Желтая вода после фортранса: Почему выходит вода ярко-желтого цвета, фортранс, желтая вода, вопрос врачу от 04.07.2018 — ответов врачей: 2

Содержание

инструкция, отзывы и последствия, цена

Периодическое очищение кишечника фортрансом необходимо ввиду того, что под влиянием ряда факторов (нарушение правил здорового питания, некачественные продукты, плохая экологическая обстановка, вредные условия производства и т.п.), в нашем организме скапливается масса вредных веществ. Оседает вся эта «грязь» на ворсинках кишечника. И наша задача в этом случае – выбрать действительно хороший и проверенный метод, который мягко выведет из кишечника шлаки, токсины, соли тяжелых металлов и радионуклиды.

Состав фортранса

Эффективность чистки фортрансом обусловлена составом препарата. В одном пакетике этого сильнодействующего слабительного лекарства содержатся следующие компоненты:

  • макрогол 4000 – 64 г
  • безводный сульфат натрия – 5,7 г
  • бикарбонат натрия – 1,68 г
  • хлорид натрия – 1,46 г
  • хлорид калия – 0,75 г

Вспомогательные ингредиенты: ароматическая добавка (вкус пассифлоры), сахарин натрия.

Как пить фортранс для очистки кишечника

Способ применения фортранса достаточно прост. Берете 3-4 пакетика с порошком и разводите в соответствующем количестве негазированной воды (в трех или четырех литрах). Это количество жидкости необходимо выпить за 3-4 часа. Пьется лекарство порционно – по 250 мл за один раз. Эффект наступает уже спустя час и длится порядка 6-10 часов.
Важные правила:

  1. За сутки до начала приема лекарства фортранс ваше меню должно состоять из легко усвояемых продуктов – каши, омлет, фруктовое желе (но без кусочков фруктов).
  2. В день процедуры разрешается позавтракать омлетом, а затем употреблять только обезжиренный мясной бульон, соки, чай.
  3. Необходима адаптация после фортранса – весь следующий день вы должны пребывать в состоянии покоя, не заниматься физическими и умственными нагрузками и отварной рис.

Очищение кишечника фортрансом: отзывы

Подавляющая часть людей, использовавших это лекарство, отмечают его жуткие вкусовые качества. Не всем удается выпить необходимое количество жидкости за установленное время без появления рвотных позывов. Тем не менее, результативность очистки кишечника фортрансом практика доказывает.

Препарат пользуется уважением и у медиков. Как правило, его назначают в качестве подготовки к ирригоскопии, колоноскопии, лапароскопии. А вот фортранс для похудения врачи использовать не рекомендуют, да и результаты такого способа снижения веса нельзя назвать эффективными.

Аналоги фортранса

Ввиду того, что средство характеризуется не очень приятным вкусом, то вам будет интересно узнать об аналогах препарата, которые окажутся не менее эффективными. Заменить фортранс способны лавакол, дюфалак, флит фосфо-сода и некоторые другие продукты фармацевтики.

Многие также гадают, что купить в аптеке — фортранс или форлакс. Это совершенно разные препараты, несмотря на созвучность названий. Первый оказывает мощное слабительное действие, а второй способствует лишь легкому, поверхностному очищению кишечника (используется просто для того, чтобы избавиться от возникшего запора).

В качестве своеобразного аналога можно назвать и кружку Эсмарха. Но на вопрос о том, что лучше – фортранс или клизма, ответ однозначен. Конечно, слабительный препарат. В отличие от клизмы он чистит кишечник полностью, а не только часть толстой и всю прямую кишку. К тому же, куда проще без посторонней помощи развести порошок в воде и выпить, нежели самостоятельно ставить очистительную клизму.

Фортранс: противопоказания и последствия

У препарата существует ряд противопоказаний:

  • детский возраст (до 15 лет)
  • кишечная непроходимость
  • проблемы с сердцем
  • желудочно-кишечные заболевания
  • обезвоживание организма
  • непереносимость компонентов

Среди неприятных и опасных последствий, которые могут возникнуть после увлечения чисткой кишечника фортрансом (при его регулярном, а не разовом применении), выделяют:

  • атонию кишечника (невозможность опорожняться самостоятельно, без использования слабительного)
  • выпадение волос, кровоточивость десен, ломкость ногтей (как следствие серьезных нарушений процесса усвоения из пищи витаминов, минералов, солей)
  • вздутие живота, повышенное газообразование даже после употребления самых безобидных продуктов
  • невозможность организма усваивать грубую пищу (результат – механические повреждения кишечника, геморрой, трещины)
  • замедление всем обменных процессов
  • диарея

Так что, следует понимать, что очищение фортрансом кишечника должно быть обосновано медицинскими показаниями.

Лучше не использовать средство для самолечения, а обговорить его использование со своим врачом.

Колоноскопия под наркозом и без

Колоноскопия – это безопасное эндоскопическое исследование кишечника с помощью гибкого зонда, оснащенного видеокамерой. Ни один из альтернативных методов диагностики не дает более точной и достоверной информации. Только колоноскопия позволяет осмотреть все отделы толстого кишечника и выявить любые патологические изменения: полипы, язвы, предраковые состояния, опухоли.

Диагностическая колоноскопия: показания и противопоказания

Без показаний данный вид обследования не проводится. Если врач дает направление на колоноскопию, значит, для этого есть серьезные основания. Отказываться от процедуры не стоит. Во-первых, для постановки или уточнения диагноза без нее не обойтись, во-вторых – на современных аппаратах и с использованием анестезирующих средств колоноскопия проходит быстро и безболезненно.

Выделяют 3 основные группы показаний к проведению исследования:

  1. Диагностика причин неприятных симптомов. Есть ряд клинических проявлений, при наличии которых колоноскопию откладывать нельзя. Это регулярные боли в животе, нарушения стула, кровотечения из прямой кишки, гной или слизь в кале, беспричинная потеря веса. Эти состояния могут говорить не только об опасных заболеваниях, поэтому для выявления их причин необходимо тщательное обследование.
  2. Скрининг в профилактических целях. Чтобы своевременно выявить скрытые патологии, которые никак себя не проявляют, проводятся скрининговые процедуры. Такие обследования рекомендуется периодически проходить пациентам из группы риска: мужчинам и женщинам после 40 лет и людям с наследственной предрасположенностью к онкологическим заболеваниям.
  3. Контроль после лечения. Диагностическая процедура проводится для оценки состояния пациента после терапевтического либо хирургического лечения, чтобы убедиться в отсутствии рецидивов и осложнений.

Колоноскопию не назначают беременным женщинам. Кроме того, исследование не проводят при нарушении свертываемости крови, легочной и сердечной недостаточности, гипертонии, перитоните, перфорации кишечника.

Какие болезни можно диагностировать с помощью колоноскопии?

Благодаря своевременно проведенной колоноскопии врачи могут обнаружить многие опасные нарушения:

  • болезнь Крона;
  • язвенный колит;
  • полипозные образования и эрозии;
  • внутренние кровотечения;
  • болезнь Гиршпрунга;
  • кишечную непроходимость;
  • опухоли различного характера и др.

Во время колоноскопии врач может провести лечебные мероприятия. Без полостной операции специалисты купируют кровотечения, удаляют полипы и небольшие опухоли, берут материал для гистологического анализа.

Подготовка к обследованию

Для успешного проведения колоноскопии подготовку к процедуре нужно начать за 2–3 дня. Из рациона исключаются тяжелые для пищеварения мучные изделия, мясо, сырые фрукты и овощи, бобовые, сладкие блюда.

Непосредственно перед исследованием проводят очищение кишечника с помощью слабительных средств или клизмы. В день процедуры допускается легкий завтрак (кроме тех случаев, когда запланировано обследование под наркозом).

Колоноскопическое исследование в Москве. Как проходит процедура?

Продолжительность колоноскопии составляет не более 30 минут. Эндоскоп вводится через задний проход и медленно перемещается по толстой кишке. Для улучшения визуализации через зонд подается воздух. Изображения с видеокамеры поступают на экран монитора. Это позволяет оценить состояние слизистой в режиме реального времени.

В РГНКЦ колоноскопию выполняют с помощью новейшего цифрового оборудования. По желанию пациента возможно применение наркоза. Наши специалисты используют все возможности данного обследования: быстро и аккуратно проводят диагностику, при необходимости удаляют мелкие образования и делают биопсию (забор тканей для дальнейшего исследования).

Наш центр находится по адресу: Москва, улица 1-я Леонова, дом 16. Для уточнения цен на услуги и записи на прием позвоните по указанным на сайте телефонам или воспользуйтесь онлайн-формой.

Гастрит жел — Вопрос гастроэнтерологу

Если вы не нашли нужной информации среди ответов на этот вопрос, или же ваша проблема немного отличается от представленной, попробуйте задать дополнительный вопрос врачу на этой же странице, если он будет по теме основного вопроса. Вы также можете задать новый вопрос, и через некоторое время наши врачи на него ответят. Это бесплатно. Также можете поискать нужную информацию в похожих вопросах на этой странице или через страницу поиска по сайту. Мы будем очень благодарны, если Вы порекомендуете нас своим друзьям в социальных сетях.

Медпортал 03online.com осуществляет медконсультации в режиме переписки с врачами на сайте. Здесь вы получаете ответы от реальных практикующих специалистов в своей области. В настоящий момент на сайте можно получить консультацию по 74 направлениям: специалиста COVID-19, аллерголога, анестезиолога-реаниматолога, венеролога, гастроэнтеролога, гематолога, генетика, гепатолога, гериатра, гинеколога, гинеколога-эндокринолога, гомеопата, дерматолога, детского гастроэнтеролога, детского гинеколога, детского дерматолога, детского инфекциониста, детского кардиолога, детского лора, детского невролога, детского нефролога, детского онколога, детского офтальмолога, детского психолога, детского пульмонолога, детского ревматолога, детского уролога, детского хирурга, детского эндокринолога, дефектолога, диетолога, иммунолога, инфекциониста, кардиолога, клинического психолога, косметолога, липидолога, логопеда, лора, маммолога, медицинского юриста, нарколога, невропатолога, нейрохирурга, неонатолога, нефролога, нутрициолога, онколога, онкоуролога, ортопеда-травматолога, офтальмолога, паразитолога, педиатра, пластического хирурга, подолога, проктолога, психиатра, психолога, пульмонолога, ревматолога, рентгенолога, репродуктолога, сексолога-андролога, стоматолога, трихолога, уролога, фармацевта, физиотерапевта, фитотерапевта, флеболога, фтизиатра, хирурга, эндокринолога.

Мы отвечаем на 97.42% вопросов.

Оставайтесь с нами и будьте здоровы!

Давайте поговорим о сексе (для транс-мужчин)

Вот простой факт, о котором мало кто догадывается: многие транс-мужчины предпочитают не делать то, что мы называем «операцией на ягодицах». То есть они решили не делать никаких операций на гениталиях, с которыми родились. Это означает, что в мире есть значительное количество мужчин с вагиной. Я разговаривал со многими транс-мужчинами на протяжении всей своей жизни и работы, и, по моим оценкам, около 90 процентов транс-мужчин по всему миру — я брал интервью у мужчин из Швеции, США.К., Бразилия, Мексика и другие страны — не сделали выбор в пользу операции на дне.

Для кого-то это решение вызвано финансовыми причинами, для кого-то боязнью осложнений, а для кого-то это больше похоже на «шаг за шагом»: «Посмотрим, как будет себя чувствовать этот первый этап (операция на груди, гормоны), и я возьму его оттуда». Независимо от причины, тело трансгендерного человека, недавно перешедшего, — это новый ландшафт для него, и, возможно, тот, который не очень хорошо понят или приспособлен даже самим мужчиной.

Когда я впервые совершил переход, я беспокоился, что не смогу найти партнера или даже любовь. Я беспокоился, что людей просто оттолкнет мысль о мужчине с вагиной. С тех пор я взял интервью и поговорил с сотнями трансгендерных парней, которые разделяют те же опасения. 30-летний Кевин, живущий в Бруклине, сказал: «Решение не делать операцию на ягодицах было тем, к чему я шел много лет. Только когда я увидел в Интернете видеоролики о вашей работе (серия документов, которую я делаю под названием

Sexing the Transman ), я понял, что мне не нужен пенис, чтобы стать мужчиной.Я беспокоился о сексе, но, что удивительно, большинство моих сексуальных партнеров были очень открыты для меня и моего тела, даже если это для них незнакомая территория».

Лично я всегда буду помнить тот момент, когда я понял, что с моими гениталиями все в порядке, что мое влагалище было частью меня, и что быть мужчиной без пениса нормально, и это произошло благодаря мастурбации и оргазму. Это был один из первых случаев, когда я проник в себя, и я чувствовал себя немного виноватым, что на самом деле достиг кульминации. Это было странное чувство — впервые насладиться своей вагиной — это всегда было чем-то, к чему я не была привязана и даже ненавидела.Но тот оргазм изменил для меня все. Это был действительно поворотный момент в моей идентичности и моей любви к себе.

Мастурбация стала для меня ежедневным ритуалом, как и для многих других транс-мужчин, с которыми я общалась. Из-за этого мы всегда ищем новые способы выйти. В мире секс-игрушек не было ничего, что было бы разработано для нашего тела. Что делает транс-мужские влагалища и вульвы необычными, так это то, что они увеличиваются, особенно клитор, из-за использования тестостерона, и вместе с этим наши влагалища также становятся немного более чувствительными.Парни говорят о недавно повышенном сексуальном сознании и желании секса. Когда это сочетается с непривязанностью к своему телу или недостатком информации или ресурсов, транс-мужчины рискуют не испытать наилучшую сексуальную жизнь.

Поскольку в мире секс-игрушек (или «продуктов для удовольствия») не было ничего для транс-мужчин, мне пришлось быть очень изобретательным! Я разрезал продукты, сделанные для цисгендерных мужчин и женщин, чтобы они соответствовали моей анатомии, например фаллоимитаторы с присоской, вырывал их и использовал отверстие на конце для мастурбации. Я находил такие вещи, как наборы для укуса змеи, которые используются для высасывания яда из укуса змеи, или игрушки, такие как присоски для сосков, и адаптировал их под себя. Некоторые транс-парни показали мне, как они использовали концы бутылок с водой, наполненные водой, чтобы создать всасывание. Один парень даже использовал маленькое полотенце для рук, наполненное смазкой, чтобы натирать его. Удивительно, как можно создавать вещи только для того, чтобы мастурбировать.

Джим, 23-летний транс-мужчина из Филадельфии, сказал мне: «Мастурбация — это то, чем я занимаюсь каждый день.Сначала мне было нелегко найти место, чтобы чувствовать себя комфортно, прикасаясь к себе; это было странно, потому что я никогда не делал этого до перехода. Хотя через это я понял, что люблю секс и что мне нужно чувствовать себя, и пусть это будет хорошо».

Когда я, наконец, смогла полюбить свое тело и чувствовать себя комфортно с ним, я чувствовала себя более комфортно на многих уровнях, выходящих далеко за рамки сексуальности. По этой причине у меня была миссия научить транс-парней любить свое тело и через это любить себя.Эти разговоры так важны для нашего благополучия, и именно поэтому мы давно мечтаем создать игрушку, которая будет только для нас. Это подтверждает; он говорит: «Ваше тело настоящее, оно заслуживает наслаждения, и вы не одиноки». Я действительно надеюсь использовать Buck-Off, чтобы начать разговоры за пределами сообщества транс-мужчин, а также повысить осведомленность о телах транс-мужчин и их конкретных потребностях. Это важно не только для нас, но и для наших потенциальных партнеров, учителей, медицинских работников и законодателей.

