление диктует, что, если нерасщепленные предшественники могут ингибировать рост вируса, этот фенотип будет -транс--доминантным. Действительно, мутация, устраняющая один из сайтов самопроцессинга, вызывала -транс--доминантное ингибирование вируса дикого типа. Этот участок также является наиболее чувствительным к ингибитору протеиназы денге, что является убедительным обоснованием его эффективности. Мы предполагаем, что явное нацеливание на специфические сайты внутримолекулярного расщепления будет эффективной противовирусной стратегией, которая может подавлять множественные варианты внутриклеточных квазивидов.

Abstract

Многие РНК-вирусы с положительной цепью транслируют свои геномы в виде отдельных полипротеинов, которые обрабатываются протеиназами хозяина и вируса с образованием всех вирусных белковых продуктов.Среди них вирус денге, который кодирует сериновую протеиназу NS2B/3, ответственную за семь различных расщеплений полипротеина. NS2B/3 был объектом многих направленных скринингов для поиска химических ингибиторов, из которых соединение ARDP0006 является одним из наиболее эффективных для ингибирования роста вируса. Мы показываем, что по крайней мере три расщепления полипротеина денге являются исключительно внутримолекулярными. По определению, такой -цис--действующий дефект не может быть устранен в -транс-. Это создает возможность того, что чувствительные к лекарственным средствам или ингибированные протеиназы могут быть генетически доминирующими, подавляя рост резистентных к лекарственным средствам вирусов за счет накопления предшественников.Действительно, вариант NS3-G459L, неспособный к расщеплению на внутреннем соединении NS3, доминантно ингибирует синтез РНК с отрицательной цепью вируса дикого типа, присутствующего в той же клетке. Этот внутренний сайт расщепления NS3 является соединением, наиболее ингибируемым ARDP0006, что делает вероятным то, что накопление токсичных предшественников, а не ингибирование протеолитической активности как таковое, объясняет противовирусную эффективность этого соединения в сдерживании вирусного роста. Мы утверждаем, что внутримолекулярные расщепляющие протеиназы являются многообещающими лекарственными мишенями для вирусов, кодирующих полипротеины.Наиболее эффективные ингибиторы будут специфически нацелены на сайты расщепления, необходимые для процессинга предшественников, которые проявляют -транс--доминантное ингибирование.

Вирус денге — переносимый комарами патоген, вызывающий, по оценкам, 390 миллионов случаев заболевания во всем мире ежегодно (1). Инфекция может привести к лихорадке денге, геморрагической лихорадке денге или шоковому синдрому денге, а вакцины или противовирусные препараты в настоящее время не одобрены для использования. Разработка профилактических и терапевтических методов лечения этого и других забытых или возникающих заболеваний является приоритетом для глобальных организаций здравоохранения.

РНК-вирусы с положительной цепью кодируют полипротеины, которые должны быть расщеплены во время и после трансляции. Кодируемая вирусом сериновая протеиназа (NS3) и ее незаменимый кофактор (NS2B) ответственны за вирусно-опосредованное расщепление среди всех представителей рода Flavivirus , включая Западный Нил (ВЗН), желтую лихорадку, японский энцефалит, Зика и вирусы денге. При первом синтезе NS2B/3 встроен в полипротеин денге и отвечает за семь процессов процессинга в нем (2) (рис. 1 А ). Было показано, что в ВЗН расщепление между NS2B и NS3 является исключительно внутримолекулярным (3). Для вируса денге это расщепление нечувствительно к разведению (4), что позволяет предположить, что строгий внутримолекулярный процессинг в этом соединении является обычным явлением среди флавивирусов. В дополнение к протеолитическим событиям, которые первоначально определяли вирусные белки, существует внутреннее расщепление NS3 (NS3 _int). Значение этого расщепления пока неизвестно, хотя сообщалось, что оно происходит в клетках млекопитающих, но не в клетках насекомых (5, 6).

Рис. 1.

Ингибирование вируса денге с помощью ARDP0006. ( A ) Полипротеиновая организация вируса денге, показывающая расщепление, производимое NS2B/3 (черные стрелки) и протеазами хозяина (серые стрелки). ( B ) Две кристаллические структуры с высоким разрешением полноразмерного NS2B/3 демонстрируют множественные конформации доменов геликазы и протеазы относительно друг друга (идентификационные коды банка данных белков 2VBC и 2WHX, зеленый и бирюзовый, соответственно). Активный сайт протеиназы показан красным, а внутренний сайт расщепления NS3 — оранжевым.( C ) Химическая структура ингибитора NS2B/3 ARDP0006. ( D и E ) Влияние 25 мкМ ARDP0006 (пунктирные линии) на внеклеточный и внутриклеточный вирус денге (множественность заражения, 0,1 БОЕ на клетку) во время роста клеток BHK-21. Ингибирование роста вируса сравнимо с тем, что наблюдалось ранее (11), с зарегистрированным значением IC ₅₀, равным 4,2 мкМ. n = 4 в D и E .

NS3 представляет собой привлекательную мишень для наркотиков, поскольку он выполняет множество важных функций.N-концевой домен содержит активный сайт протеиназы, а С-концевой домен проявляет активности РНК-хеликазы, РНК-5′-трифосфатазы (RTPase) и НТФазы (7). Кроме того, мутации, которые изменяют консервативные неферментативные поверхностные остатки, снижают приспособленность вируса (8). Структуры, определенные с помощью рентгеновской кристаллографии, показали две разные ориентации (рис. 1 B ) домена протеиназы относительно домена хеликазы NS3 (9, 10), утверждая, что эти домены могут быть гибкими по отношению друг к другу в решение также.