БАК ЭНЖЕЛ — американский транс-мужчина, правозащитник, вдохновляющий оратор и режиссер фильмов о половом воспитании. Ангел входит в совет директоров Woodhull Sexual Freedom Alliance с 2010 года; Фонд работает над утверждением сексуальной свободы как основного права человека посредством защиты интересов и образования. BuckAngel.com

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Нацеливание на расщепление внутримолекулярной протеиназы NS2B/3 для трансдоминантного ингибирования вируса денге

Значение

Срочно необходимы ингибиторы вируса денге, переносимого комарами патогена.Вирусно кодируемая NS2B/3, двухсубъединичная сериновая протеиназа, отвечает за многие расщепления внутри вирусного полипротеина. Мы демонстрируем, что два сайта расщепления, фланкирующие NS3, и один внутренний являются самопроцессинговыми. Это строгое внутримолекулярное расщепление диктует, что, если нерасщепленные предшественники могут ингибировать рост вируса, этот фенотип будет -транс--доминантным. Действительно, мутация, устраняющая один из сайтов самопроцессинга, вызывала -транс--доминантное ингибирование вируса дикого типа. Этот участок также является наиболее чувствительным к ингибитору протеиназы денге, что является убедительным обоснованием его эффективности. Мы предполагаем, что явное нацеливание на специфические сайты внутримолекулярного расщепления будет эффективной противовирусной стратегией, которая может подавлять множественные варианты внутриклеточных квазивидов.

Abstract

Многие РНК-вирусы с положительной цепью транслируют свои геномы в виде отдельных полипротеинов, которые обрабатываются протеиназами хозяина и вируса с образованием всех вирусных белковых продуктов.Среди них вирус денге, который кодирует сериновую протеиназу NS2B/3, ответственную за семь различных расщеплений полипротеина. NS2B/3 был объектом многих направленных скринингов для поиска химических ингибиторов, из которых соединение ARDP0006 является одним из наиболее эффективных для ингибирования роста вируса. Мы показываем, что по крайней мере три расщепления полипротеина денге являются исключительно внутримолекулярными. По определению, такой -цис--действующий дефект не может быть устранен в -транс-. Это создает возможность того, что чувствительные к лекарственным средствам или ингибированные протеиназы могут быть генетически доминирующими, подавляя рост резистентных к лекарственным средствам вирусов за счет накопления предшественников.Действительно, вариант NS3-G459L, неспособный к расщеплению на внутреннем соединении NS3, доминантно ингибирует синтез РНК с отрицательной цепью вируса дикого типа, присутствующего в той же клетке. Этот внутренний сайт расщепления NS3 является соединением, наиболее ингибируемым ARDP0006, что делает вероятным то, что накопление токсичных предшественников, а не ингибирование протеолитической активности как таковое, объясняет противовирусную эффективность этого соединения в сдерживании вирусного роста. Мы утверждаем, что внутримолекулярные расщепляющие протеиназы являются многообещающими лекарственными мишенями для вирусов, кодирующих полипротеины.Наиболее эффективные ингибиторы будут специфически нацелены на сайты расщепления, необходимые для процессинга предшественников, которые проявляют -транс--доминантное ингибирование.

Вирус денге — переносимый комарами патоген, вызывающий, по оценкам, 390 миллионов случаев заболевания во всем мире ежегодно (1). Инфекция может привести к лихорадке денге, геморрагической лихорадке денге или шоковому синдрому денге, а вакцины или противовирусные препараты в настоящее время не одобрены для использования. Разработка профилактических и терапевтических методов лечения этого и других забытых или возникающих заболеваний является приоритетом для глобальных организаций здравоохранения.

РНК-вирусы с положительной цепью кодируют полипротеины, которые должны быть расщеплены во время и после трансляции. Кодируемая вирусом сериновая протеиназа (NS3) и ее незаменимый кофактор (NS2B) ответственны за вирусно-опосредованное расщепление среди всех представителей рода Flavivirus , включая Западный Нил (ВЗН), желтую лихорадку, японский энцефалит, Зика и вирусы денге. При первом синтезе NS2B/3 встроен в полипротеин денге и отвечает за семь процессов процессинга в нем (2) (рис. 1 А ). Было показано, что в ВЗН расщепление между NS2B и NS3 является исключительно внутримолекулярным (3). Для вируса денге это расщепление нечувствительно к разведению (4), что позволяет предположить, что строгий внутримолекулярный процессинг в этом соединении является обычным явлением среди флавивирусов. В дополнение к протеолитическим событиям, которые первоначально определяли вирусные белки, существует внутреннее расщепление NS3 (NS3 int ). Значение этого расщепления пока неизвестно, хотя сообщалось, что оно происходит в клетках млекопитающих, но не в клетках насекомых (5, 6).

Рис. 1.

Ингибирование вируса денге с помощью ARDP0006. ( A ) Полипротеиновая организация вируса денге, показывающая расщепление, производимое NS2B/3 (черные стрелки) и протеазами хозяина (серые стрелки). ( B ) Две кристаллические структуры с высоким разрешением полноразмерного NS2B/3 демонстрируют множественные конформации доменов геликазы и протеазы относительно друг друга (идентификационные коды банка данных белков 2VBC и 2WHX, зеленый и бирюзовый, соответственно). Активный сайт протеиназы показан красным, а внутренний сайт расщепления NS3 — оранжевым.( C ) Химическая структура ингибитора NS2B/3 ARDP0006. ( D и E ) Влияние 25 мкМ ARDP0006 (пунктирные линии) на внеклеточный и внутриклеточный вирус денге (множественность заражения, 0,1 БОЕ на клетку) во время роста клеток BHK-21. Ингибирование роста вируса сравнимо с тем, что наблюдалось ранее (11), с зарегистрированным значением IC 50 , равным 4,2 мкМ. n = 4 в D и E .

NS3 представляет собой привлекательную мишень для наркотиков, поскольку он выполняет множество важных функций.N-концевой домен содержит активный сайт протеиназы, а С-концевой домен проявляет активности РНК-хеликазы, РНК-5′-трифосфатазы (RTPase) и НТФазы (7). Кроме того, мутации, которые изменяют консервативные неферментативные поверхностные остатки, снижают приспособленность вируса (8). Структуры, определенные с помощью рентгеновской кристаллографии, показали две разные ориентации (рис. 1 B ) домена протеиназы относительно домена хеликазы NS3 (9, 10), утверждая, что эти домены могут быть гибкими по отношению друг к другу в решение также.

Ингибитор протеиназы денге NS2B/3 ARDP0006 (1,8-динитро-4,5-дигидроантрахинон; рис. 1 C ) ранее был идентифицирован в ходе высокопроизводительного скрининга. Тестируемая протеиназа NS2B/3 была сконструирована так, чтобы содержать только кофакторные области, необходимые для активности протеиназы NS3 (остатки NS2B с 49 по 96), соединенные с остатками 1-185 NS3 через гибкую последовательность Gly 4 -Ser-Gly 4 . Эта минимальная протеиназа эффективно расщепляет субстраты, поставляемые в составе транс , но не может самопроцессироваться.Таким образом, этот скрининг проверяют на наличие ингибиторов межмолекулярного расщепления (11, 12). Следует отметить, что в то время как полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC 50 ) для межмолекулярного расщепления в растворе составляла 432 мкМ (12), IC 50 при заражении составляла 4,2 мкМ (11). Дополнительный ингибирующий эффект, наблюдаемый в клетках, может быть связан с повышенными локальными концентрациями или нецелевыми эффектами. Однако мы предусмотрели альтернативный механизм, в котором накопленные предшественники протеиназ ингибируют рост вируса.

Мы решили исследовать механизмы ингибирования вирусов с помощью ARDP0006. Мы проверили, являются ли расщепления других полипротеинов, опосредованные NS2B/3, самопроцессингом, и будут ли предшественники, которые будут накапливаться в отсутствие саморасщепления, -транс--доминантными ингибиторами вируса дикого типа (WT). Наши результаты подтверждают гипотезу о том, что ингибирование одного конкретного события самопроцессинга приводит к транс -доминантному ингибированию репликации РНК. Это дает представление о ранее неизученной роли предшественников лихорадки денге в инфекции и предлагает подход к разработке антипротеиназных препаратов, преимущественно направленный на специфические внутримолекулярные расщепления.

Результаты

Ингибирование вируса денге и активности протеиназы с помощью ARDP0006.

Несмотря на тщательный скрининг и химический синтез, ARDP0006 остается одним из наиболее мощных ингибиторов роста вируса денге, нацеленных на NS2B/3, с зарегистрированным значением IC 50 , равным 4,2 мкМ (13). Добавление 25 мкМ ARDP0006 снижало выход внеклеточного и внутриклеточного вируса денге в 100 раз в течение одного 24-часового инфекционного цикла (рис. 1 D и E ). При такой концентрации ARDP0006 наблюдалась незначительная цитотоксичность ( SI Приложение , рис.С1).

ARDP0006 был идентифицирован как ингибитор расщепления флуорогенного субстрата протеиназой NS2B/3, неспособной к самопроцессингу (11). Мы исследовали, ингибирует ли это соединение также саморасщепление NS2B/3. С этой целью использовали минимальную саморасщепляющуюся протеиназу, названную NS2B/3 pro (14). Эта конструкция содержит требуемый кофакторный домен NS2B (аминокислоты с 47 по 95), последние 10 остатков NS2B для реконструкции сайта расщепления (аминокислоты со 122 по 131) и протеазный домен NS3 (аминокислоты с 1 по 185). но не имеет трансмембранных доменов.

Для изучения расщепления NS2B/3 pro необходимы условия, при которых можно было бы проводить кинетический анализ сразу после синтеза. С этой целью лизат ретикулоцитов кролика (RRL) использовали для получения NS2B/3 pro , радиоактивно меченного [ 35 S]метионином. Мутация активного сайта протеиназы, NS3-S135A, приводит к тому, что этот белок продуцируется только в качестве предшественника (фиг. 2 A , дорожка 1), и обеспечивает маркер для интактного NS2B/3 pro . Сначала мы хотели установить, ингибирует ли ARDP0006 расщепление NS2B/3 при IC 50 межмолекулярной протеиназной активности (432 мкМ) или вирусного ингибирования (4.2 мкМ). Активная версия эффективно транслировалась и расщеплялась на продукты после 90-минутной инкубации (фиг. 2 , дорожка 2). ARDP0006 ингибировал это расщепление, о чем свидетельствует увеличение доли меченого предшественника протеиназы при повышении концентрации ингибитора (фиг. 2 A , дорожки 3-8). Однако IC 50 для саморасщепления NS2B/3 pro была высокой, сравнимой по величине с K i для расщепления небольших субстратов in vitro (рис.2 В ).

Рис. 2.

Ингибирование NS2B/3 pro in vitro с помощью ARDP0006. Анализ in vitro был разработан для измерения ингибирования внутримолекулярного расщепления NS2B-3 минимальной протеиназой денге. ( A и B ) Минимальная протеиназа продуцировалась в RRL в присутствии возрастающих концентраций ARDP0006 (от 50 мкМ до 2 мМ), а оставшийся предшественник был нанесен на график для определения IC 50 саморасщепления in vitro ( n = 1). ( C и D ) Для мониторинга влияния ингибитора на скорость реакции был разработан анализ импульсной последовательности.Пиковое количество предшественников в RRL наблюдалось через 25-30 минут ( C , дорожки 1-3), и неактивный белок NS3-S135A надежно транслировался ( C , дорожка 4), но продукты расщепления не наблюдались. Виды с молекулярной массой 32 кДа, наблюдаемые на дорожке 4, часто являются фоном в этой системе. После мечения и трансляции добавление 100 мкМ ARDP0006 приводило к умеренному, но статистически значимому ингибированию расщепления ( D , пунктирная линия) по сравнению с реакциями, обработанными имитациями ( D , сплошная линия).Аппроксимация линии была выполнена с помощью GraphPad Prism v.7 с использованием уравнения зависимости логарифма [ингибитора] от отклика с переменным наклоном для определения кажущейся IC 50 ( B ) и однофазных экспоненциальных функций затухания для соответствия данным в D . Значение P в D было определено путем сравнения соответствия индивидуальных и общих моделей с использованием дополнительного теста суммы квадратов F . n = 3 (штриховая линия) или 5 (сплошная линия).

Одно из объяснений наблюдения, что ARDP0006 является более эффективным ингибитором роста вируса, чем активность протеиназы NS2B/3, заключается в том, что, хотя он был идентифицирован как ингибитор NS2B/3, он ингибирует вирус за счет нецелевого эффекта. Учитывая, что идентификация мишеней для лекарств часто облегчается идентификацией устойчивых к лекарствам вариантов, мы попытались выделить вирус денге, устойчивый к ARDP0006, в культивируемых клетках ( SI Приложение ). Из двух независимых селекционных пулов не было индивидуальных или общих мутаций в NS2B/3, но возникла мутация A21V в соседнем NS4A. Эта замена валина крайне редко встречается в природных изолятах лихорадки денге, встречаясь только в 4 из 3871 последовательностей, депонированных в базе данных вариаций вируса Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (15).Реконструкция изолированной мутации A21V показала, что она не придает специфической устойчивости к ARDP0006, но увеличивает скорость роста вируса как в присутствии, так и в отсутствие ингибитора ( SI, Приложение , рис. S2). Мы пришли к выводу, что существует высокий барьер для устойчивости к ARDP0006, но могут появиться быстро растущие варианты, возможно, из-за нецелевых эффектов соединения.

Недавно было показано, что другая молекула, нацеленная на NS2B/3, названная NSC135618, обладает мощной антифлавивирусной активностью (16).Мы проверили активность этого соединения с помощью анализов, описанных для ARDP0006. Мы определили значения IC 50 вирусного и внутримолекулярного расщепления, равные 1,7 и 490 мкМ, соответственно ( SI, Приложение , рис. S3), что отражало расхождение в этих значениях, обнаруженное для ARDP0006. Таким образом, оба ингибитора протеиназы NS2B/3 в 100 раз эффективнее ингибируют рост вируса, чем ферментативная активность вирусной протеиназы, что повышает вероятность того, что оба соединения действительно ингибируют рост вируса денге за счет ингибирования протеазы, но потенциально сложными механизмами. .

Для наблюдения за кинетикой и эффективностью расщепления NS2B/3 pro были проведены импульсные эксперименты. Для минимальной протеиназы временной ход трансляции показал, что предшественник и продукт могут быть легко определены количественно через 25-30 минут (рис. 2 C ). Были проведены импульсные анализы, в которых белок транслировался радиоактивно меченым метионином в течение 30 минут с последующим добавлением избытка немеченого метионина и либо ARDP0006, либо его растворителя DMSO. Сплошная линия на рис.2 D количественно определяет разложение меченого предшественника NS2B/3 pro . Величина наблюдаемого ингибирования была статистически значимой, хотя и незначительной, как и ожидалось для IC 50 ~620 мкМ (рис. 2 D и таблица 1). Концентрация 100 мкМ была использована, потому что она находится между IC 50 для ингибирования вирусов и протеиназ и обеспечивает ориентир для последующих исследований отдельных сайтов расщепления.

Таблица 1.

Скорость обработки протеиназных конструкций

Три расщепления NS2B/3 являются исключительно внутримолекулярными.

В WNV соединение NS2B-3 обрабатывается исключительно внутримолекулярно (3). Мы предположили, что это относится и к вирусу денге и что, учитывая гибкость протеиназного домена, другие расщепления NS3 также могут подвергаться самопроцессингу. Чтобы проверить это, были проведены эксперименты по смешиванию каталитически активных и неактивных версий NS2B/3 pro . После 120 мин инкубации S135A-NS2B/3 pro оставался нерасщепленным (фиг. 3 B , дорожка 1). Как и прежде, расщепление меченого активного NS2B/3 pro было эффективным и практически полным к 120 мин (фиг.3 Б , переулок 3). Однако, когда [ 35 S]метионин-меченая каталитически неактивная протеиназа смешивалась с немеченой активной протеиназой, специфических продуктов расщепления не наблюдалось (фиг. 3 B , дорожка 2). Следовательно, расщепление соединения денге NS2B-3 происходит исключительно внутримолекулярно.

Рис. 3.

Внутримолекулярное расщепление NS3-проксимальных полипротеиновых соединений. ( A ) Схема минимальной протеиназы NS2B/3. Черная стрелка указывает на сайт расщепления; S135 указывает на каталитический серин, мутировавший с образованием неактивной протеиназы.( B ) Активные (WT) и неактивные (S135A) минимальные протеиназы транслировались в реакциях RRL по отдельности или вместе, как указано, в течение 120 мин в присутствии (красные символы) или в отсутствие (черные символы) [ 35 S]метионина и визуализировали с помощью SDS/PAGE. ( C ) Схема протеиназных конструкций NS2B/3/4A, включая полноразмерный NS3 и остатки с 1 по 49 NS4A. Обозначается как A . ( D ) Активные (WT) и неактивные (S135A) протеиназы транслировали и смешивали, как в B .Звездочки в A и C обозначают укорочения белков, описанные в тексте.