Ингибитор протеиназы денге NS2B/3 ARDP0006 (1,8-динитро-4,5-дигидроантрахинон; рис. 1 C ) ранее был идентифицирован в ходе высокопроизводительного скрининга. Тестируемая протеиназа NS2B/3 была сконструирована так, чтобы содержать только кофакторные области, необходимые для активности протеиназы NS3 (остатки NS2B с 49 по 96), соединенные с остатками 1-185 NS3 через гибкую последовательность Gly ₄ -Ser-Gly ₄. Эта минимальная протеиназа эффективно расщепляет субстраты, поставляемые в составе транс , но не может самопроцессироваться.Таким образом, этот скрининг проверяют на наличие ингибиторов межмолекулярного расщепления (11, 12). Следует отметить, что в то время как полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC ₅₀ ) для межмолекулярного расщепления в растворе составляла 432 мкМ (12), IC ₅₀ при заражении составляла 4,2 мкМ (11). Дополнительный ингибирующий эффект, наблюдаемый в клетках, может быть связан с повышенными локальными концентрациями или нецелевыми эффектами. Однако мы предусмотрели альтернативный механизм, в котором накопленные предшественники протеиназ ингибируют рост вируса.

Мы решили исследовать механизмы ингибирования вирусов с помощью ARDP0006. Мы проверили, являются ли расщепления других полипротеинов, опосредованные NS2B/3, самопроцессингом, и будут ли предшественники, которые будут накапливаться в отсутствие саморасщепления, -транс--доминантными ингибиторами вируса дикого типа (WT). Наши результаты подтверждают гипотезу о том, что ингибирование одного конкретного события самопроцессинга приводит к транс -доминантному ингибированию репликации РНК. Это дает представление о ранее неизученной роли предшественников лихорадки денге в инфекции и предлагает подход к разработке антипротеиназных препаратов, преимущественно направленный на специфические внутримолекулярные расщепления.

Результаты

Ингибирование вируса денге и активности протеиназы с помощью ARDP0006.

Несмотря на тщательный скрининг и химический синтез, ARDP0006 остается одним из наиболее мощных ингибиторов роста вируса денге, нацеленных на NS2B/3, с зарегистрированным значением IC ₅₀, равным 4,2 мкМ (13). Добавление 25 мкМ ARDP0006 снижало выход внеклеточного и внутриклеточного вируса денге в 100 раз в течение одного 24-часового инфекционного цикла (рис. 1 D и E ). При такой концентрации ARDP0006 наблюдалась незначительная цитотоксичность ( SI Приложение , рис.С1).

ARDP0006 был идентифицирован как ингибитор расщепления флуорогенного субстрата протеиназой NS2B/3, неспособной к самопроцессингу (11). Мы исследовали, ингибирует ли это соединение также саморасщепление NS2B/3. С этой целью использовали минимальную саморасщепляющуюся протеиназу, названную NS2B/3 _pro (14). Эта конструкция содержит требуемый кофакторный домен NS2B (аминокислоты с 47 по 95), последние 10 остатков NS2B для реконструкции сайта расщепления (аминокислоты со 122 по 131) и протеазный домен NS3 (аминокислоты с 1 по 185). но не имеет трансмембранных доменов.

Для изучения расщепления NS2B/3 _pro необходимы условия, при которых можно было бы проводить кинетический анализ сразу после синтеза. С этой целью лизат ретикулоцитов кролика (RRL) использовали для получения NS2B/3 _pro, радиоактивно меченного [³⁵ S]метионином. Мутация активного сайта протеиназы, NS3-S135A, приводит к тому, что этот белок продуцируется только в качестве предшественника (фиг. 2 A , дорожка 1), и обеспечивает маркер для интактного NS2B/3 _pro. Сначала мы хотели установить, ингибирует ли ARDP0006 расщепление NS2B/3 при IC ₅₀ межмолекулярной протеиназной активности (432 мкМ) или вирусного ингибирования (4.2 мкМ). Активная версия эффективно транслировалась и расщеплялась на продукты после 90-минутной инкубации (фиг. 2 —, дорожка 2). ARDP0006 ингибировал это расщепление, о чем свидетельствует увеличение доли меченого предшественника протеиназы при повышении концентрации ингибитора (фиг. 2 A , дорожки 3-8). Однако IC ₅₀ для саморасщепления NS2B/3 _pro была высокой, сравнимой по величине с K _i для расщепления небольших субстратов in vitro (рис.2 В ).

Рис. 2.

Ингибирование NS2B/3 _pro in vitro с помощью ARDP0006. Анализ in vitro был разработан для измерения ингибирования внутримолекулярного расщепления NS2B-3 минимальной протеиназой денге. ( A и B ) Минимальная протеиназа продуцировалась в RRL в присутствии возрастающих концентраций ARDP0006 (от 50 мкМ до 2 мМ), а оставшийся предшественник был нанесен на график для определения IC ₅₀ саморасщепления in vitro ( n = 1). ( C и D ) Для мониторинга влияния ингибитора на скорость реакции был разработан анализ импульсной последовательности.Пиковое количество предшественников в RRL наблюдалось через 25-30 минут ( C , дорожки 1-3), и неактивный белок NS3-S135A надежно транслировался ( C , дорожка 4), но продукты расщепления не наблюдались. Виды с молекулярной массой 32 кДа, наблюдаемые на дорожке 4, часто являются фоном в этой системе. После мечения и трансляции добавление 100 мкМ ARDP0006 приводило к умеренному, но статистически значимому ингибированию расщепления ( D , пунктирная линия) по сравнению с реакциями, обработанными имитациями ( D , сплошная линия).Аппроксимация линии была выполнена с помощью GraphPad Prism v.7 с использованием уравнения зависимости логарифма [ингибитора] от отклика с переменным наклоном для определения кажущейся IC ₅₀ ( B ) и однофазных экспоненциальных функций затухания для соответствия данным в D . Значение P в D было определено путем сравнения соответствия индивидуальных и общих моделей с использованием дополнительного теста суммы квадратов F . n = 3 (штриховая линия) или 5 (сплошная линия).