Два других соединения расщепления встречаются внутри или по бокам NS3: NS3 int и NS3-4A. Чтобы проверить, могут ли они расщепляться межмолекулярно, мы создали удлиненные версии NS2B/3 pro , которые включали геликазный домен NS3 и первые 49 остатков NS4A (рис. 3 C ). Неактивный меченый NS2B/3/4A сам по себе давал интактный предшественник (фиг. 3 D , дорожка 1).При добавлении активной немеченой протеиназы не было обнаружено никаких дополнительных полос или наблюдаемого исчезновения предшественника (фиг. 3 D , дорожка 2). Это контрастирует с активной меченой протеиназой, которая превращалась из одного предшественника в ожидаемые продукты (рис. 3 D , дорожка 3), демонстрируя, что все три проксимальных расщепления NS3 (NS2B-3, NS3 int , и NS3-4A) являются строго внутримолекулярными. Мы пришли к выводу, что один или несколько из них могут быть специально нацелены на ARDP0006.

Ингибирование расщепления NS2B-3, NS3

int и NS3-4A с помощью ARDP0006.

Для мониторинга эффекта ингибирования ARDP0006 в этих сайтах было полезно упростить схемы расщепления (рис. 4 A ). Для создания белка, в котором расщеплялся только сайт NS2B-3, были сделаны мутации, разрушающие соединения расщепления NS3 int и NS3-4A (рис. 4 A ). Расщепление умеренно, но значительно ингибировалось 100 мкМ ARDP0006 (рис. 4 B и таблица 1).

Рис. 4. NS3-проксимальные расщепления

чувствительны к ингибированию ARDP0006. ( A ) Реакции лизата ретикулоцитов, запрограммированные плазмидами, кодирующими NS2B/3/4A, которые содержат следующие мутации: NS3-S135A (неактивный; черный), NS3-G459L/NS4A-S1L (оба сайта расщепления; оранжевый), NS4A-S1L (соединение NS3-4; фиолетовый) или NS3-G459L (соединение NS3 int ; красный) инкубировали в течение 90 мин в присутствии [ 35 S]метионина, и продукты визуализировали с помощью SDS/PAGE для подтверждения расщепления. узоры.( B D ) Кинетику деградации продуктов гена из A отслеживали в отсутствие (сплошные линии) и в присутствии (пунктирные линии) 100 мкМ ARDP0006. Аликвоты брали в указанное время после охоты с немеченым метионином и лекарственным средством. Протеолиз моделировали как одноэкспоненциальную реакцию распада с базовой линией, ограниченной 0. Кинетические параметры в присутствии ингибитора статистически значимо различались для всех конструкций ( B D ; n = 4, P = 0 .0033; n = 2, P = 0,0003; n = 4, P < 0,0001; соответственно), как определено дополнительным тестом суммы квадратов F .

Мутант S1L способен к расщеплению по NS2B-3 и NS3 int . В этом случае обработка была значительно и резко ингибирована 100 мкМ ARDP0006 (рис. 4 C и таблица 1). Мы пришли к выводу, что расщепление внутренних соединений NS3, когда NS3 все еще соединен с NS4A, предпочтительно восприимчиво к ARDP0006 и может захватывать NS3 в негибкой конформации. Неспособность расщепить соединение NS2B-3 в присутствии мутации S1L свидетельствует о том, что эти расщепления не являются независимыми.

Мутант G459L не расщепляется по внутреннему сайту NS, но может расщепляться по соединениям NS2B-3 и NS3-4A. ARDP0006 замедлял обработку этой конструкции примерно в той же степени, что и для одного NS2B/3 pro (фиг. 2 D и 4 B и D и таблица 1) . Мы пришли к выводу, что отсутствие независимости N-концевых, внутренних и С-концевых реакционных участков может привести к тому, что временной порядок расщепления различается в полипротеинах с различной мутацией.Важно отметить, что сайт расщепления NS3 int очень чувствителен к ингибированию, при этом чувствительность к ARDP0006 сравнима с чувствительностью самого вируса.

NS3-G459L является доминирующим ингибитором роста вируса дикого типа.

Чтобы определить, ингибируют ли предшественники лихорадки денге рост вируса, мы отслеживали рост вируса дикого типа в присутствии вариантных геномов либо с определенными дефектами в сайтах расщепления протеиназы, либо с общим ингибированием активности протеиназы. Все мутации, показанные на рис.5 A оказались смертельными для вируса, который их содержал ( SI Приложение , Таблица S1). Мы проверили, способен ли какой-либо из этих мутантных геномов доминантно ингибировать вирус WT, как можно было бы предсказать, если бы мутация вызывала накопление ингибирующего предшественника при трансляции вводимой РНК.

Рис. 5. Геном мутанта

с внутренним расщеплением NS3 представляет собой транс -доминантный ингибитор. ( A ) Показана схема геномной вирусной РНК с расположением сайта внутреннего расщепления NS3-G459L, NS3-4A NS4A-S1L и протеазо-мертвых мутаций NS3-S135A, показанных красным, фиолетовым и зеленым цветом соответственно.( B ) ВРНК дикого типа котрансфицировали равными массами дрожжевой тРНК, мутантной вРНК NS3-G459L, мутантной вРНК NS4A-S1L или мутантной вРНК NS3-S135A, и выход вируса определяли через 48 часов после трансфекции ( n = 4). ( C ) Конструкция репликона люциферазы лихорадки денге, в которой отсутствуют структурные белки. ( D ) Репликон РНК (1 мкг на лунку) котрансфицировали в 24-луночные планшеты с равными массами вРНК WT, NS3-G459L, NS4A-S1L или NS3-S135A, и сигнал люциферазы измеряли в указанные моменты времени ( н = 4).RLU, относительная световая единица. ( E ) РНК с неактивным полимеразным репликоном (1 мкг на лунку) котрансфицировали в 24-луночные планшеты с равными массами вРНК WT, NS3-G459L или NS3-S135A, и сигнал люциферазы измеряли в указанные моменты времени ( n = 4). ( F ) РНК репликона положительной цепи была обнаружена с помощью специфичной для цепи RT-qPCR. ( G ) РНК репликона с отрицательной цепью была обнаружена с помощью специфичной для цепи RT-qPCR ( n = 2). ( H ) Множественное выравнивание последовательностей вируса денге серотипов 1-4, JEV и вируса ВЗН, регистрационные номераACF49259, P29990, AAA99437, AAX48017, P32886 и P14335 соответственно. Белковые последовательности были получены из NCBI и выровнены Clustal Omega с использованием Lasergene MegAlign Pro. нс, не имеет значения. * Р < 0,05, ** Р < 0,01, **** Р < 0,0001.

При котрансфекции равными количествами вирусной РНК (вРНК) WT и NS4-S1L рост вируса WT не нарушался (рис. 5 B ). Однако котрансфекция вРНК дикого типа и NS3-G459L снижала рост вируса в 100–1000 раз (рис.5 В ). Эта мутация должна обеспечивать накопление интактного NS3, возможно, все еще связанного с фланкирующими последовательностями. Чтобы определить, вызывает ли ингибирование всех расщеплений NS2B/3 также -транс--доминантное ингибирование вируса WT, мы проверили эффект мутации активного сайта протеиназы NS3-S135A. При совместной трансфекции WT и вРНК NS3-S135A мы наблюдали значительное, но относительно умеренное ингибирование вируса WT (фиг. 5 B ). Поэтому мы предполагаем, что именно накопление специфических предшественников, а не общее ингибирование протеиназы, ответственно за этот доминирующий эффект.

Чтобы определить внутриклеточную стадию, которая преимущественно ингибируется геномом NS3-G459L, мы проверили влияние мутантных вРНК на котрансфицированный репликон WT (рис. 5 C ). Этот репликон кодирует люциферазу Renilla и неструктурные белки денге, но не содержит структурных белков денге (17). Таким образом, сигнал люциферазы отражает только трансляцию и репликацию трансфицированной РНК. Вирусные геномы, которые были WT или содержали мутацию NS4-S1L, не оказывали заметного влияния на сигнал люциферазы репликона, но вирусная РНК, содержащая мутацию NS3-G459L, оказывала сильное ингибирующее действие (рис.5 Д ). Это ингибирование может быть результатом ингибирования трансляции репликона, амплификации РНК или того и другого. Чтобы определить, оказывает ли геном NS3-G459L транс--доминантное ингибирование трансляции, была проведена котрансфекция репликона, который содержал мутацию активного сайта полимеразы (GDD), с WT и мутантными геномными вирусными РНК (фиг. 5 E ). В этом эксперименте весь сигнал люциферазы происходит от начальных событий трансляции и со временем уменьшается в отсутствие нового синтеза РНК. На продукцию люциферазы из репликона GDD не влияло присутствие вРНК NS3-G459L или NS3-S135A (рис. 5 E ). Следовательно, мутация NS3-G459L не влияет на ранний синтез вирусного белка.

Чтобы определить, ингибирует ли доминантный мутантный геном NS3-G459L синтез отрицательной цепи (и, следовательно, также синтез положительной цепи) или только синтез положительной цепи, мы провели специфичную для цепи RT-qPCR для измерения обеих цепей WT и GDD. репликоны (рис. 5 F и G ).Во всех условиях количество измеренной РНК было нормализовано к значениям, наблюдаемым только для репликона WT. Количество РНК репликона положительной цепи, обнаруженное при котрансфекции с доминантным мутантом NS3-G459L, было неотличимо от количества, обнаруженного для одного репликона GDD, что указывает на сильное ингибирование синтеза положительной цепи (фиг. 5 F ). Напротив, количество РНК репликона с отрицательной цепью было значительно больше, чем для одного репликона GDD (рис. 5 G ), что указывает на то, что доминантный мутант NS3-G459L допускает синтез отрицательной цепи и, следовательно, специфически ингибирует синтез положительной цепи.

NS3 помимо протеиназной активности выполняет несколько ферментативных функций. NS3-G459 находится в области NS3, которая, как известно, важна для активности РНК-хеликазы, АТФазы и РТФазы. Этот регион является высококонсервативным, и сам G459 имеет 100% идентичность между всеми четырьмя серотипами вируса денге, а также вирусом японского энцефалита (JEV) и ВЗН (рис.5 Н ). Чтобы определить, является ли -транс--доминирование мутации NS3-G459L результатом нарушения непротеиназной активности, мы проверили эффект четырех различных мутаций, которые, как известно, разрушают некоторую комбинацию этих других активностей (7, 18, 19). Доминантное ингибирование не коррелировало простым образом с мутациями ни в одной из этих функций ( SI, Приложение , рис. S4). Например, мутантные геномы NS3-K199A и NS3-K396A с нарушенными функциями хеликазы не ингибировали доминантно рост котрансфицированной РНК дикого типа, но геном NS3-R376A с мертвой геликазой был мощным транс--доминантным ингибитором ( SI Приложение , рис. С4 Б ). Мы исследовали, происходит ли это -транс--доминирование по механизму, сходному с механизмом генома NS3-G459L, возможно, посредством непредвиденного воздействия на активность протеиназы. Однако, в отличие от мутации G459L, мутант NS3-R376A демонстрировал нормальный процессинг белка ( SI Приложение , рис. S4 C ) и не проявлял транс--доминантного ингибирования синтеза РНК репликона ( SI Приложение , рис. С4 Д ). Таким образом, -транс--доминантное ингибирование геномом NS3-R376A, вероятно, является эффектом, отличным от эффекта G459L и более позднего инфекционного цикла денге.Интересно, что мутантный белок NS3-R376A имеет повышенную аффинность к двухцепочечной РНК (7), что делает возможным, что такой эффект усиления функции способствует его -транс--доминированию. Таким образом, ни один из дефектных по геликазе вирусов не обладает фенокопией -транс--доминантного эффекта мутации NS3-G459L. Вполне вероятно, что есть много аллель-специфических дефектов усиления функции, которые еще предстоит изучить. Здесь мы показываем, что специфическое ингибирование расщепления внутреннего сайта расщепления NS3 либо фармакологически, либо генетически приводит к сильному и, в случае мутации G459L, -транс--доминантному ингибированию репликации вирусной РНК.

Обсуждение

Белки NS3 денге и других флавивирусов обладают несколькими ферментативными активностями, опосредованными отдельными доменами. Кроме того, NS3 взаимодействует с белками-хозяевами, такими как STING и MAVS, чтобы нарушить передачу сигналов врожденного иммунитета. Мы показали, что три различных NS2B/3-опосредованных расщепления происходят исключительно внутримолекулярно, что требует конформационной гибкости протеиназного домена. Мы обнаружили, что отмена одного из этих расщеплений приводит к накоплению предшественника, который -транс--доминантно ингибирует все вирусы в одной и той же клетке.Эти результаты идентифицируют механизм ингибирования вируса и обеспечивают путь для подавления роста лекарственно-устойчивых вариантов.

Быстрое появление лекарственной устойчивости является основным препятствием для разработки эффективных противовирусных препаратов для всех РНК-содержащих вирусов, включая лихорадку денге. Низкая точность полимеразы и быстрое время генерации приводят к большому разнообразию популяции, включая потенциально ранее существовавшие устойчивые варианты для любого данного препарата. Типичные стратегии ингибирования роста вируса также предусматривают сильное давление отбора, что позволяет проводить быстрый отбор в популяции вирусов, заражающих хозяина.Комбинированная лекарственная терапия снижает вероятность образования вируса, содержащего мутации, придающие устойчивость ко всем компонентам противовирусной смеси. Другой подход к подавлению лекарственной устойчивости состоит в том, чтобы смириться с неизбежным появлением лекарственно-устойчивых вариантов, но выбрать лекарственную мишень, которая предотвращает их рост. Например, нацеливание на олигомерные вирусные белки может уменьшить выбор лекарственно-устойчивых вариантов из-за смешивания белков как из лекарственно-устойчивых, так и из лекарственно-чувствительных геномов (20). Капсиды являются очевидными мишенями для этой противовирусной парадигмы; однако возможно создать другие деструктивные олигомеры белков с высокой степенью взаимодействия.

Процессинг вирусных полипротеинов точно рассчитан по времени для оптимального роста вируса. Неправильно обработанные вирусные предшественники мешают росту и патогенезу вируса. У полиовируса мутации, препятствующие расщеплению на стыке VP1/2A, являются -транс--доминантными, вероятно, потому, что нерасщепленный предшественник, содержащий VP1 и капсидные белки, разрушает сборку вируса (21).При гепатите С увеличение скорости расщепления предшественника NS4B-5 путем манипулирования сайтом узнавания ингибирует репликацию вирусной РНК (22). Кроме того, вирус Синдбис демонстрирует изысканную временную регуляцию протеолиза. Нерасщепленный полипротеин P123 необходим для синтеза минус-цепи, но расщепление P123 необходимо для эффективного синтеза плюс-цепи, и относительное количество этих видов белков регулируется вариациями субстратной специфичности (23, 24).

NS2B-3 Расщепление.

N-концевой домен белка NS2B связан с мембраной, и его С-концевая последовательность действует как кофактор для протеиназного домена NS3.NS2B остается связанным с NS3 после расщепления соединения, и активность специфической протеиназы значительно увеличивается (25). Кроме того, гидрофобные области NS2B должны связывать этот холофермент с внутриклеточными мембранами, на которых происходит репликация вируса (26). Было показано, что расщепление вируса денге NS2B-3 происходит исключительно внутримолекулярно, даже несмотря на то, что он может быть воссоздан биохимически в транс (27). Учитывая, что расщепление NS2B-3 происходит быстро и увеличивает активность протеиназы (4, 28), вероятно, оно ограничивает скорость процессинга белка.Поэтому мы были удивлены тем, что расщепление NS2B-3 не ингибировалось более резко под действием ARDP0006.

NS3-4A Расщепление.

NS4A содержит несколько связанных с мембраной последовательностей, которые вызывают искривление и перестройку мембраны. Мы наблюдали, что расщепление в месте соединения NS3-4 вируса денге является строго внутримолекулярным. Это также было зарегистрировано для родственного пестивируса, вируса классической чумы свиней (29). Когда соединение NS3-4 не обрабатывается, не наблюдается наблюдаемого -транс--доминантного эффекта, что свидетельствует о том, что полученные предшественники, которые обязательно содержат NS4A, не мешают росту вируса.Как и в случае соединения NS2B-3, ARDP0006 лишь умеренно ингибирует расщепление между NS3 и NS4A. Геномы, кодирующие нерасщепляемые сайты NS3/4A, не проявляют ингибирующего действия на другие вирусные геномы в той же клетке.

NS3 Внутренний раскол.

Внутреннее расщепление NS3 наблюдалось у лихорадки денге и многих близкородственных вирусов (3, 6, 29, 30), но его значение оставалось загадочным. В результате этого расщепления образуется протеиназа NS2B/3, освобожденная от связи с мембраной NS4A. Мутации, устраняющие этот сайт расщепления, являются летальными, что может быть связано либо с отсутствием расщепления, либо с нарушением активности хеликазы. Мы показали, что этот контакт обрабатывается строго внутримолекулярным образом. Из трех внутримолекулярных процессированных сайтов внутри и по бокам NS3, это соединение расщепления наиболее сильно ингибируется ARDP0006 (Fig. 4 and Table 1). Когда внутреннее соединение NS3 ингибируется ARDP0006, расщепление соединения NS2B-3 также ингибируется. Это указывает на аллостерические эффекты при ингибировании внутреннего расщепления NS3, которые предотвращают доступ к NS2B-3 и, возможно, другим соединениям NS3. Что наиболее важно, вирусные геномы, которые устраняют это событие самопроцессинга trans , доминантно ингибируют синтез положительной цепи РНК геномов WT, присутствующих в той же клетке, что напоминает эффект предшественников на репликацию вируса Синдбис.Мы предполагаем, что противовирусный эффект ARDP0006 обусловлен его специфическим ингибированием внутреннего расщепления в NS3, которое также устраняется мутацией G459L, и что в обоих случаях это приводит к накоплению транс--доминантных предшественников NS3, связанных с фланговые последовательности.

Мы предполагаем, что эффективной ингибиторной стратегией для вирусов с саморасщепляющимися полипротеиновыми предшественниками будет сначала идентифицировать расщепления, которые, если они не произведены, дают транс -доминантные ингибиторы.При ингибировании этого события расщепления накопление ингибирующих предшественников будет блокировать репликацию чувствительных вирусов и, скорее всего, любых геномов, устойчивых к лекарственным средствам, по мере их возникновения в инфицированных клетках.

Методы

Плазмиды.

Плазмида экспрессии протеиназы денге pGEX-NS2B-3 prot , в которой трансмембранный домен в NS2B был делетирован, была сконструирована, как описано ранее (14). Плазмиды NS2B/3/4A были получены из этой плазмиды путем расщепления NsiI/BamHI и опосредованной ДНК-лигазой T4 (New England Biolabs) вставки ампликонов NS3-4A (нуклеотиды с 7473 по 13699) с добавлением сайта BamHI к 3′-концу.кДНК инфекционного клона штамма 16681 вируса денге 2 использовали в качестве исходной плазмиды для всех конструкций (31). Все мутации вводили с использованием наборов для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Agilent Technologies).

Вирусы и клеточные культуры.

В этом исследовании использовали штамм 16681 вируса денге. Подробные методы см. в приложении SI . Клетки BHK-21 выращивали при 37 °C с 5% CO 2 в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% бычьей сыворотки, 1 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина и 10 мМ Hepes.Для анализа бляшек вирусам давали адсорбироваться на клетках BHK-21 в течение 1 часа при 37 °C, покрывая 1 мл DMEM плюс 0,375% (вес/объем) бикарбоната натрия и 0,8% Aquacide II, выращивали в течение 7 дней, фиксировали. (5% формальдегида) и окрашенные (0,1% кристаллический фиолетовый).

ARDP0006 Лечение.

1,8-Дигидрокси-4,5-динитроантрахинон (Sigma-Aldrich) растворяли в ДМСО и добавляли в среду для культивирования клеток за 30 мин до инфицирования. Внеклеточный вирус собирали из клеточного супернатанта. Внутриклеточный вирус собирали в среде DMEM путем промывки клеток (0. 5 М NaCl, 10 мМ Трис), замораживание-оттаивание (3 раза) и центрифугирование (5 мин, 3200 × г ).

Анализы расщепления протеиназами.

Белковые конструкции денге экспрессировали в RRL (T N T-связанный T7; Promega BioSystems), запрограммированном с помощью 1 мкг ДНК/50 мкл и помеченном 20 мкКи 1-[ 35 S]метионина (EasyTag; PerkinElmer). Если не указано иное, реакции радиоактивного импульса-преследования инкубировали при 30 °C в течение 30 минут перед добавлением 1-метионина (конечная концентрация 1 мМ) и ДМСО (конечная концентрация 2%).Для обработанных образцов ARDP0006 растворяли в ДМСО. Аликвоты немедленно разбавляли буфером для образцов Лэммли (4 объема, 1 × конечный), денатурировали (60 °C, 10 мин) и разделяли с помощью SDS/PAGE. Гели сушили в вакууме (80°C, 120 мин) и подвергали воздействию низкоэнергетического люминофорного экрана (Molecular Probes). Количественную оценку белка проводили с использованием программного обеспечения ImageQuant TL 8. 1 (GE Healthcare Life Sciences). Для анализа межмолекулярного расщепления протеиназами конструкции NS2B/3 и NS2B/3/4A экспрессировали либо с 1-[ 35 S]метионином, либо без него, как указано выше.Меченые реакции отгоняли избытком немеченого L-метионина, смешивали с немечеными реакциями трансляции (1:1) и инкубировали в течение 90 мин. Реакции останавливали и визуализировали, как указано выше.

Котрансфекции.

Котрансфекцию проводили на клетках BHK-21 в 24-луночных планшетах с добавлением 1 мкг каждой РНК на лунку (Lipofectamine 3000; Thermo Fisher Scientific). Раствор для трансфекции удаляли через 2 часа при 37°С, клетки дважды промывали и инкубировали в течение 48 часов.

Анализы люциферазы.

Ранее была описана эффективная система репликонов денге (32). Этот репликон получен из штамма 16681 (17) и экспрессирует люциферазу Renilla (подарок Яна Каретта, Медицинская школа Стэнфордского университета). Трансфекцию репликона проводили, как описано выше. Клетки собирали и анализировали в соответствии с протоколом системы анализа люциферазы Renilla (Promega BioSystems) с использованием набора люминометров для 10-секундной интеграции сигнала (GloMax; Promega BioSystems).

RT-qPCR для конкретных цепей.

RT-qPCR, специфичная для вирусных цепей, была проведена на основе ранее описанных стратегий (33, 34). Тотальную РНК из клеток BHK-21 собирали через 26 ч после трансфекции. Реакции обратной транскрипции выполняли с помощью SuperScript II RT (Thermo Fisher Scientific) и 200 нг РНК, праймированных репликон-специфическими праймерами tagF Pos или tagF Neg, с получением кДНК для последовательностей репликона с положительной или отрицательной цепью. Эти кДНК разбавляли водой в 25 раз и проводили количественную ПЦР с праймерами TAG и Rev Pos или Rev Neg с использованием Platinum SYBR Green (Thermo Fisher Scientific) на системе ПЦР в реальном времени Applied Biosystems 7300 (Thermo Fisher Scientific).Последовательности праймеров приведены в приложении SI , таблица S2.

Благодарности

Мы благодарим Drs. Scott Crowder, Gabriele Fuchs, Caleb Marceau и Poornima Paramaswaram за участие в начальных этапах этого проекта, а также Jan Carette за реагенты и советы. Мы ценим критическое чтение Жасмин С. Мошири и Питера Сарноу. Эта работа была поддержана премией директора NIH Pioneer Award (KK), Национальным институтом общих медицинских наук наград NIH T32GM007276 и U19AI109662, а также финансированием программы Stanford SPARK.Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Сноски

  • Вклад авторов: Д.А.К., Р.М. и К.К. проектное исследование; Д.А.К., Р.М. и К.К. проведенное исследование; D.A.C., R.M. и C.M.N. предоставил новые реагенты/аналитические инструменты; Д.А.К., Р.М. и К.К. проанализированные данные; и D.A.C. и К.К. написал бумагу.

  • Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

  • Эта статья является прямой отправкой PNAS. П.-Ю.С. является приглашенным редактором по приглашению редколлегии.

  • Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1805195115/-/DCSupplemental.

  • Copyright © 2018 Автор(ы). Опубликовано ПНАС.

Фортранс для похудения

Фортранс – медицинский препарат, который назначают больным перед любыми полостными операциями по очистке кишечника.Однократный его прием можно приравнять к действию нескольких клизм. Фортранс назначают также при кишечной непроходимости, когда существует угроза интоксикации больного. Однако врачи не рекомендуют принимать фортранс для похудения. Это связано с рядом последствий:

  1. В результате очистки кишечника фортрансомами возникает атония. То есть полная деградация основной функции кишечника – эвакуаторной. Другими словами, после такого похудения вы потеряете возможность ходить в туалет без слабительного.
  2. Из кишечника вместе с калом вымывается вся микрофлора и даже после приема фортранса ваш кишечник не может полностью восстановить нормальную флору и функцию всасывания питательных веществ.
  3. Возможны деформации толстой и прямой кишки, а также геморрой.
  4. Из-за того, что организм будет недополучать витамины и микроэлементы (см. пункт 2), начнут выпадать волосы, ломаться ногти и шелушиться кожа.
  5. При употреблении сложных углеводов, а также пищи, богатой клетчаткой, начнется вздутие живота и метеоризм. Кишечник не справляется с перевариванием такой «сложной» пищи.
  6. Выполнение любых физических упражнений станет практически невозможным из-за слабости.

Однако, несмотря на все это, слабительное Фортранс пользуется огромной популярностью среди тех, кто отчаянно хочет похудеть любой ценой. Посмотрим, как достигается эффект похудения на фортрансе:

  • Фортранс блокирует воду и задерживает ее в кишечнике;
  • в итоге вся вода (1.5-2л) не пройдет по кишечнику, а «застрянет», и с бешеной скоростью начнет проталкивать каловые массы;
  • процесс их «выхода» может занять от 6 до 12 часов;
  • потеря в весе 1,5 — 3кг произойдет за счет абсолютной очистки кишечника от всех каловых масс, при этом жир не сгорит и никуда не денется.

Теперь поговорим о том, сколько времени занимает очистка кишечника фортрансомами.

Первый день вы проведете дома, так как часов 6-12 будете бегать в туалет.В первый день производители рекомендуют только пить воду, есть – запрещено. На следующий день вы вряд ли сможете встать с постели, потому что после «глобальной чистки» у вас будет невиданный упадок сил. В этот день вам нужно будет отварить 1 стакан риса и разделить его на 5-6 приемов пищи. Любая другая пища может вызвать приступы диареи. Далее на протяжении недели или даже двух вам нужно будет принимать бифидо- и лактобактерии, так как фортрансом будет вымыта вся кишечная микрофлора.

Побочные эффекты

Фортранс не имеет побочных эффектов, у него есть только последствия, о которых мы говорили в начале статьи. Еще можно добавить то, что ближайшие полгода вы будете сидеть на специальной диете вовсе не для того, чтобы похудеть, а для того, чтобы не похудеть. Ваш метаболизм будет замедлен, периодически будет возникать диарея, витамины и минералы не смогут нормально усваиваться даже через несколько месяцев после очищения.

Правила приёма

Если, вопреки всему вышесказанному, вы всё-таки хотите рискнуть (может и повезёт — это как раз правильное выражение для фортранса!), то опишем, как сдать фортранс на вес потеря.

Самый удобный способ — фортранс в порошке. Разводим его в литре воды, и выпиваем за 5 приемов по 200мл. Однако, учитывая, что фортранс, ко всему прочему, имеет еще и весьма неприятный привкус, у вас могут появиться позывы к рвоте. Так что избавьтесь на остаток дня от унитаза от других членов семьи, а тазик запаситесь на случай рвоты от фортранса.

А если честно, те же 2 кг можно сбросить и более гуманным способом. Например: устроить разгрузочный день на овощах или фруктах, попить зеленого чая, сходить в баню и побегать в парке.

CYP-опосредованная резистентность к перметрину у Aedes aegypti и доказательства трансрегуляции

Abstract

Aedes aegypti представляет серьезную опасность для здоровья человека в связи с его широким глобальным распространением, высокой компетентностью в отношении нескольких арбовирусов, частыми укусами человека и способностью процветать в городской среде. Пиретроидные инсектициды остаются основным средством борьбы с взрослыми особями A . aegypti популяций во время вспышек болезни.В результате десятилетий использования устойчивость к пиретроидам является глобальной проблемой. Опосредованная цитохромом Р450 монооксигеназой (CYP) детоксикация является одним из основных механизмов устойчивости к пиретроидам. Однако конкретные CYP, ответственные за резистентность, однозначно не определены. Мы интрогрессировали аллели устойчивости от устойчивого A . aegypti , Сингапур (SP), в генетический фон восприимчивого штамма ROCK. Полученный штамм (CKR) был конгеничен ROCK.Нашей основной целью было определить, какие CYP в SP связаны с резистентностью. Для этого мы сначала определили, какие CYP , сверхэкспрессированные в SP, также сверхэкспрессированы в CKR, при условии, что только CYP, связанные с устойчивостью, будут сверхэкспрессированы в CKR по сравнению с ROCK. Затем мы определили, были ли какие-либо сверхэкспрессированные CYP генетически связаны с устойчивостью ( цис--регулируемые) или нет ( транс--регулируемые). Мы обнаружили, что CYP6BB2 , CYP6Z8 , CYP9M5 и CYP9M6 были сверхэкспрессированы как в SP, так и в CKR.Основываясь на геномных последовательностях и полиморфизмах пяти однокопийных CYP (CYP4C50, 6BB2, 6F2, 6F3 и 6Z8) в каждом штамме, ни один из этих генов не был связан с устойчивостью, за исключением CYP6BB2 , который был частично связан с локусом устойчивости. . Следовательно, сверхэкспрессия этих четырех CYP обусловлена ​​ транс -регуляторным фактором (факторами). Знание конкретных CYP и их регуляторов, вовлеченных в резистентность, имеет решающее значение для стратегий борьбы с резистентностью, поскольку оно помогает в разработке новых контрольных химических веществ, предоставляет информацию о потенциальных модуляторах резистентности в окружающей среде и позволяет обнаруживать маркеры резистентности до того, как резистентность закрепится в организме. население.

Резюме автора

Монооксигеназы цитохрома Р450 (CYP) являются одним из наиболее важных механизмов устойчивости комаров к инсектицидам. Эти ферменты CYP расщепляют инсектициды на нетоксичные формы, которые легко выводятся из организма. Увеличение CYP-опосредованной детоксикации обычно обнаруживается у резистентных к пиретроидам Aedes aegypti , однако связь между специфическими CYP и локусами резистентности для этого вида четко не установлена. В этом исследовании мы измерили уровни экспрессии девяти кандидатов CYP в двух штаммах с высокой устойчивостью к перметрину: SP, штамм, собранный в полевых условиях, который был отобран с перметрином на высокий уровень устойчивости, и CKR, штамм, который содержит механизмы устойчивости от SP, но это родственно (т.е. имеет генетический фон) к чувствительному к инсектицидам штамму ROCK. Мы обнаружили семь сверхэкспрессированных CYP в SP и четыре в CKR, что подтверждает их участие в резистентности. Затем мы секвенировали генов CYP (за исключением дуплицированных), чтобы определить, расположены ли сами гены в локусе устойчивости (что означает, что их экспрессия цис--регулируется) или нет (что означает, что их экспрессия транс-регуляторна). -регулируемый). Мы не обнаружили редуцированных полиморфизмов ни в одном из CYP устойчивого штамма (SP), предполагая, что сверхэкспрессия этих CYP (и, следовательно, CYP-опосредованная резистентность) регулируется транс-.