Одно из объяснений наблюдения, что ARDP0006 является более эффективным ингибитором роста вируса, чем активность протеиназы NS2B/3, заключается в том, что, хотя он был идентифицирован как ингибитор NS2B/3, он ингибирует вирус за счет нецелевого эффекта. Учитывая, что идентификация мишеней для лекарств часто облегчается идентификацией устойчивых к лекарствам вариантов, мы попытались выделить вирус денге, устойчивый к ARDP0006, в культивируемых клетках ( SI Приложение ). Из двух независимых селекционных пулов не было индивидуальных или общих мутаций в NS2B/3, но возникла мутация A21V в соседнем NS4A. Эта замена валина крайне редко встречается в природных изолятах лихорадки денге, встречаясь только в 4 из 3871 последовательностей, депонированных в базе данных вариаций вируса Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (15).Реконструкция изолированной мутации A21V показала, что она не придает специфической устойчивости к ARDP0006, но увеличивает скорость роста вируса как в присутствии, так и в отсутствие ингибитора ( SI, Приложение , рис. S2). Мы пришли к выводу, что существует высокий барьер для устойчивости к ARDP0006, но могут появиться быстро растущие варианты, возможно, из-за нецелевых эффектов соединения.

Недавно было показано, что другая молекула, нацеленная на NS2B/3, названная NSC135618, обладает мощной антифлавивирусной активностью (16).Мы проверили активность этого соединения с помощью анализов, описанных для ARDP0006. Мы определили значения IC ₅₀ вирусного и внутримолекулярного расщепления, равные 1,7 и 490 мкМ, соответственно ( SI, Приложение , рис. S3), что отражало расхождение в этих значениях, обнаруженное для ARDP0006. Таким образом, оба ингибитора протеиназы NS2B/3 в 100 раз эффективнее ингибируют рост вируса, чем ферментативная активность вирусной протеиназы, что повышает вероятность того, что оба соединения действительно ингибируют рост вируса денге за счет ингибирования протеазы, но потенциально сложными механизмами. .

Для наблюдения за кинетикой и эффективностью расщепления NS2B/3 _pro были проведены импульсные эксперименты. Для минимальной протеиназы временной ход трансляции показал, что предшественник и продукт могут быть легко определены количественно через 25-30 минут (рис. 2 C ). Были проведены импульсные анализы, в которых белок транслировался радиоактивно меченым метионином в течение 30 минут с последующим добавлением избытка немеченого метионина и либо ARDP0006, либо его растворителя DMSO. Сплошная линия на рис.2 D количественно определяет разложение меченого предшественника NS2B/3 _pro. Величина наблюдаемого ингибирования была статистически значимой, хотя и незначительной, как и ожидалось для IC ₅₀ ~620 мкМ (рис. 2 D и таблица 1). Концентрация 100 мкМ была использована, потому что она находится между IC ₅₀ для ингибирования вирусов и протеиназ и обеспечивает ориентир для последующих исследований отдельных сайтов расщепления.

Таблица 1.

Скорость обработки протеиназных конструкций

Три расщепления NS2B/3 являются исключительно внутримолекулярными.

В WNV соединение NS2B-3 обрабатывается исключительно внутримолекулярно (3). Мы предположили, что это относится и к вирусу денге и что, учитывая гибкость протеиназного домена, другие расщепления NS3 также могут подвергаться самопроцессингу. Чтобы проверить это, были проведены эксперименты по смешиванию каталитически активных и неактивных версий NS2B/3 _pro. После 120 мин инкубации S135A-NS2B/3 _pro оставался нерасщепленным (фиг. 3 B , дорожка 1). Как и прежде, расщепление меченого активного NS2B/3 _pro было эффективным и практически полным к 120 мин (фиг.3 Б , переулок 3). Однако, когда [ ³⁵ S]метионин-меченая каталитически неактивная протеиназа смешивалась с немеченой активной протеиназой, специфических продуктов расщепления не наблюдалось (фиг. 3 B , дорожка 2). Следовательно, расщепление соединения денге NS2B-3 происходит исключительно внутримолекулярно.

Рис. 3.

Внутримолекулярное расщепление NS3-проксимальных полипротеиновых соединений. ( A ) Схема минимальной протеиназы NS2B/3. Черная стрелка указывает на сайт расщепления; S135 указывает на каталитический серин, мутировавший с образованием неактивной протеиназы.( B ) Активные (WT) и неактивные (S135A) минимальные протеиназы транслировались в реакциях RRL по отдельности или вместе, как указано, в течение 120 мин в присутствии (красные символы) или в отсутствие (черные символы) [ ³⁵ S]метионина и визуализировали с помощью SDS/PAGE. ( C ) Схема протеиназных конструкций NS2B/3/4A, включая полноразмерный NS3 и остатки с 1 по 49 NS4A. Обозначается как A . ( D ) Активные (WT) и неактивные (S135A) протеиназы транслировали и смешивали, как в B .Звездочки в A и C обозначают укорочения белков, описанные в тексте.