Образец цитирования: Smith LB, Tyagi R, Kasai S, Scott JG (2018) CYP-опосредованная резистентность к перметрину у Aedes aegypti и доказательства регуляции trans . PLoS Negl Trop Dis 12(11): e0006933. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006933

Редактор: Geraldine Marie Foster, Ливерпульская школа тропической медицины, СОЕДИНЕННОЕ КОРОЛЕВСТВО

Поступила в редакцию: 9 августа 2018 г.; Принято: 18 октября 2018 г.; Опубликовано: 19 ноября 2018 г.

Авторское право: © 2018 Smith et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные содержатся в документе и в его файлах вспомогательной информации, за исключением последовательностей CYP4C50, 6BB2, 6F2, 6F3 и 6F8, которые доступны в GenBank под номерами доступа MF804422, Mh573729 и MH632735-MH632742.

Финансирование: Это исследование частично финансировалось Премией Джейн Э. Броуди для студентов бакалавриата (для RT), Фондом пожертвований для студентов Dextra (для RT) и Национальными институтами здравоохранения (для JGS). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Aedes aegypti является важным вредителем, способным передавать четыре важных вируса болезней человека: лихорадку денге, желтую лихорадку, чикунгунья и Зика.Денге, например, вызывает заболеваемость и смертность в 141 стране тропических и субтропических регионов мира и, по оценкам, представляет риск для более чем 50% населения мира [1]. Желтая лихорадка является эндемическим заболеванием тропических регионов Африки и Южной Америки, число случаев которого в последнее время увеличилось в Бразилии [2,3]. Чикунгунья — это заболевание, новое для Америки с 2013 года [4], которое часто вызывает изнурительные боли в суставах в дополнение к гриппоподобным симптомам. Зика был завезен в Америку в 2015 году [5] и вызвал большие опасения из-за связи с врожденными дефектами и синдромом Гийена-Барре [6].Учитывая, что A . aegypti имеет широкое глобальное распространение, высокую компетенцию переносчика нескольких арбовирусов, часто поражает людей и процветает в городской среде, представляет серьезную опасность для здоровья человека.

Инсектициды по-прежнему являются основным средством борьбы с A . aegypti в эндемичных районах. В частности, пиретроиды являются наиболее широко используемым классом инсектицидов для борьбы со взрослыми особями A . aegypti [7] за последние три десятилетия. В результате такого постоянного использования устойчивость к пиретроидам в A . aegypti — глобальная проблема [8].

Опосредованная цитохромом Р450 монооксигеназой (CYP) детоксикация является одним из основных механизмов устойчивости комаров к пиретроидам. CYP представляют собой большое семейство ферментов, которые метаболизируют как эндогенные субстраты, так и ксенобиотики, такие как инсектициды. А . aegypti имеют приблизительно 160 генов CYP [9]. Несколько исследований прямо (например,г. in vivo и/или in vitro метаболизм) или косвенно (снижение резистентности с помощью ингибитора CYP пиперонилбутоксида (PBO)) вовлекают CYP как механизм резистентности к пиретроидам в A . aegypti [8]. Выяснение конкретных CYP, ответственных за резистентность, является сложной задачей из-за большого количества CYP и потому, что CYP-опосредованная резистентность может быть связана со сверхэкспрессией CYP или с мутацией в открытой рамке считывания . CYP [10].Однако идентификация этих CYP чрезвычайно важна для управления резистентностью, поскольку позволяет нам обнаруживать маркеры резистентности и прекращать использование инсектицидов до того, как резистентность закрепится в популяции [11]. Знание конкретных CYP также может помочь в разработке новых инсектицидов и ингибиторов резистентности, а также позволит нам лучше понять влияние ксенобиотиков окружающей среды на развитие резистентности к инсектицидам [12].

Большинство исследований было проведено для выявления CYP , ответственных за резистентность A . aegypti изучали изменения уровней экспрессии с использованием неродственных штаммов [9,13–16]. Однако при использовании штаммов различного происхождения невозможно определить точную взаимосвязь между сверхэкспрессированными генами и устойчивостью к инсектицидам, поскольку экспрессия CYP может варьировать по причинам, не связанным с устойчивостью к инсектицидам. Например, CYP9M9 был сверхэкспрессирован в штамме SBE по сравнению со штаммом BORA [13], хотя оба штамма были чувствительными.

Увеличение транскрипции CYP , приводящее к резистентности, может быть связано с изменением регуляторной области CYP [17], изменением регуляторного белка CYP или увеличением количества копий CYP посредством амплификации генов [18,19]. Эти процессы увеличения экспрессии CYP дадут разные результаты. Во-первых, ожидается, что мутация в конкретном CYP , которая приводит к усилению экспрессии ( cis- регуляция), будет демонстрировать специфическое увеличение только этого CYP , и резистентность будет отображаться на этом CYP .Напротив, если резистентность обусловлена ​​мутацией в гене-регуляторном белке ( транс--регуляция), потенциально может быть несколько CYP , экспрессия которых повышена в резистентном штамме, даже если только один из них отвечает за сопротивление. Кроме того, локус резистентности не будет отображаться на CYP , который сверхэкспрессирован. В настоящее время известно несколько случаев, когда сверхэкспрессия CYP обнаруживается у штаммов, устойчивых к инсектицидам, и сверхэкспрессия обусловлена ​​-транс--регуляцией CYP . Примеры включают CYP6D1 в Musca Romenta [20], 6A2 и 6A8 в и 6A8 в Drosophila Melanogaster [21], 6BJ A / B , 6BJ1 , 9Z25 и 9Z29 в Leptinotarsa ​​decemlineata и 4G7 , 4G14 и 6BQ в Tribolium castaneum [22–24]. Амплификация генов может также привести к увеличению экспрессии одного CYP или нескольких генов CYP , встречающихся в тандеме, в зависимости от длины дуплицированной области.В этом случае локус резистентности может сопоставляться с одним или несколькими дубликатами CYP s.

CYP s как группа представляют собой быстро развивающиеся гены [25] и часто полиморфны внутри и между штаммами [26,27]. Когда возникает мутация, вызывающая устойчивость, и она находится под высоким давлением отбора, так что аллель устойчивости закрепляется в штамме или популяции, область рядом с этой мутацией будет иметь уменьшенное количество полиморфизмов по сравнению с остальной частью генома [28-35]. Таким образом, уменьшенное количество однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) полезно для обнаружения локусов устойчивости [31–33]. Отпечаток области вокруг локуса резистентности со временем будет уменьшаться, поскольку рекомбинация вносит обратную вариацию, но это будет медленный процесс. Кроме того, если мутация в CYP вызывает резистентность, мы ожидаем, что CYP будет иметь единственный уникальный аллель в устойчивом штамме, но будет полиморфным в чувствительных штаммах.

Один из наиболее устойчивых к пиретроидам штаммов A . aegypti — Сингапур (SP). SP развил 1650-кратную устойчивость к перметрину (относительно восприимчивого штамма SMK) после 10 поколений селекции [19]. Резистентность к пиретроидам при СП обусловлена ​​CYP-опосредованной детоксикацией и нечувствительностью сайта-мишени (мутации V1016G+S989P в чувствительном к напряжению натриевом канале [ Vssc ]). CYP-опосредованная резистентность была однозначно продемонстрирована в SP в экспериментах по метаболизму in vitro и in vivo, а также в подавлении устойчивости PBO. Девять CYP генов ( CYP9M6 , 9M5 , 9M4 , 6Z8 , 6Z7 , 6F3 , 6F2 , 6BB2 и 4C50 ) В SP были переключаются переключаемыми> в 3 раза относительно восприимчивого штамма SMK [19]. Сверхэкспрессия четырех из них ( CYP6Z7 , 9M4 , 9M5 и 9M6) была частично обусловлена ​​амплификации гена. Генетическая связь этих CYP или генетическая линия их сверхэкспрессии по отношению к резистентности не исследовались.

Чтобы понять, какие CYP в SP соответствуют локусу устойчивости, мы ввели устойчивость от SP в генетический фон восприимчивого штамма ROCK, что привело к CYP+KDR:ROCK (CKR), резистентному штамму, конгенному ROCK. . Затем мы задали два вопроса. Во-первых, какие CYP сверхэкспрессированы в SP, также сверхэкспрессированы в CKR по сравнению с ROCK? Во-вторых, являются ли какие-либо сверхэкспрессированные CYP генов цис- (сопоставляются с локусом устойчивости) или транс- (не сопоставляются с локусом устойчивости)?

Материалы и методы

А . aegypti штаммы и выращивание

Два родительских штамма A . aegypti : Rockefeller (ROCK), чувствительный к инсектицидам штамм, происходящий из Карибского бассейна [36] и выращиваемый без воздействия инсектицидов в течение нескольких десятилетий, и Singapore (SP), устойчивый к пиретроидам штамм, в котором механизмы сопротивления хорошо изучены [19]. SP устойчив к перметрину из-за двух мутаций в Vssc , V1016G+S989P (обозначается как kdr ) и CYP-опосредованной детоксикации, но не гидролазами или снижением проникновения в кутикулу [19].Третий штамм, CYP+KDR:ROCK (CKR), был выделен путем скрещивания ROCK с SP с последующими четырьмя обратными скрещиваниями и отбором перметрином. CKR является родственным ROCK, но устойчив к пиретроидам из-за устойчивости, опосредованной CYP, и к мутациям Vssc S989P+V1016G. Процедура выделения CKR показана на рис. 1. Короче говоря, неспаренные самки ROCK были скрещены в массовом порядке с самцами SP. Неспаренные самки F 1 были подвергнуты обратному скрещиванию с самцами ROCK, а неспаренные самки BC 1 были отобраны с дозой перметрина, убивающей не менее 60%.BC 1 выживших самок были скрещены с самцами ROCK. Этот процесс был повторен для поколений BC 2 и BC 3 , снова с использованием доз перметрина, которые давали примерно 60% смертности. Чтобы убедиться, что мы сохранили все аллели устойчивости, как самцы, так и неспаренные самки BC 3 были отобраны перметрином (~60% уничтожения) и скрещены друг с другом перед повторным обратным скрещиванием с ROCK. В BC 4 как самцы, так и несвязанные самки были отобраны с помощью перметрина (~60% гибели) и выращены в массовом порядке .Самцов и неспаренных самок из следующих трех поколений отбирали перметрином (~60% гибели) и выращивали в массовом порядке . В BC4F4 гомозиготность kdr была подтверждена аллель-специфической полимеразной цепной реакцией (ASPCR) (n = 190) в соответствии с нашим установленным протоколом [37]. Полученный штамм был назван CKR (рис. 1).

Рис. 1. Протокол, использованный для выделения конгенного штамма CKR, устойчивого к пиретроидам.

Количество самцов ROCK, включенных в каждый бэккросс, варьировалось в зависимости от количества самок, добавленных в клетку (примерно ½ количества самок ).Выбор перметрина обозначен зеленым затенением, а дозы, используемые для каждого выбора, показаны в скобках.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006933.g001

Комаров выращивали при температуре 27˚C (± 1˚C) при относительной влажности 70–80% и фотопериоде 14L:10D. Самок кормили кровью коровьей кровью с помощью покрытых мембраной стеклянных кормушек с водяной рубашкой (Owasco Meat Co., Моравия, Нью-Йорк). Взрослых особей содержали на 10%-ной сахарной воде в клетках размером примерно 35 x 25 x 25 см, вмещающих ≤ 1000 комаров.Личинок (~400–600) выращивали в контейнерах 27,5 x 21,5 x 7,5 см с 1 л дистиллированной воды и кормили кормовыми гранулами Cichlid Gold (Hikari, Hayward, CA) (измельченные гранулы для 1-го возраста и гранулы среднего размера для 2-4-го возраста). возраста). Пищевые гранулы давали ежедневно по мере необходимости.

Биоанализы для взрослых

Биоанализы взрослых особей проводились путем местного применения с использованием спаренных самок в возрасте от 3 до 7 дней. Перметрин (чистота 99,5%, цис-24,1%, транс-75,8%, Chem Service) и пиперонилбутоксид (PBO) (90%, Sigma-Aldrich) разводили в ацетоне (VWR, Radnor, PA, USA) для биоанализа.Комаров кратковременно анестезировали CO 2 и держали на льду. Каплю 0,22 мкл перметрина в ацетоне наносили на грудную клетку каждого комара с помощью многоразового дозатора Hamilton PB-600, снабженного шприцем на 10 мкл. Контроль обрабатывали только ацетоном. Для каждого биоанализа использовали не менее пяти доз, по крайней мере три из которых давали значения смертности от 0 до 100%, и каждая содержала 20 комаров. Комарам давали ватный тампон, пропитанный дистиллированной водой, и выдерживали при 25°С.Для каждого штамма было сделано минимум четыре повтора в течение как минимум двух дней и две клетки. Смертность определялась как атаксия комаров через 24 часа. Для расчета LD 50 и 95% доверительных интервалов (ДИ) был использован пробит-анализ [38], адаптированный для использования на персональном компьютере [39] с использованием поправки Abbott [40] на контрольную смертность. Все данные биоанализа укладываются в линию (критерий хи-квадрат). Коэффициенты устойчивости (RR) рассчитывали путем деления LD 50 устойчивого штамма (SP или CKR) на LD 50 ROCK.Значимые различия были определены путем расчета RR для минимального и максимального значений LD 50 на основе 95% ДИ. Если минимальные и максимальные значения RR не перекрывались, они считались существенно разными. Биотесты с использованием синергиста ПВО проводили, как описано выше, за исключением того, что 2,5 мкг ПВО (максимальная сублетальная доза для штамма ROCK) применяли к каждому комару за 2 ч до применения перметрина. Для этого комаров дважды анестезировали на льду, один раз для ПБО и один раз для аппликации перметрином. Были проведены два контроля: двойной ацетон и ацетон плюс применение PBO.

ОТ-КПЦР

Десять спаренных самок комаров в возрасте 5–7 дней были объединены в микропробирки объемом 2 мл (Starstedt AG & Co., Нюмбрехт, Германия), содержащие 500 мкл реагента TRIzol (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) на повтор, и четыре повторные пробирки были готовый. Комаров измельчали ​​со скоростью 4,5 м/с в течение 20 с с помощью бисерной мешалки MP FastPrep 24 (MP-Biomedicals, Санта-Ана, Калифорния, США). Содержимое РНК экстрагировали в соответствии с протоколом реагентов Invitrogen TRIzol.Концентрацию РНК измеряли с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США), а затем разбавляли до 10 мкг/50 мкл водой, не содержащей нуклеаз, для стандартизации концентрации между пробирками. ДНК удаляли обработкой ДНКазой (TURBO DNA-free kit, Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Полное расщепление ДНК было подтверждено отсутствием ПЦР-амплификации 5′-UTR CYP6Z7 (таблица S1), определяемой визуальным осмотром окрашенного бромистым этидием 1% агарозного геля.

Комплементарную ДНК (кДНК)

синтезировали с использованием 1 мкг общей РНК на реакцию с использованием набора системы обратной транскрипции Promega GoScript (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) и случайных праймеров в соответствии с инструкциями производителя. Затем пулы кДНК разбавляли 1:5 водой, не содержащей нуклеаз, перед использованием в количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-qPCR).

Планшеты

RT-qPCR были подготовлены с тремя биологическими повторами кДНК и двумя техническими повторами каждого биологического повтора.Одновременно сравнивали два штамма; сначала ROCK и SP, затем ROCK и CKR. Для сравнения каждого штамма использовали девять CYP вместе с двумя генами внутреннего контроля, рибосомным белком S3 ( RPS3 ) и эукариотическим фактором элонгации трансляции 1-альфа ( EF1α ). Планшеты вращали со скоростью 2100 об/мин в течение 1 минуты, чтобы убедиться, что жидкость достигла дна лунок. Реакционный объем (20 мкл) содержал 10 мкл 2 × iQ TM SYBR Green SuperMix, 7. 4 мкл воды без нуклеазы, 0,8 мкл 10 мкМ каждого конкретного праймера (таблица S1) и 1 мкл матрицы кДНК первой цепи. КолПЦР проводили в термоциклере CFX ConnectReal-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) по следующей программе: первоначальная денатурация и активация фермента при 95°C в течение 10 мин с последующими 40 циклами денатурации при 95°С в течение 10 с, отжиг при 60°С в течение 10 с со считыванием пластин и удлинение при 72°С в течение 10 с. Для анализа кривой плавления был добавлен автоматический стадийный цикл диссоциации.

Расчеты

Относительный количественный анализ

проводили с использованием метода ΔΔ Ct с поправкой на эффективность амплификации [41]. Изменение значения Ct каждого штамма между целевым геном CYP и эталонным геном ( RPS3 или EF1α ) представляет собой значение Ct Δ , в то время как изменение значения Ct Δ CYP между чувствительным штаммом (ROCK) и устойчивым штаммом (SP или CKR) представляет собой ΔΔ Ct, или значение кратности экспрессии. Это синоним значения R/S, и в этой статье оно будет упоминаться как значение R/S. Эффективность амплификации для каждого гена и штамма определяли с помощью LinRegPCR с 20% исключением выбросов из медианного значения, наряду с ручной коррекцией окна линейности, чтобы соответствовать прямому непрерывному набору точек данных в логарифмически-линейной фазе. графики усиления [42]. Данные были нормализованы к двум эндогенным контролям для обоих сравнений штаммов. Для определения значимости отношений R/S были проведены множественные t-тесты.

Генотипирование

Геномную ДНК экстрагировали двумя способами; 1) метод осаждения изопропанолом из целых тел собранных в пул комаров и 2) экстракция щелочью из задних ног отдельных комаров. Экстракцию изопропанолом проводили следующим образом: восемь целых комаров помещали в пробирки объемом 2 мл (Starstedt Inc., Нюмбрехт, Германия), содержащие десять шариков циркония/диоксида кремния диаметром 2,3 мм (BioSpec Products, Бартлсвилл, Оклахома, США) и 400 мкл буфера. А (100 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 100 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 0,5% SDS, ddH 2 O). Образцы гомогенизировали и добавляли 800 мкл 4,3 М раствора LiCl и 1,4 М KOAc с последующим центрифугированием (14 100 x g в течение 10 мин) и сбором надосадочной жидкости. Затем добавляли 570 мкл изопропанола, перемешивали, центрифугировали (14 100 x g в течение 10 мин) и удаляли надосадочную жидкость для выделения осадка ДНК. Пробирки, содержащие осадок, еще раз центрифугировали (14100×g в течение 30 секунд) с 500 мкл 70% EtOH. Супернатант удаляли, осадок ДНК высушивали и ресуспендировали в ddH 2 О.Метод щелочной экстракции проводили следующим образом: ноги отдельных комаров помещали в отдельные лунки 96-луночного планшета для ПЦР (BioRad, Hercules, CA, USA), содержащего три гранулы циркония/кремнезема диаметром 2,3 мм и 10 мкл 0,2 М NaOH. за скважину. Образцы ног взбивали в течение 1–2 мин на вихревой мешалке на максимальной скорости, а затем инкубировали в течение 10 мин при 70°С. Затем в каждую лунку добавляли десять мкл нейтрализующего буфера (360 мМ Tris-HCl, pH 8,0 и 10 мМ ЭДТА) и 80 мкл ddH 2 O.

ПЦР проводили с использованием 2 мкл матричной гДНК, 10 мкл буфера PrimeSTAR GXL (Takara Bio Inc., Shiga, Japan), 4 мкл смеси dNTP, 1 мкл ДНК-полимеразы PrimeSTAR GXL, 2 мкл смеси прямых и обратных праймеров (таблица S1, S1 Fig), 31 мкл ddH 2 0 и следующие условия термоциклера: 95°C в течение 3 мин, 37 x (98°C в течение 10 сек, 60°C в течение 15 сек, 68°C в течение 3 мин) и 68 ˚С в течение 10 мин.

Секвенирование и выравнивание CYP

Нашей целью было изучить полиморфизмы в CYP , которые сверхэкспрессированы в штамме SP [19], чтобы найти маркеры или мутации, которые могут связать CYP с устойчивостью.Для этого мы секвенировали гДНК CYP из пулов комаров штаммов SP и ROCK. Если в пулах обнаруживались полиморфизмы, восемь дополнительных комаров секвенировали индивидуально. Если в пулах не было обнаружено полиморфизма, этот процесс повторялся до тех пор, пока у нас не было высокой уверенности в полиморфизмах в каждом штамме. Для генов, в которых были обнаружены SNP, последовательности SP сравнивали с последовательностями ROCK, чтобы проверить наличие надежных и уникальных SNP в SP. Затем мы секвенировали из CKR любой CYP с надежным маркером, чтобы проверить, был ли он унаследован от родительского штамма ROCK или SP (т.е. связано с сопротивлением или нет).

гДНК

ROCK и SP секвенировали и выравнивали для каждой из единичных копий CYP (4C50, 6BB2, 6F2, 6F3 и 6Z8), которые сверхэкспрессированы в штамме SP. Четыре из девяти сверхэкспрессированных CYP , обнаруженных Kasai et al. [19] нельзя было использовать для поиска SNP из-за множественных копий гена; это были CYP6Z7 , 9M4 , 9M5 и 9M6 . Последовательности CYP были определены секвенированием по Сэнгеру с использованием продуктов ПЦР, обработанных ExoSAP (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), и секвенированы в Центре биотехнологических ресурсов Корнельского университета (BRC). Выравнивание последовательностей проводили с помощью программного обеспечения DNASTAR Lasergene, EditSeq и SeqMan Pro (Мэдисон, Висконсин). SNP искали с помощью функции SNP Report в SeqMan Pro и подтверждали визуальной проверкой выравниваний и хроматограмм.

Результаты

Биотесты на инсектициды

CKR и SP были устойчивы к перметрину (в 110 и 360 раз соответственно) по сравнению с ROCK (таблица 1). Резистентность к PBO подавлялась как у CKR, так и у SP, снижая RR до 77 и 70 раз соответственно, подтверждая CYP-опосредованную резистентность у обоих штаммов.Трехкратная разница в соотношении резистентности (RR) между штаммами CKR и SP предполагает, что во время выделения штамма CKR был утрачен какой-то второстепенный механизм резистентности.

Выражение CYP

Чтобы определить, была ли избыточная экспрессия генетически связана с устойчивостью к перметрину, экспрессия CYP была количественно определена как в штаммах SP, так и в CKR по сравнению с ROCK. CYP6BB2 , 6Z8 , 9M5 и 9M6 были сверхэкспрессированы как в SP, так и в CKR, что указывает на то, что их сверхэкспрессия связана с устойчивостью.Семь CYPS значительно известен в напряженности SP относительно рок-класса: CYP6BB2 , 6F2 , 6F3 , 6Z7 , 6Z8 , 9M5 и 9M6 (рис. 2). Уровень повышенной экспрессии в SP составил 169 для CYP9M6 ( p = 7,0 x 10 -6 ), 54 для CYP9M5 ( p = 6,6 x 10 907BB -5 ), 7,6 x 10 -6 , ( p = 0,01), 5,2 для CYP6Z7 ( p = 0.01), 3.8 для CYP6Z8 ( P = 2,2 x 10 -4 ), 1,7 для CYP6F3 ( P = 0,03) и 1,4 для CYP6Z2 ( P = 0,03). Для CKR по сравнению с ROCK только CYP6BB2 , CYP6Z8 , CYP9M5 и CYP9M6 были значительно сверхэкспрессированы (рис. 2). Кратность изменения экспрессии (R/S) в CKR составила 76 для CYP9M6 ( p = 0,05), 21 для CYP9M5 ( p = 0.02), 6,9 для CYP6BB2 ( p = 2,8 x 10 -3 ) и 1,5 для CYP6Z8 ( p = 0,03). При сравнении двух устойчивых штаммов SP имел более высокий уровень экспрессии CYP6F2 ( p = 4,0 x 10 -3 ), 6F3 ( p = 3,0 x 10 -3 0 ), 6Z7 ( p = 0,01), 6Z8 ( p = 4,8 x 10 −4 ), CYP9M5 ( p = 1.5 x 10 -3 ) и CYP9M6 ( p = 0,02) по сравнению с CKR. В среднем экспрессия SP была примерно в 2,4 раза выше, чем у CKR. CYP4C50 , 6BB2 и 9M4 , и существенно не отличались между SP и CKR (рис. 2).

Рис. 2. Экспрессия девяти CYP в устойчивых к перметрину (R) штаммах SP и CKR по сравнению с чувствительным штаммом ROCK (S) A . Египет .

Звездочки (*) указывают на значительную разницу между SP и ROCK, CKR и ROCK или SP и CKR (значение P ≤ 0.05). Столбцы представляют средние и стандартные ошибки из четырех биологических повторов.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006933.g002

Базальные уровни транскрипции CYP (значения Δ Ct) также были исследованы для каждого штамма по сравнению с RPS3 и EF0007 EF18 . Уровни экспрессии всех девяти CYP были легко определяемыми (S2 Fig, S3 Fig) и сходны между обоими эндогенными контролями.

Полиморфизмы CYP

Геномная ДНК пяти одиночных копий CYP ( 4C50 , 6BB2 , 6F2 , 6F3 , 6Z8 , 6Z8 ) были секвенированы из обоих приблизительных генов SPROCK1 и штаммов на диаграмме Fig. расположение грунтовки).Номера доступа GenBank для консенсусных последовательностей CYP перечислены в таблице S2. Эти CYP были выбраны, потому что они избыточно экспрессируются в SP, но не дублируются [19]. SP имел больше SNP, чем ROCK в CYP4C50 , 6F2 , 6F3 и 6Z8 (таблица 2). Частота полиморфизмов на тысячу оснований (т.п.н.) варьировала от 23 до 53 в SP и от 18 до 36 в ROCK. Однако не было штаммоспецифических полиморфизмов (т. е. ни уникального нуклеотида между штаммами в неполиморфном сайте, ни SNP, в котором оба нуклеотида различались между штаммами).Это не то, что можно было бы ожидать от гена в локусе устойчивости, и это приводит нас к выводу, что гены CYP4C50 , 6F2 , 6F3 и 6Z8 не связаны с устойчивостью, хотя их повышенная экспрессия была (см. ). В отличие от этих четырех CYP , было обнаружено намного меньше SNP в CYP6BB2 , который имел 0,08 и ноль SNP на kb в ROCK и SP соответственно (таблица 2). CYP6BB2 имел уникальный штаммоспецифический синонимичный полиморфизм (тимин в ROCK и цитозин в SP в положении 1595), который был гомозиготным в обоих штаммах. Это позволило нам проверить, был ли CYP6BB2 связан с устойчивостью, путем секвенирования этого CYP из штамма CKR. Мы обнаружили семь особей, гомозиготных по аллелю SP, 10 гетерозиготных и четырех гомозиготных по аллелю ROCK в штамме CKR. Это указывает на частичное генетическое сцепление CYP6BB2 и локуса устойчивости. На основании методов, используемых для выделения штамма CKR, измерение сцепления было невозможно.

Таблица 2. Общее количество однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), обнаруженных в каждом штамме (ROCK и SP), и доля уникальных SNP, обнаруженных только в одном, но не в другом штамме.

Коды согласованных последовательностей доступны как для ROCK, так и для SP в GenBank (таблица S2).

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006933.t002

Обсуждение

Результаты нашего биологического анализа позволили получить убедительные данные о том, что мы выделили штамм (CKR), обладающий CYP-опосредованной резистентностью и kdr из штамма SP. Большая часть устойчивости в SP была восстановлена ​​при выделении штамма CKR, хотя 3-кратная более низкая устойчивость к перметрину в CKR (в 110 раз) по сравнению с SP (в 360 раз) показывает, что некоторые аллели резистентности могли быть утрачены при выделении штамма CKR. процесс выбора.Это может произойти, если фактор резистентности является рецессивным и/или имеет высокую стоимость приспособленности [43]. Интересно, что значение RR для SP почти в 5 раз ниже, чем указано в Kasai et al. 2014. Этому есть как минимум три возможных объяснения. Во-первых, использовались разные партии перметрина, и известно, что это изменяет выражение резистентности [44]. Во-вторых, использовались разные чувствительные штаммы, и это может привести к различиям в сообщаемых уровнях устойчивости [45]. В-третьих, штамм SP, возможно, потерял некоторую устойчивость при сохранении в лаборатории с момента его получения в 2014 году.Биотесты с PBO снижали RR до 77 и 70 раз в CKR и SP соответственно, подтверждая участие CYP-опосредованной резистентности в обоих штаммах. Подавление резистентности с помощью PBO было неполным ( kdr отдельно дают 40-кратную резистентность [37]), что обычно наблюдается у штаммов с CYP-опосредованной резистентностью [19,46]. И CKR, и SP гомозиготны по мутациям S989P+V1016G Vssc .

Наше исследование подтверждает предыдущую работу [19] и предоставляет новую информацию об основах CYP-опосредованной резистентности при SP.В соответствии с тем, что сообщалось ранее [19], мы обнаруживаем повышенную экспрессию CYP6BB2 , 6Z7 , 6Z8 , 9M5 и 9M6 в SP. Учитывая, что в этом исследовании мы использовали другой чувствительный штамм и по-прежнему обнаруживали повышенную экспрессию этих CYP в SP, это подтверждает гипотезу о том, что эти CYP участвуют в резистентности. Кроме того, наши данные свидетельствуют о том, что сверхэкспрессия четырех CYP в штамме SP генетически связана с устойчивостью: CYP6BB2 , 6Z8 , 9M5 и 9M6 .Для CYP9M5 и 9M6 (но не 6BB2 или 6Z8 ) это частично связано с дупликацией генов [19].

Сколько различных генов регуляции транскрипции может быть вовлечено в устойчивость к инсектицидам, является важным, но оставшимся без ответа вопросом. К настоящему времени несколько различных факторов транскрипции вовлечены в устойчивость к инсектицидам, включая Gfi-1 в M . domestica [17,47] Cap n Collar C (CncC) и семейные транскрипционные факторы фиброматоза мышечного апоневроза (Maf) в Tribolium castaneum [24].Идентификация мутации, ответственной за повышенную экспрессию CYP s в штамме SP, расширила бы наши знания об этом важном эволюционном процессе и предоставила бы средства, с помощью которых можно было бы изучить популяционную генетику этой устойчивости. Очевидно, существует некоторая эволюционная пластичность в CYP-опосредованной резистентности [48], но прежде чем мы начнем получать удовлетворительное представление о транскрипционных регуляторных факторах, мутациях, вызывающих сверхэкспрессию CYP , и географической частоте этих мутаций, необходимо определить этот важный механизм сопротивления.

Гены CYP обычно сильно полиморфны. Например, у Anopheles gambiae CYP средняя частота SNP составляет 1 каждые 26 п.н. по сравнению со средним значением в геноме 1 каждые 34 п.н. [26]. Определение генетического разнообразия A . aegypti оказался сложной задачей из-за большого размера генома и высокого процента повторяющихся мобильных элементов [49]. Одно исследование обнаружило среднюю частоту SNP в A . aegypti геном составляет 12 на kb, однако оценки среднего разнообразия нуклеотидов (π) сильно различаются, начиная примерно с 0.001 до 0,015 [50] [51,52]. Мы обнаружили, что изученные нами CYP (за исключением 6BB2 ) имели частоту полиморфизмов, сходную со средней, зарегистрированной для An . gambiae [26] со средней частотой SNP 1 на 36 п.н. в ROCK и 1 на 26 п.н. в SP. Однако CYP6BB2 также имел небольшую вариацию (только два SNP в секвенированных 2430 п.н.) в ROCK. Низкий уровень полиморфизма в CYP6BB2 , по-видимому, больше связан с используемыми нами красителями, а не с геном как таковым , как дикий A . В популяциях aegypti из Уганды и Сенегала было 164 SNP CYP6BB2 , из Мексики было 45 SNP, а в популяциях из Шри-Ланки SNP не было [50].