Два других соединения расщепления встречаются внутри или по бокам NS3: NS3 _int и NS3-4A. Чтобы проверить, могут ли они расщепляться межмолекулярно, мы создали удлиненные версии NS2B/3 _pro, которые включали геликазный домен NS3 и первые 49 остатков NS4A (рис. 3 C ). Неактивный меченый NS2B/3/4A сам по себе давал интактный предшественник (фиг. 3 D , дорожка 1).При добавлении активной немеченой протеиназы не было обнаружено никаких дополнительных полос или наблюдаемого исчезновения предшественника (фиг. 3 D , дорожка 2). Это контрастирует с активной меченой протеиназой, которая превращалась из одного предшественника в ожидаемые продукты (рис. 3 D , дорожка 3), демонстрируя, что все три проксимальных расщепления NS3 (NS2B-3, NS3 _int , и NS3-4A) являются строго внутримолекулярными. Мы пришли к выводу, что один или несколько из них могут быть специально нацелены на ARDP0006.

Ингибирование расщепления NS2B-3, NS3

_int и NS3-4A с помощью ARDP0006.

Для мониторинга эффекта ингибирования ARDP0006 в этих сайтах было полезно упростить схемы расщепления (рис. 4 A ). Для создания белка, в котором расщеплялся только сайт NS2B-3, были сделаны мутации, разрушающие соединения расщепления NS3 _int и NS3-4A (рис. 4 A ). Расщепление умеренно, но значительно ингибировалось 100 мкМ ARDP0006 (рис. 4 B и таблица 1).

Рис. 4. NS3-проксимальные расщепления

чувствительны к ингибированию ARDP0006. ( A ) Реакции лизата ретикулоцитов, запрограммированные плазмидами, кодирующими NS2B/3/4A, которые содержат следующие мутации: NS3-S135A (неактивный; черный), NS3-G459L/NS4A-S1L (оба сайта расщепления; оранжевый), NS4A-S1L (соединение NS3-4; фиолетовый) или NS3-G459L (соединение NS3 _int; красный) инкубировали в течение 90 мин в присутствии [³⁵ S]метионина, и продукты визуализировали с помощью SDS/PAGE для подтверждения расщепления. узоры.( B – D ) Кинетику деградации продуктов гена из A отслеживали в отсутствие (сплошные линии) и в присутствии (пунктирные линии) 100 мкМ ARDP0006. Аликвоты брали в указанное время после охоты с немеченым метионином и лекарственным средством. Протеолиз моделировали как одноэкспоненциальную реакцию распада с базовой линией, ограниченной 0. Кинетические параметры в присутствии ингибитора статистически значимо различались для всех конструкций ( B – D ; n = 4, P = 0 .0033; n = 2, P = 0,0003; n = 4, P < 0,0001; соответственно), как определено дополнительным тестом суммы квадратов F .

Мутант S1L способен к расщеплению по NS2B-3 и NS3 _int . В этом случае обработка была значительно и резко ингибирована 100 мкМ ARDP0006 (рис. 4 C и таблица 1). Мы пришли к выводу, что расщепление внутренних соединений NS3, когда NS3 все еще соединен с NS4A, предпочтительно восприимчиво к ARDP0006 и может захватывать NS3 в негибкой конформации. Неспособность расщепить соединение NS2B-3 в присутствии мутации S1L свидетельствует о том, что эти расщепления не являются независимыми.

Мутант G459L не расщепляется по внутреннему сайту NS, но может расщепляться по соединениям NS2B-3 и NS3-4A. ARDP0006 замедлял обработку этой конструкции примерно в той же степени, что и для одного NS2B/3 _pro (фиг. 2 D и 4 B и D и таблица 1) _. Мы пришли к выводу, что отсутствие независимости N-концевых, внутренних и С-концевых реакционных участков может привести к тому, что временной порядок расщепления различается в полипротеинах с различной мутацией.Важно отметить, что сайт расщепления NS3 _int очень чувствителен к ингибированию, при этом чувствительность к ARDP0006 сравнима с чувствительностью самого вируса.

NS3-G459L является доминирующим ингибитором роста вируса дикого типа.

Чтобы определить, ингибируют ли предшественники лихорадки денге рост вируса, мы отслеживали рост вируса дикого типа в присутствии вариантных геномов либо с определенными дефектами в сайтах расщепления протеиназы, либо с общим ингибированием активности протеиназы. Все мутации, показанные на рис.5 A оказались смертельными для вируса, который их содержал ( SI Приложение , Таблица S1). Мы проверили, способен ли какой-либо из этих мутантных геномов доминантно ингибировать вирус WT, как можно было бы предсказать, если бы мутация вызывала накопление ингибирующего предшественника при трансляции вводимой РНК.

Рис. 5. Геном мутанта

с внутренним расщеплением NS3 представляет собой транс -доминантный ингибитор. ( A ) Показана схема геномной вирусной РНК с расположением сайта внутреннего расщепления NS3-G459L, NS3-4A NS4A-S1L и протеазо-мертвых мутаций NS3-S135A, показанных красным, фиолетовым и зеленым цветом соответственно.( B ) ВРНК дикого типа котрансфицировали равными массами дрожжевой тРНК, мутантной вРНК NS3-G459L, мутантной вРНК NS4A-S1L или мутантной вРНК NS3-S135A, и выход вируса определяли через 48 часов после трансфекции ( n = 4). ( C ) Конструкция репликона люциферазы лихорадки денге, в которой отсутствуют структурные белки. ( D ) Репликон РНК (1 мкг на лунку) котрансфицировали в 24-луночные планшеты с равными массами вРНК WT, NS3-G459L, NS4A-S1L или NS3-S135A, и сигнал люциферазы измеряли в указанные моменты времени ( н = 4).RLU, относительная световая единица. ( E ) РНК с неактивным полимеразным репликоном (1 мкг на лунку) котрансфицировали в 24-луночные планшеты с равными массами вРНК WT, NS3-G459L или NS3-S135A, и сигнал люциферазы измеряли в указанные моменты времени ( n = 4). ( F ) РНК репликона положительной цепи была обнаружена с помощью специфичной для цепи RT-qPCR. ( G ) РНК репликона с отрицательной цепью была обнаружена с помощью специфичной для цепи RT-qPCR ( n = 2). ( H ) Множественное выравнивание последовательностей вируса денге серотипов 1-4, JEV и вируса ВЗН, регистрационные номераACF49259, P29990, AAA99437, AAX48017, P32886 и P14335 соответственно. Белковые последовательности были получены из NCBI и выровнены Clustal Omega с использованием Lasergene MegAlign Pro. нс, не имеет значения. * Р < 0,05, ** Р < 0,01, **** Р < 0,0001.