В целом, наши результаты показывают, что CYP-опосредованная резистентность при SP обусловлена ​​ транс--регуляторными факторами, которые способны увеличивать экспрессию нескольких CYP s. Сверхэкспрессия четырех CYP ( CYP6BB2 , 6Z8 , 9M5 и 9M6 ) была связана с резистентностью.Однако секвенирование пяти однокопийных CYP , которые были обнаружены в сверхэкспрессии в штамме SP, показало, что ни один из них не показал ожидаемых признаков нахождения в локусе устойчивости, за исключением CYP6BB2 , который показал частичное сцепление с очаг резистентности. Учитывая, что три из CYP имеют несколько копий в SP, мы не можем оценить их связь с резистентностью. Надеемся, что в будущем для этих ампликонов станет доступно больше информации о последовательности, что позволит проверить сцепление. На основании этих результатов и других исследований [20–24, 53–55] представляется, что -транс--регуляция экспрессии CYP может быть распространенным механизмом устойчивости к инсектицидам.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Иллюстрация расположения праймеров для каждого из

CYP .

Черная линия указывает на экзоны, сплошная серая линия указывает на интроны, а пунктирные серые линии указывают на длинные интроны, масштаб которых не соответствует остальной части гена.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006933.s003

(TIF)

S2 Рис.

Уровни CYP в штаммах ROCK и SP A. aegypti .

Данные нормализованы к рибосомному белку S3 (RPS3). Звездочки (*) указывают на значительную разницу между ROCK и SP (значение P ≤ 0,05). Столбцы представляют средние и стандартные ошибки из четырех биологических повторов.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006933.s004

(TIF)

S3 Рис.

Уровни CYP в штаммах ROCK и CKR A. aegypti .

Данные нормализованы к рибосомному белку S3 (RPS3). Звездочки (*) указывают на значительную разницу между ROCK и CKR (значение P ≤ 0,05). Столбцы представляют средние и стандартные ошибки из четырех биологических повторов.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006933.s005

(TIF)

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Николаса Бушона за его помощь в анализе данных RT-qPCR, B.P. Lazzaro и H.C. Harrington за полезные комментарии к рукописи, а также сотрудников Scott Lab за их полезные комментарии к рукописи и их поддержку.

Каталожные номера

  1. 1. Шепард Д.С., Ундуррага Э.А., Халаса Ю.А., Стэнауэй Д.Д. (2016) Глобальное экономическое бремя лихорадки денге: систематический анализ. Ланцет Infect Dis 16: 935–941. пмид:270
  2. 2. Goldani LZ (2017) Вспышка желтой лихорадки в Бразилии, 2017 г. Brazilian J Infect Dis 21: 123–124.
  3. 3. Васконселос FPDC (2010) Желтая лихорадка в Бразилии: мысли и гипотезы о появлении в ранее свободных районах. Rev Saúde Públ 44: 1144–1149.
  4. 4. ВОЗ (2014 г.) Глобальный обзор трансмиссивных болезней. Женева: Всемирная организация здравоохранения. 56 стр.
  5. 5. Энсеринк М. (2015) Малоизвестная болезнь, переносимая комарами, становится глобальной. Наука 350: 1012–1013. пмид:26612926
  6. 6. Гарбаран Р., Соменарайн Л. (2017)Понимание молекулярной роли вируса Зика в репродуктивных осложнениях человека и врожденных невропатологиях.Патология 49: 707–714. пмид:2

    20

  7. 7. ВОЗ Глобальное использование инсектицидов для борьбы с трансмиссивными болезнями: оценка за 10 лет [2000–2009 гг.]. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/44670/9789241502153_eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y.
  8. 8. Смит Л.Б., Касаи С., Скотт Дж.Г. (2016)Устойчивость к пиретроидам у Aedes aegypti и Aedes albopictus : важные комары-переносчики болезней человека. Пестик Биохим Физиол 133: 1–12. пмид:27742355
  9. 9.Strode C, Wondji CS, David JP, Hawkes NJ, Lumjuan N, et al. (2008) Геномный анализ генов детоксикации у комара Aedes aegypti . Insect Biochem Mol Biol 38: 113–123. пмид:18070670
  10. 10. Scott JG (1999) Цитохромы P450 и устойчивость к инсектицидам. Insect Biochem Mol Biol 29: 757–777. пмид:10510498
  11. 11. Хемингуэй Дж., Филд Л., Вонтас Дж. (2002) Обзор устойчивости к инсектицидам. Наука 298: 96–97. пмид:12364782
  12. 12.Пупардин Р., Рейнода С., Стродеб С., Рэнсон Х., Вонтас Дж. и др. (2008) Перекрестная индукция генов детоксикации ксенобиотиками и инсектицидами из окружающей среды у комара Aedes aegypti : влияние на устойчивость личинок к химическим инсектицидам. Insect Biochem Molec Biol 38: 540–551.
  13. 13. Маркомб С., Пупарден Р., Дарриет Ф., Рейно С., Бонне Дж. и др. (2009) Изучение молекулярной основы устойчивости к инсектицидам переносчика денге Aedes aegypti : тематическое исследование на острове Мартиника (Французская Вест-Индия). BMC Genomics 10: 494. pmid:19857255
  14. 14. Marcombe S, Mathieu RB, Pocquet N, Riaz M-A, Poupardin R, et al. (2012) Устойчивость к инсектицидам у переносчика лихорадки денге Aedes aegypti с Мартиники: распространение, механизмы и связь с факторами окружающей среды. PLoS ONE 7: pmid:22363529
  15. 15. Фокон Ф., Дюсфур И., Гауд Т., Навратил В., Бойер Ф. и др. (2015)Выявление геномных изменений, связанных с устойчивостью к инсектицидам у комара денге Aedes aegypti , путем глубокого целевого секвенирования.Геном Res
  16. 16. Рид В.Р., Торнтон А., Приджен Дж.В., Бекнел Дж.Дж., Танг Ф. и другие. (2014) Транскрипционный анализ четырех P450 семейства 4 в штамме Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Пуэрто-Рико по сравнению со штаммом Орландо и их возможной функциональной роли в устойчивости к перметрину. J Med Entomol 51: 605–615. пмид:24897853
  17. 17. Gao J, Scott JG (2006) Роль репрессора транскрипции mdGfi-1 в опосредованной CYP6D1v1 резистентности к инсектицидам у комнатной мухи, Musca domestica . Insect Biochem Mol Biol 36: 387–395. пмид:16651185
  18. 18. Bass C, Field LM (2011)Амплификация генов и устойчивость к инсектицидам. Общество химической промышленности 67: 886–890.
  19. 19. Касаи С., Комагата О., Итокава К., Шоно Т., Нг Л.С. и др. (2014) Механизмы устойчивости к пиретроидам у комаров-переносчиков денге, Aedes aegypti : нечувствительность к целевым участкам, проникновение и метаболизм. PLoS Negl Trop Dis 8: e2948. пмид:24945250
  20. 20. Liu N, Scott JG (1996)Генетический анализ факторов, контролирующих повышенную активность цитохрома P450, CYP6D1, цитохрома b 5 , редуктазы P450 и монооксигеназы у домашних мух LPR, Musca domestica .Биохим Генет 34: 133–148. пмид:8734413
  21. 21. Maitra S, Dombrowski SM, Basu M, Raustol O, Waters LC, et al. (2000) Факторы третьей хромосомы влияют на уровень экспрессии Cyp6a2 и Cyp6a8 у Drosophila melanogaster . Ген 248: 147–156. пмид:10806360
  22. 22. Kalsi M, Palli SR (2017)Фактор транскрипции Cap n Collar регулирует множественные гены, кодирующие белки, участвующие в детоксикации инсектицидов у красного мучного жука, Tribolium castaneum .Insect Biochem Molec Biol 90: 43–52.
  23. 23. Kalsi M, Reddy Palli S (2017)Фактор транскрипции cap n Collar C регулирует множественные гены цитохрома P450, обеспечивающие адаптацию к аллелохимическим веществам растений картофеля и устойчивость к имидаклоприду у Leptinotarsa ​​decemlineata (Say). Насекомое Biochem Molec Biol 83: 1–12.
  24. 24. Kalsi M, Palli SR (2015) Факторы транскрипции, CncC и Maf, регулируют экспрессию генов CYP6BQ, ответственных за устойчивость к дельтаметрину, у Tribolium castaneum .Insect Biochem Molec Biol 65: 47–56.
  25. 25. Feyereisen R (2010) Членистоногие CYPomes иллюстрируют темп и режим эволюции P450. Biochemica et Biophysica Acta 1814.
  26. 26. Wilding CS, Weetman D, Steen K, Donnelly MJ (2009) Высокое, сгруппированное, нуклеотидное разнообразие в геноме Anopheles gambiae , выявленное с помощью секвенирования объединенных шаблонов: последствия для высокопроизводительных протоколов генотипирования. Геномика ВМС 10.
  27. 27. Скотт Дж.Г., Лю Н., Вен З., Смит Ф.Ф., Касаи С. и др.(1999) Цитохром P450 CYP6D1 комнатной мухи: 5 первичных фланкирующих последовательностей и сравнение аллелей. Ген 226: 347–353. пмид:9931509
  28. 28. Смит Дж. М., Хей Дж. (1974) Эффект автостопа благоприятного гена. Генетика Рез. 23: 23–35.
  29. 29. Каплан Н.Л., Хадсон Р.Р., Лэнгли С.Х. (1989) Новый взгляд на «эффект автостопа». Генетика 123: 887–899. пмид:2612899
  30. 30. Wiehe TH, Stephan W (1993) Анализ генетической модели автостопа и ее применение к данным полиморфизма ДНК Drosophila melanogaster .Молек Биол Эвол 10: 842–854. пмид:8355603
  31. 31. Van Leeuwen T, Dermauw W (2016)Молекулярная эволюция ксенобиотического метаболизма и устойчивости у клещей-хелицератов. Энн Рев Энтомол 61: 475–498.
  32. 32. Дурис В., Штайнбах Д., Пантелери Р., Ливадарас И., Пикетт Дж. А. и др. (2016) Мутация устойчивости, сохраняющаяся между насекомыми и клещами, раскрывает механизм действия инсектицида бензоилмочевины на биосинтез хитина. Proc Nat Acad Sci U S A 113: 14692–14697.
  33. 33.Ван Леувен Т., Демэхт П., Осборн Э.Дж., Дермау В., Гольке С. и др. (2012) Картирование массовой сегрегации популяции раскрывает мутации резистентности и механизм действия ингибитора синтеза хитина у членистоногих. Proc Natl Acad Sci U S A 109: 4407–4412. пмид:22393009
  34. 34. Ринкевич Ф.Д., Чжан Л., Хамм Р.Л., Брейди С.Г., Лаззаро Б.П. и соавт. (2006) Частоты аллелей устойчивости к пиретроидам Vssc1 и CYP6D1 у домашних мух с востока США.Насекомое Мол Биол 15: 157–167. пмид:16640726
  35. 35. Seifert J, Scott JG (2002) Аллель CYP6D1v1 связан с устойчивостью к пиретроидам у комнатной мухи, Musca domestica . Пестик Биохим Физиол 72: 40–44.
  36. 36. Куно Г. (2010) Ранняя история лабораторного разведения Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) с упором на происхождение и использование выбранных штаммов. J Med Entomol 47: 957–971. пмид:21175042
  37. 37.Смит Л.Б., Касаи С., Скотт Дж.Г. (2017)Мутации чувствительных к напряжению натриевых каналов S989P+V1016G в Aedes aegypti придают переменную устойчивость к пиретроидам, ДДТ и оксадиазинам. Pest Manag Sci 74: 737–745. пмид:235
  38. 38. Финни Д.Дж. (1971) Пробит-анализ. Кембридж, Великобритания: Издательство Кембриджского университета. 333 стр.
  39. 39. Raymond M (1985) Презентация программы Basic d’analyse log-probit pour micro-ordinateur. Cah ORSTROM, ser Ent med Parasitol 23: 117–121.
  40. 40. Abbott WS (1925) Метод расчета эффективности инсектицида. Дж. Экон Энтомол 18: 265–267.
  41. 41. Pfaffl MW (2001) Новая математическая модель для относительного количественного определения в ОТ-ПЦР в реальном времени. Исследование нуклеиновых кислот 29: e45–e45. пмид:11328886
  42. 42. Рюйтер Дж.М., Рамакерс С., Хугаарс В.М.Х., Карлен И., Баккер О. и др. (2009)Эффективность амплификации: связь исходного уровня и смещения в анализе количественных данных ПЦР.Нук кислоты Рез. 37: e45–e45.
  43. 43. Хардстоун М.С., Лейхтер К.А., Харрингтон Л.С., Касаи С., Томита Т. и др. (2007) Устойчивость к перметрину, опосредованная монооксигеназой цитохрома P450, придает ограниченную и личиночную специфическую перекрестную устойчивость южному домашнему комару, Culex pipiens quinquefasciatus . Pestic Biochem Physiol 89: 175–184.
  44. 44. Scott JG, Yoshimizu MH, Kasai S (2015)Устойчивость к пиретроидам у комаров Culex pipiens . Пестик Биохим Физиол 120: 68–76.пмид:25987223
  45. 45. Wen Z, Scott JG (1997) Перекрестная устойчивость к имидаклоприду штаммов немецких тараканов ( Blattella germanica ) и комнатной мухи ( Musca domestica ). Пестичская наука 49: 367–371.
  46. 46. Scott JG, Georghiou GP (1986) Механизмы, ответственные за высокий уровень устойчивости к перметрину у комнатной мухи. Пестическая наука 17: 195–206.
  47. 47. Касаи С., Скотт Дж.Г. (2001)Ген комнатной мухи, гомологичный протоонкогену цинкового пальца Gfi -1.Biochem Biophys Res Comm 283: 644–647. пмид:11341773
  48. 48. Скотт Дж.Г., Касаи С. (2004)Эволюционная пластичность устойчивости, опосредованной монооксигеназой. Пестик Биохим Физиол 78: 171–178.
  49. 49. Нене В., Вортман Дж. Р., Дэниел Лоусон Д., Брайан Хаас Б., Чиннаппа Кодира С. и др. (2007)Последовательность генома Aedes aegypti , основного вектора арбовируса. Наука 316: 1718–1723. пмид:17510324
  50. 50. Кроуфорд Дж. Э., Алвес Дж. М., Палмер В. Дж., Дэй Дж. П., Силла М. и др.(2017) Популяционная геномика показывает, что антропофильная популяция из комаров Aedes aegypti в Западной Африке недавно дала начало американским и азиатским популяциям этого основного переносчика болезни. BMC Biology 15: 16. pmid:28241828
  51. 51. Рашич Г., Филипович И., Уикс А.Р., Хоффманн А.А. (2014)Полногеномные SNP приводят к сильным сигналам географической структуры и моделей родства в основном векторе арбовируса, Aedes aegypti . BMC Genomics 15: 275. pmid: 24726019
  52. 52.Morlais I, Severson DW (2003) Внутривидовая изменчивость ДНК в ядерных генах комара Aedes aegypti . Насекомое Molec Biol 12: 631–639.
  53. 53. Li T, Liu L, Zhang L, Liu N (2014) Роль генов, связанных с рецептором, связанным с G-белком, в устойчивости комаров к инсектицидам, Culex quinquefasciatus . Научные отчеты 4: 6474.
  54. 54. Carino FA, Koener JF, Plapp FW Jr., Feyereisen R (1994)Конститутивная сверхэкспрессия гена цитохрома P450 CYP6A1 в штамме комнатной мухи с метаболической устойчивостью к инсектицидам.Insect Biochem Mol Biol 24: 411–418. пмид:8025560
  55. 55. Sun Y, Zou P, Yu X-Y, Chen D, Yo J и др. (2012) Функциональная характеристика гена аррестина на устойчивость к инсектицидам Culex pipiens pallens . Парсит Вект 5: 134.

Борьба коренных народов за остановку строительства последнего оставшегося участка трубопровода протяженностью в тысячу миль · The Badger Herald

Когда вы впервые прибудете в центр приема в Палисейде, одном из нескольких лагерей защитников воды, возникших в северной Миннесоте по маршруту нефтепровода 3-й линии кто-нибудь спросит, хотите ли вы быть зеленым, желтым или красным.

Если вы выбрали зеленый уровень, это означает, что вы не хотите, чтобы вас арестовали, и организаторы направят вас в места, куда вы не должны входить. Желтый уровень требует более решительных действий и несет в себе риск цитирования и ареста. Однако выбор красного уровня означает, что вы планируете и готовы к аресту.

Те, кто находится на красном уровне, обязуются продолжать свою часть прямых действий против трубопровода до тех пор, пока правоохранительные органы не заставят их остановиться.

Задержка, задержка, задержка

Активистка и старший преподаватель Колледжа Святого Бенедикта в Миннесоте Мелисса Баррелл дошла только до желтого уровня и прекрасно понимает последствия дальнейшего продвижения.

«В настоящее время более 200 человек арестованы в этих разных местах, связанных со строительством», — сказал Баррелл.

Прямое действие — это метод затягивания, который принимает форму ненасильственных протестов на строительных площадках, чтобы задержать строительство трубопровода и привлечь к этому как можно больше внимания средств массовой информации, сказал Баррелл.

По словам Баррелла, активисты приковали себя цепями к строительной технике, ползли и прятались внутри труб, пока правоохранительные органы не выгнали их. Она рассказала об одном случае, когда активистам удалось принести на строительную площадку два массивных пианино и целое утро музицировать.

Недавно коренные защитники воды из Коллектива Гиниу построили и молились внутри ваагиноганинга, традиционного сооружения Анисинаабе, которое они установили на строительной площадке, отложив строительство на несколько часов.

«Все это только для того, чтобы отсрочить строительство», — сказал Баррелл. «Чем больше шума приходится проходить правоохранительным органам, чтобы попытаться вытащить кого-то из трубы или снять кого-то с пианино, тем больше времени это занимает, а оборудование, очевидно, не может работать, пока это происходит. ”

Долгая история споров

В протестах против трубопроводов ископаемого топлива в Северной Америке нет ничего нового. Нефть была обнаружена в Канаде в 1850-х годах, и вскоре последовало строительство трубопроводов.Уже более века сеть поездов, трубопроводов и судов транспортирует сырую нефть из битуминозных песков канадской провинции Альберта на Средний Запад.

Из 2,85 млн баррелей нефти, экспортируемой Канадой в день, колоссальные 97% доставляются в США. Сегодня в Канаде насчитывается более 840 000 километров трубопроводов, но еще в 1970-х годах часто поступали предложения о расширении этой сети. против претензий коренных народов на землю и экологических проблем.

В последнее десятилетие, по мере роста озабоченности по поводу выбросов углерода, нефтепроводы также стали представлять осязаемое и символическое проявление изменения климата, став главной целью защитников окружающей среды.

После почти десятилетия споров защитникам окружающей среды и активистам коренных народов удалось добиться от администрации Байдена блокировки разрешения на строительство трубопровода Keystone XL. Однако борьба вокруг трубопровода Dakota Access продолжается.

Линия 3, принадлежащая и управляемая многонациональной энергетической корпорацией Enbridge, начинается в Альберте и проходит через Северную Дакоту и Миннесоту, а затем заканчивается в Верхнем, штат Висконсин. Из примерно 1000 миль трубопровода только 14 пролегают в штате Баджер.

Построенный в 1960 году трубопровод 3-й линии значительно устарел. Первоначально построенный для транспортировки 760 000 баррелей нефти в день, трубопровод подвергся коррозии до такой степени, что может поддерживать только половину этой пропускной способности. В перспективе это эквивалентно пятой части ежедневного экспорта нефти Канады в США. Замена линии 3 восстановит трубопровод до его исторической пропускной способности и уменьшит потребность в транспортировке сырой нефти по железной дороге, заявила представитель Enbridge Джули Келлнер в электронном письме.

Строительство замененного участка в Висконсине закончилось в 2017 году, а к декабрю 2020 года Энбридж завершил строительство участка в Северной Дакоте.Единственная незавершенная часть — это 337-мильный сегмент Миннесоты, строительство которого началось, когда Энбридж завершился в Северной Дакоте.

В настоящее время Энбридж пользуется поддержкой правительств банды озера Пиявка оджибве и племени Фон-дю-Лак из озера Верхнее Чиппева, двух племен, через территорию которых проходит существующий трубопровод.

«Энбридж продемонстрировал уважение племенного суверенитета. В результате переговоров с лидерами племен линия 3 была проложена за пределы племени озера Лич в резервации оджибве и через резервацию племени Фон-дю-Лак на озере Верхнем Чиппева», — говорится в заявлении Энбриджа.«И Leech Lake, и Fond du Lac, два племени, наиболее затронутые проектом, поддерживают замену линии 3 и неоднократно выступали и писали в поддержку разрешений на проект».

Член организации Oneida Nation of Wisconsin и редактор Indian Country Пол ДеМейн заявил, что в общинах коренных народов по-прежнему существует значительная оппозиция трубопроводам. С точки зрения ДеМейна, Enbridge купила поддержку, которой они пользуются, потратив большие средства на связи с общественностью.

«Они вызвали огромные потрясения внутри племенных политических структур, покупая людей и подкупая их, вкачивая деньги в людей и связи с общественностью, чтобы создать впечатление, что общественность поддерживает это, тогда как многие из нас считают, что это раздельное решение», — сказал ДеМейн.

Вода, земля и воздух

Институт экологических исследований Нельсона, доцент и эксперт по вопросам участия коренных народов в промышленной экспансии под руководством коренных народов Лия Горовиц сказала, что, хотя наше общество действительно нуждается в нефти в настоящий момент, чтобы выжить, опасности изменения климата требуют отказа от нее. По словам Горовица, решение не заменять трубопроводы, которые необходимо заменить, является способом создать этот переход.

Опасения по поводу изменения климата, разливов нефти и суверенитета коренных народов мобилизовали широкую коалицию против проекта, в которую входят экологические группы, такие как Sierra Club и Minnesota 350, а также организации, возглавляемые коренными народами, такие как Giniw Collective и Honor the Earth.

В феврале видный прогрессивный член палаты представителей Ильхан Омар, штат Миннесота, призвал администрацию президента Джо Байдена остановить проект. Даже Миннесотская комиссия по торговле вступила в бой, присоединившись к нескольким другим сторонам в судебном иске против Миннесотской комиссии по коммунальным предприятиям, которая одобрила разрешение на строительство трубопровода.

Директор отделения

Sierra Club в Висконсине Элизабет Уорд сказала, что углеродоемкий процесс добычи и добычи битуминозного песка значительно увеличивает углеродный след трубопровода.

Нефть битуминозных песков сильно отличается от обычной нефти. Союз обеспокоенных ученых, некоммерческая группа ученых, описывает его как смесь песка, глины, воды и битума — густое, богатое нефтью вещество с консистенцией патоки. Именно из этого битума делают бензин и другие нефтепродукты.

Согласно инфографике NPR, в то время как обычная добыча сырой нефти осуществляется путем бурения в земле и пропускания нефти на поверхность, битуминозные пески добываются либо открытым способом, либо паровой добычей.Ни один из процессов не является экологически чистым.

Добыча нефти из битуминозного песка требует вырубки участков бореального леса, чтобы получить доступ к богатому нефтью песку, сказал Уорд. По словам Уорда, бореальные леса Канады являются еще большим поглотителем углерода, чем Амазонка. Поглотители углерода — это естественные резервуары углерода, которые хранят его и не допускают попадания в атмосферу.

Когда залежи битуминозного песка находятся на глубине более 225 футов, компании добывают их, закачивая горячий пар в резерв. Этот процесс производит даже больше выбросов углерода, чем добыча открытым способом.

По данным Союза обеспокоенных ученых, галлон нефти из битуминозных песков производит на 15% больше выбросов углерода в течение своего срока службы, чем галлон обычной нефти. Именно по этим причинам Sierra Club характеризует нефть битуминозных песков как самую грязную нефть в мире.

В отчете о воздействии проекта на окружающую среду было установлено, что общий углеродный след в течение срока службы трубопровода составит 193 миллиона тонн выбросов углерода в год. Напротив, общий углеродный след всей Миннесоты составляет 154 тонны.

В своем заявлении Enbridge заявила, что постоянный спрос на сырую нефть приводит к выбросам из трубопровода. Заявление указывает на один из выводов PUC о том, что блокировка трубопровода не повлияет на спрос на сырую нефть, но приведет к более рискованным видам транспортировки.

«Документальные доказательства не подтверждают вывод о том, что отказ в справке о необходимости значительно снизит спрос на сырую нефть», — говорится в постановлении PUC. «Вместо этого доказательства устанавливают, что наиболее вероятным результатом отказа будет увеличение транспортировки сырой нефти по более опасным средствам, таким как железная дорога, и продолжение использования изнашивающейся существующей линии 3.

Тем не менее, транспортировка нефти по железной дороге обходится дороже: от 10 до 15 долларов за баррель по сравнению с 5 долларами за баррель по трубопроводу. Добыча нефти из битуминозных песков уже дороже, и более высокие цены могут снизить спрос.

Экологи также обеспокоены разливами нефти. Линия 3 уже была местом крупнейшего разлива нефти на суше в истории США. В марте 1991 года в результате прорыва 1,7 миллиона галлонов вылилось в замерзшую реку Прери в Гранд-Рапидс, штат Миннесота, всего в двух милях вверх по течению от реки Миссисипи.Если бы река Прери не замерзла, заражение распространилось бы до Мексиканского залива.

Недавно также были разливы. В 2010 году более 840 000 галлонов с линии 6 Enbridge вылилось в реку Каламазу в Мичигане.

«Нефть битуминозных песков действительно отличается от того, что мы называем традиционной нефтью. Из-за его природы, если его оставить со временем, он фактически опустится на дно», — сказал Уорд.

В то время как традиционная нефть всплывает и может быть очищена с помощью боновых заграждений, чтобы поднять ее с верхней части водоема, нефть от разлива Каламазу прилипла к руслу реки, как жевательная резинка, сказал Уорд.Агентство по охране окружающей среды решило, что очистка оставшихся 5% нефти, оставшейся в русле реки и прилегающих водно-болотных угодьях, нанесет больше экологического ущерба, чем предотвратит.

Загрязнение системы водоснабжения является проблемой для большей части Среднего Запада, поскольку трубопровод пересекает 227 озер и рек, включая реку Миссисипи и несколько рек вверх по течению от озера Верхнее, сказал Уорд.

Обращение в суд

Sierra Club участвует в двух основных судебных процессах против Line 3, сказал Уорд.В первом случае группа присоединилась к протесту Министерства торговли против разрешения PUC на утверждение трубопровода.

В исковом заявлении утверждается, что Enbridge не представила долгосрочный прогноз спроса, демонстрирующий потребность в новом трубопроводе, как того требует закон при подаче заявки на получение разрешения от PUC. Вместо предоставления прогноза спроса на сырую нефть со стороны нефтеперерабатывающих заводов Enbridge использовал прогноз предложения от производителей сырой нефти, утверждая, что увеличение добычи нефти представляет собой увеличение спроса на трубопроводное пространство для транспортировки нефти.

Во втором иске утверждается, что инженерный корпус армии не смог завершить надлежащую оценку воздействия на окружающую среду линии 3, когда выдавал Enbridge разрешение.

Центральным вопросом является вопрос о том, является ли линия 3 заменой трубопровода или полностью новым трубопроводом, поскольку маршрут новой линии 3 отклоняется к югу от первоначального примерно на 50 миль в одном сегменте. По словам ДеМейна, независимо от того, считается ли проект заменой, влекут за собой правовые последствия. Для новых трубопроводов требуется полное заявление о воздействии на окружающую среду, а для замены — нет.

Согласно Vox, администрация Байдена может остановить трубопровод и заставить Enbridge повторно подать заявку на получение разрешения, которое больше учитывает местную окружающую среду, права коренных народов на землю и изменение климата.

С нетерпением жду

Баррелл надеется, что активность против линии 3 привлечет внимание законодательного собрания штата Миннесота и администрации Байдена.

«Основная тактика заключается в задержке физического строительства, а затем использовании этой задержки для повышения осведомленности, а затем использовании этой осведомленности для возбуждения судебного иска против трубопровода», — сказал Баррелл.

ДеМейн считает, что активисты значительно увеличили расходы Enbridge. В феврале Enbridge была вынуждена добавить 1,1 миллиарда долларов к сметной стоимости проекта, в которую в общей сложности входило 200 миллионов долларов из-за нормативных и финансовых текущих расходов, вызванных задержками.

Тем не менее, в своем заявлении Enbridge заявила, что протесты мало повлияли на проект, который должен быть завершен к концу этого года по графику.

«Мы признаем право отдельных лиц и групп на законное и мирное выражение своих взглядов», — говорится в заявлении Келлнера.«Мы не терпим незаконных или опасных акций протеста любого рода».

Баррелл сказал, что для протестующих, которых цитируют и арестовывают, существуют фонды залога и фонды правовой защиты.

Хотя основная активность против трубопроводов Line 3 имела место в Миннесоте, в прошлом году губернатор штата Висконсин Тони Эверс подписал закон, квалифицирующий вторжение в собственность нефтяной компании как уголовное преступление. По данным Milwaukee Journal Sentinel, 20% импорта сырой нефти в США проходят через Висконсин.

Горовиц сказал, что подобные законопроекты вводятся в действие консервативными лоббистскими группами, такими как Американский совет по законодательным биржам, которые часто представляют интересы ископаемого топлива.

Подобные законопроекты предлагались 16 раз в Миннесоте, но так и не были реализованы, хотя шесть в настоящее время находятся на рассмотрении, сказал Горовиц.

По мере приближения конца учебного года Баррелл надеется, что выпускники присоединятся к ней в лагерях защитников воды на севере.

«Студенческая сила и сила учеников не имеют себе равных», — сказал Баррелл.«Это действительно мощно, когда этим занимается группа молодых людей. Если тебе 19 или 20, это не повод чувствовать, что ты чего-то не можешь».

Fisher Ranch — производитель фруктов и овощей премиум-класса

.

1917

Ранчо Фишер было основано Уэйном и Люсиль Фишер в 1917 году как скотоводческое ранчо Брахмы. Уэйн был одним из первых, кто представил породу брахма в Соединенных Штатах, и ему нравилось гастролировать по животноводческим выставкам по западным штатам.В какой-то момент Уэйн был зарегистрирован в Книге рекордов Гиннеса как владелец самого большого быка Брахмы в мире, огромного, но послушного парня, ласково известного как Сэм.

1920

Конец 1920-х. Во время Великой депрессии Уэйн сыграл важную роль в переговорах о беспроцентных займах от федерального правительства от имени Ирригационного округа Пало-Верде в рамках Нового курса. Затем округ распространил те же условия на местных фермеров в долине.Это помогло обновить местное сельскохозяйственное сообщество долины Пало-Верде и сделало Уэйна влиятельной фигурой в фермерском сообществе Пало-Верде.

1948

Сын Уэйна, Дана, вернулся в США после работы в Египте в компании Trans World Airlines. По возвращении в Блайт он расширил использование научных исследований в сельском хозяйстве. Затем он работал советником по сельскому хозяйству в Калифорнийском университете в Риверсайде.

1960-е

Дана основала Прогрессивную фермерскую организацию в Блайте, чтобы способствовать продвижению и распространению сельскохозяйственных исследований в долине Пало-Верде.

1972

Барт в третьем поколении вернулся в семейный бизнес после окончания Калифорнийского университета в Дэвисе.

1977

В рамках расширения производства свежих продуктов на ферме были построены склад для упаковки высококачественных дынь и холодильная камера для продуктов. Со временем потребность фермы в охлаждении расширится, и будут построены или приобретены дополнительные навесы и охладители.

1982

Барт и Дана открывают собственный бизнес по двусторонней радиосвязи.Сегодня Fisher Wireless Services превратилась в крупнейшего поставщика услуг двусторонней радиосвязи в Соединенных Штатах.

1999

Барт установил солнечную ферму и ряд генераторов, работающих на природном газе, для питания объектов Fisher Ranch. Это позволяет ранчо работать независимо от общественной электросети. Со временем Барт расширил технологию, чтобы завершить комбинированную систему тригенерации охлаждения, тепла и электроэнергии (CCHP).

2011

Четвертое поколение Эндрю присоединился к семейному бизнесу после окончания Университета Редлендс.

.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.