При котрансфекции равными количествами вирусной РНК (вРНК) WT и NS4-S1L рост вируса WT не нарушался (рис. 5 B ). Однако котрансфекция вРНК дикого типа и NS3-G459L снижала рост вируса в 100–1000 раз (рис.5 В ). Эта мутация должна обеспечивать накопление интактного NS3, возможно, все еще связанного с фланкирующими последовательностями. Чтобы определить, вызывает ли ингибирование всех расщеплений NS2B/3 также -транс--доминантное ингибирование вируса WT, мы проверили эффект мутации активного сайта протеиназы NS3-S135A. При совместной трансфекции WT и вРНК NS3-S135A мы наблюдали значительное, но относительно умеренное ингибирование вируса WT (фиг. 5 B ). Поэтому мы предполагаем, что именно накопление специфических предшественников, а не общее ингибирование протеиназы, ответственно за этот доминирующий эффект.

Чтобы определить внутриклеточную стадию, которая преимущественно ингибируется геномом NS3-G459L, мы проверили влияние мутантных вРНК на котрансфицированный репликон WT (рис. 5 C ). Этот репликон кодирует люциферазу Renilla и неструктурные белки денге, но не содержит структурных белков денге (17). Таким образом, сигнал люциферазы отражает только трансляцию и репликацию трансфицированной РНК. Вирусные геномы, которые были WT или содержали мутацию NS4-S1L, не оказывали заметного влияния на сигнал люциферазы репликона, но вирусная РНК, содержащая мутацию NS3-G459L, оказывала сильное ингибирующее действие (рис.5 Д ). Это ингибирование может быть результатом ингибирования трансляции репликона, амплификации РНК или того и другого. Чтобы определить, оказывает ли геном NS3-G459L транс--доминантное ингибирование трансляции, была проведена котрансфекция репликона, который содержал мутацию активного сайта полимеразы (GDD), с WT и мутантными геномными вирусными РНК (фиг. 5 E ). В этом эксперименте весь сигнал люциферазы происходит от начальных событий трансляции и со временем уменьшается в отсутствие нового синтеза РНК. На продукцию люциферазы из репликона GDD не влияло присутствие вРНК NS3-G459L или NS3-S135A (рис. 5 E ). Следовательно, мутация NS3-G459L не влияет на ранний синтез вирусного белка.

Чтобы определить, ингибирует ли доминантный мутантный геном NS3-G459L синтез отрицательной цепи (и, следовательно, также синтез положительной цепи) или только синтез положительной цепи, мы провели специфичную для цепи RT-qPCR для измерения обеих цепей WT и GDD. репликоны (рис. 5 F и G ).Во всех условиях количество измеренной РНК было нормализовано к значениям, наблюдаемым только для репликона WT. Количество РНК репликона положительной цепи, обнаруженное при котрансфекции с доминантным мутантом NS3-G459L, было неотличимо от количества, обнаруженного для одного репликона GDD, что указывает на сильное ингибирование синтеза положительной цепи (фиг. 5 F ). Напротив, количество РНК репликона с отрицательной цепью было значительно больше, чем для одного репликона GDD (рис. 5 G ), что указывает на то, что доминантный мутант NS3-G459L допускает синтез отрицательной цепи и, следовательно, специфически ингибирует синтез положительной цепи.

NS3 помимо протеиназной активности выполняет несколько ферментативных функций. NS3-G459 находится в области NS3, которая, как известно, важна для активности РНК-хеликазы, АТФазы и РТФазы. Этот регион является высококонсервативным, и сам G459 имеет 100% идентичность между всеми четырьмя серотипами вируса денге, а также вирусом японского энцефалита (JEV) и ВЗН (рис.5 Н ). Чтобы определить, является ли -транс--доминирование мутации NS3-G459L результатом нарушения непротеиназной активности, мы проверили эффект четырех различных мутаций, которые, как известно, разрушают некоторую комбинацию этих других активностей (7, 18, 19). Доминантное ингибирование не коррелировало простым образом с мутациями ни в одной из этих функций ( SI, Приложение , рис. S4). Например, мутантные геномы NS3-K199A и NS3-K396A с нарушенными функциями хеликазы не ингибировали доминантно рост котрансфицированной РНК дикого типа, но геном NS3-R376A с мертвой геликазой был мощным транс--доминантным ингибитором ( SI Приложение , рис. С4 Б ). Мы исследовали, происходит ли это -транс--доминирование по механизму, сходному с механизмом генома NS3-G459L, возможно, посредством непредвиденного воздействия на активность протеиназы. Однако, в отличие от мутации G459L, мутант NS3-R376A демонстрировал нормальный процессинг белка ( SI Приложение , рис. S4 C ) и не проявлял транс--доминантного ингибирования синтеза РНК репликона ( SI Приложение , рис. С4 Д ). Таким образом, -транс--доминантное ингибирование геномом NS3-R376A, вероятно, является эффектом, отличным от эффекта G459L и более позднего инфекционного цикла денге.Интересно, что мутантный белок NS3-R376A имеет повышенную аффинность к двухцепочечной РНК (7), что делает возможным, что такой эффект усиления функции способствует его -транс--доминированию. Таким образом, ни один из дефектных по геликазе вирусов не обладает фенокопией -транс--доминантного эффекта мутации NS3-G459L. Вполне вероятно, что есть много аллель-специфических дефектов усиления функции, которые еще предстоит изучить. Здесь мы показываем, что специфическое ингибирование расщепления внутреннего сайта расщепления NS3 либо фармакологически, либо генетически приводит к сильному и, в случае мутации G459L, -транс--доминантному ингибированию репликации вирусной РНК.

Обсуждение

Белки NS3 денге и других флавивирусов обладают несколькими ферментативными активностями, опосредованными отдельными доменами. Кроме того, NS3 взаимодействует с белками-хозяевами, такими как STING и MAVS, чтобы нарушить передачу сигналов врожденного иммунитета. Мы показали, что три различных NS2B/3-опосредованных расщепления происходят исключительно внутримолекулярно, что требует конформационной гибкости протеиназного домена. Мы обнаружили, что отмена одного из этих расщеплений приводит к накоплению предшественника, который -транс--доминантно ингибирует все вирусы в одной и той же клетке.Эти результаты идентифицируют механизм ингибирования вируса и обеспечивают путь для подавления роста лекарственно-устойчивых вариантов.

Быстрое появление лекарственной устойчивости является основным препятствием для разработки эффективных противовирусных препаратов для всех РНК-содержащих вирусов, включая лихорадку денге. Низкая точность полимеразы и быстрое время генерации приводят к большому разнообразию популяции, включая потенциально ранее существовавшие устойчивые варианты для любого данного препарата. Типичные стратегии ингибирования роста вируса также предусматривают сильное давление отбора, что позволяет проводить быстрый отбор в популяции вирусов, заражающих хозяина.Комбинированная лекарственная терапия снижает вероятность образования вируса, содержащего мутации, придающие устойчивость ко всем компонентам противовирусной смеси. Другой подход к подавлению лекарственной устойчивости состоит в том, чтобы смириться с неизбежным появлением лекарственно-устойчивых вариантов, но выбрать лекарственную мишень, которая предотвращает их рост. Например, нацеливание на олигомерные вирусные белки может уменьшить выбор лекарственно-устойчивых вариантов из-за смешивания белков как из лекарственно-устойчивых, так и из лекарственно-чувствительных геномов (20). Капсиды являются очевидными мишенями для этой противовирусной парадигмы; однако возможно создать другие деструктивные олигомеры белков с высокой степенью взаимодействия.

Процессинг вирусных полипротеинов точно рассчитан по времени для оптимального роста вируса. Неправильно обработанные вирусные предшественники мешают росту и патогенезу вируса. У полиовируса мутации, препятствующие расщеплению на стыке VP1/2A, являются -транс--доминантными, вероятно, потому, что нерасщепленный предшественник, содержащий VP1 и капсидные белки, разрушает сборку вируса (21).При гепатите С увеличение скорости расщепления предшественника NS4B-5 путем манипулирования сайтом узнавания ингибирует репликацию вирусной РНК (22). Кроме того, вирус Синдбис демонстрирует изысканную временную регуляцию протеолиза. Нерасщепленный полипротеин P123 необходим для синтеза минус-цепи, но расщепление P123 необходимо для эффективного синтеза плюс-цепи, и относительное количество этих видов белков регулируется вариациями субстратной специфичности (23, 24).

NS2B-3 Расщепление.

N-концевой домен белка NS2B связан с мембраной, и его С-концевая последовательность действует как кофактор для протеиназного домена NS3.NS2B остается связанным с NS3 после расщепления соединения, и активность специфической протеиназы значительно увеличивается (25). Кроме того, гидрофобные области NS2B должны связывать этот холофермент с внутриклеточными мембранами, на которых происходит репликация вируса (26). Было показано, что расщепление вируса денге NS2B-3 происходит исключительно внутримолекулярно, даже несмотря на то, что он может быть воссоздан биохимически в транс (27). Учитывая, что расщепление NS2B-3 происходит быстро и увеличивает активность протеиназы (4, 28), вероятно, оно ограничивает скорость процессинга белка.Поэтому мы были удивлены тем, что расщепление NS2B-3 не ингибировалось более резко под действием ARDP0006.

NS3-4A Расщепление.

NS4A содержит несколько связанных с мембраной последовательностей, которые вызывают искривление и перестройку мембраны. Мы наблюдали, что расщепление в месте соединения NS3-4 вируса денге является строго внутримолекулярным. Это также было зарегистрировано для родственного пестивируса, вируса классической чумы свиней (29). Когда соединение NS3-4 не обрабатывается, не наблюдается наблюдаемого -транс--доминантного эффекта, что свидетельствует о том, что полученные предшественники, которые обязательно содержат NS4A, не мешают росту вируса.Как и в случае соединения NS2B-3, ARDP0006 лишь умеренно ингибирует расщепление между NS3 и NS4A. Геномы, кодирующие нерасщепляемые сайты NS3/4A, не проявляют ингибирующего действия на другие вирусные геномы в той же клетке.

NS3 Внутренний раскол.

Внутреннее расщепление NS3 наблюдалось у лихорадки денге и многих близкородственных вирусов (3, 6, 29, 30), но его значение оставалось загадочным. В результате этого расщепления образуется протеиназа NS2B/3, освобожденная от связи с мембраной NS4A. Мутации, устраняющие этот сайт расщепления, являются летальными, что может быть связано либо с отсутствием расщепления, либо с нарушением активности хеликазы. Мы показали, что этот контакт обрабатывается строго внутримолекулярным образом. Из трех внутримолекулярных процессированных сайтов внутри и по бокам NS3, это соединение расщепления наиболее сильно ингибируется ARDP0006 (Fig. 4 and Table 1). Когда внутреннее соединение NS3 ингибируется ARDP0006, расщепление соединения NS2B-3 также ингибируется. Это указывает на аллостерические эффекты при ингибировании внутреннего расщепления NS3, которые предотвращают доступ к NS2B-3 и, возможно, другим соединениям NS3. Что наиболее важно, вирусные геномы, которые устраняют это событие самопроцессинга trans , доминантно ингибируют синтез положительной цепи РНК геномов WT, присутствующих в той же клетке, что напоминает эффект предшественников на репликацию вируса Синдбис.Мы предполагаем, что противовирусный эффект ARDP0006 обусловлен его специфическим ингибированием внутреннего расщепления в NS3, которое также устраняется мутацией G459L, и что в обоих случаях это приводит к накоплению транс--доминантных предшественников NS3, связанных с фланговые последовательности.

Мы предполагаем, что эффективной ингибиторной стратегией для вирусов с саморасщепляющимися полипротеиновыми предшественниками будет сначала идентифицировать расщепления, которые, если они не произведены, дают транс -доминантные ингибиторы.При ингибировании этого события расщепления накопление ингибирующих предшественников будет блокировать репликацию чувствительных вирусов и, скорее всего, любых геномов, устойчивых к лекарственным средствам, по мере их возникновения в инфицированных клетках.

Методы

Плазмиды.

Плазмида экспрессии протеиназы денге pGEX-NS2B-3 _prot, в которой трансмембранный домен в NS2B был делетирован, была сконструирована, как описано ранее (14). Плазмиды NS2B/3/4A были получены из этой плазмиды путем расщепления NsiI/BamHI и опосредованной ДНК-лигазой T4 (New England Biolabs) вставки ампликонов NS3-4A (нуклеотиды с 7473 по 13699) с добавлением сайта BamHI к 3′-концу.кДНК инфекционного клона штамма 16681 вируса денге 2 использовали в качестве исходной плазмиды для всех конструкций (31). Все мутации вводили с использованием наборов для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Agilent Technologies).

Вирусы и клеточные культуры.

В этом исследовании использовали штамм 16681 вируса денге. Подробные методы см. в приложении SI . Клетки BHK-21 выращивали при 37 °C с 5% CO ₂ в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% бычьей сыворотки, 1 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина и 10 мМ Hepes.Для анализа бляшек вирусам давали адсорбироваться на клетках BHK-21 в течение 1 часа при 37 °C, покрывая 1 мл DMEM плюс 0,375% (вес/объем) бикарбоната натрия и 0,8% Aquacide II, выращивали в течение 7 дней, фиксировали. (5% формальдегида) и окрашенные (0,1% кристаллический фиолетовый).

ARDP0006 Лечение.

1,8-Дигидрокси-4,5-динитроантрахинон (Sigma-Aldrich) растворяли в ДМСО и добавляли в среду для культивирования клеток за 30 мин до инфицирования. Внеклеточный вирус собирали из клеточного супернатанта. Внутриклеточный вирус собирали в среде DMEM путем промывки клеток (0. 5 М NaCl, 10 мМ Трис), замораживание-оттаивание (3 раза) и центрифугирование (5 мин, 3200 × г ).

Анализы расщепления протеиназами.

Белковые конструкции денге экспрессировали в RRL (T _N T-связанный T7; Promega BioSystems), запрограммированном с помощью 1 мкг ДНК/50 мкл и помеченном 20 мкКи 1-[³⁵ S]метионина (EasyTag; PerkinElmer). Если не указано иное, реакции радиоактивного импульса-преследования инкубировали при 30 °C в течение 30 минут перед добавлением 1-метионина (конечная концентрация 1 мМ) и ДМСО (конечная концентрация 2%).Для обработанных образцов ARDP0006 растворяли в ДМСО. Аликвоты немедленно разбавляли буфером для образцов Лэммли (4 объема, 1 × конечный), денатурировали (60 °C, 10 мин) и разделяли с помощью SDS/PAGE. Гели сушили в вакууме (80°C, 120 мин) и подвергали воздействию низкоэнергетического люминофорного экрана (Molecular Probes). Количественную оценку белка проводили с использованием программного обеспечения ImageQuant TL 8. 1 (GE Healthcare Life Sciences). Для анализа межмолекулярного расщепления протеиназами конструкции NS2B/3 и NS2B/3/4A экспрессировали либо с 1-[³⁵ S]метионином, либо без него, как указано выше.Меченые реакции отгоняли избытком немеченого L-метионина, смешивали с немечеными реакциями трансляции (1:1) и инкубировали в течение 90 мин. Реакции останавливали и визуализировали, как указано выше.

Котрансфекции.

Котрансфекцию проводили на клетках BHK-21 в 24-луночных планшетах с добавлением 1 мкг каждой РНК на лунку (Lipofectamine 3000; Thermo Fisher Scientific). Раствор для трансфекции удаляли через 2 часа при 37°С, клетки дважды промывали и инкубировали в течение 48 часов.

Анализы люциферазы.

Ранее была описана эффективная система репликонов денге (32). Этот репликон получен из штамма 16681 (17) и экспрессирует люциферазу Renilla (подарок Яна Каретта, Медицинская школа Стэнфордского университета). Трансфекцию репликона проводили, как описано выше. Клетки собирали и анализировали в соответствии с протоколом системы анализа люциферазы Renilla (Promega BioSystems) с использованием набора люминометров для 10-секундной интеграции сигнала (GloMax; Promega BioSystems).

RT-qPCR для конкретных цепей.

RT-qPCR, специфичная для вирусных цепей, была проведена на основе ранее описанных стратегий (33, 34). Тотальную РНК из клеток BHK-21 собирали через 26 ч после трансфекции. Реакции обратной транскрипции выполняли с помощью SuperScript II RT (Thermo Fisher Scientific) и 200 нг РНК, праймированных репликон-специфическими праймерами tagF Pos или tagF Neg, с получением кДНК для последовательностей репликона с положительной или отрицательной цепью. Эти кДНК разбавляли водой в 25 раз и проводили количественную ПЦР с праймерами TAG и Rev Pos или Rev Neg с использованием Platinum SYBR Green (Thermo Fisher Scientific) на системе ПЦР в реальном времени Applied Biosystems 7300 (Thermo Fisher Scientific).Последовательности праймеров приведены в приложении SI , таблица S2.

Благодарности

Мы благодарим Drs. Scott Crowder, Gabriele Fuchs, Caleb Marceau и Poornima Paramaswaram за участие в начальных этапах этого проекта, а также Jan Carette за реагенты и советы. Мы ценим критическое чтение Жасмин С. Мошири и Питера Сарноу. Эта работа была поддержана премией директора NIH Pioneer Award (KK), Национальным институтом общих медицинских наук наград NIH T32GM007276 и U19AI109662, а также финансированием программы Stanford SPARK.Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Сноски

Вклад авторов: Д.А.К., Р.М. и К.К. проектное исследование; Д.А.К., Р.М. и К.К. проведенное исследование; D.A.C., R.M. и C.M.N. предоставил новые реагенты/аналитические инструменты; Д.А.К., Р.М. и К.К. проанализированные данные; и D.A.C. и К.К. написал бумагу.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта статья является прямой отправкой PNAS. П.-Ю.С. является приглашенным редактором по приглашению редколлегии.
Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1805195115/-/DCSupplemental.

Copyright © 2018 Автор(ы). Опубликовано ПНАС.

Фортранс для похудения

Фортранс – медицинский препарат, который назначают больным перед любыми полостными операциями по очистке кишечника.Однократный его прием можно приравнять к действию нескольких клизм. Фортранс назначают также при кишечной непроходимости, когда существует угроза интоксикации больного. Однако врачи не рекомендуют принимать фортранс для похудения. Это связано с рядом последствий:

В результате очистки кишечника фортрансомами возникает атония. То есть полная деградация основной функции кишечника – эвакуаторной. Другими словами, после такого похудения вы потеряете возможность ходить в туалет без слабительного.
Из кишечника вместе с калом вымывается вся микрофлора и даже после приема фортранса ваш кишечник не может полностью восстановить нормальную флору и функцию всасывания питательных веществ.
Возможны деформации толстой и прямой кишки, а также геморрой.
Из-за того, что организм будет недополучать витамины и микроэлементы (см. пункт 2), начнут выпадать волосы, ломаться ногти и шелушиться кожа.
При употреблении сложных углеводов, а также пищи, богатой клетчаткой, начнется вздутие живота и метеоризм. Кишечник не справляется с перевариванием такой «сложной» пищи.
Выполнение любых физических упражнений станет практически невозможным из-за слабости.

Однако, несмотря на все это, слабительное Фортранс пользуется огромной популярностью среди тех, кто отчаянно хочет похудеть любой ценой. Посмотрим, как достигается эффект похудения на фортрансе:

Фортранс блокирует воду и задерживает ее в кишечнике;
в итоге вся вода (1.5-2л) не пройдет по кишечнику, а «застрянет», и с бешеной скоростью начнет проталкивать каловые массы;
процесс их «выхода» может занять от 6 до 12 часов;
потеря в весе 1,5 — 3кг произойдет за счет абсолютной очистки кишечника от всех каловых масс, при этом жир не сгорит и никуда не денется.

Теперь поговорим о том, сколько времени занимает очистка кишечника фортрансомами.

Первый день вы проведете дома, так как часов 6-12 будете бегать в туалет.В первый день производители рекомендуют только пить воду, есть – запрещено. На следующий день вы вряд ли сможете встать с постели, потому что после «глобальной чистки» у вас будет невиданный упадок сил. В этот день вам нужно будет отварить 1 стакан риса и разделить его на 5-6 приемов пищи. Любая другая пища может вызвать приступы диареи. Далее на протяжении недели или даже двух вам нужно будет принимать бифидо- и лактобактерии, так как фортрансом будет вымыта вся кишечная микрофлора.

Побочные эффекты

Фортранс не имеет побочных эффектов, у него есть только последствия, о которых мы говорили в начале статьи. Еще можно добавить то, что ближайшие полгода вы будете сидеть на специальной диете вовсе не для того, чтобы похудеть, а для того, чтобы не похудеть. Ваш метаболизм будет замедлен, периодически будет возникать диарея, витамины и минералы не смогут нормально усваиваться даже через несколько месяцев после очищения.

Правила приёма

Если, вопреки всему вышесказанному, вы всё-таки хотите рискнуть (может и повезёт — это как раз правильное выражение для фортранса!), то опишем, как сдать фортранс на вес потеря.

Самый удобный способ — фортранс в порошке. Разводим его в литре воды, и выпиваем за 5 приемов по 200мл. Однако, учитывая, что фортранс, ко всему прочему, имеет еще и весьма неприятный привкус, у вас могут появиться позывы к рвоте. Так что избавьтесь на остаток дня от унитаза от других членов семьи, а тазик запаситесь на случай рвоты от фортранса.

А если честно, те же 2 кг можно сбросить и более гуманным способом. Например: устроить разгрузочный день на овощах или фруктах, попить зеленого чая, сходить в баню и побегать в парке.